nghiên cứu thành phần hoá học của lá cây bàn tay ma - heliciopsis lobata (merr.) sleum họ proteaceae ở cao bằng

Những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ từ lâu đã được ứng dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được sử dụng để sản xuất thuốc

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG LAN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA LÁ CÂY BÀN TAY MA

HELICIOPSIS LOTABA (MERR.) SLEUM

HỌ PROTEACEAE Ở CAO BẰNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2010

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG LAN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA LÁ CÂY BÀN TAY MA

HELICIOPSIS LOTABA (MERR.) SLEUM

HỌ PROTEACEAE Ở CAO BẰNG

Chuyên ngành : Hóa học Hữu cơ

Mã số : 60 44 27

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH

Thái Nguyên - 2010

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Các hệ dung môi triển khai SKLM 27

Bảng 2.2: Khối lượng các cặn chiết thu được từ lá cây Bàn tay ma 30

Bảng 2.3: Phát hiện các nhóm chất trong lá cây Bàn tay ma 33

Bảng 2.4: Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết từ lá cây

Bảng 3.1 Số liệu phổ 13

C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của một số sterol trong lá cây Bàn tay ma 47 Bảng 3.2 Các số liệu phổ 1

H-NMR và 13C-NMR của HL-3:

3-Axetyl-6-oxo-spirostan trong lá cây Bàn tay ma 51 Bảng 3.3 Số liệu phổ 13

C-NMR (CDCl3, 125Mhz) và 1H-NMR của HL-4 trong lá cây Bàn tay ma và phổ của Taraxerol 59 Bảng 3.4 Số liệu phổ 13

C-NMR (CDCl3, 125Mhz) và 1H-NMR của chất HL-5 trong lá cây Bàn tay ma 67 Bảng 3.5 Số liệu phổ 13

C-NMR (CDCl3, 125Mhz) và 1H-NMR của chất EL-2 trong lá cây Bàn tay ma 75

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu lá cây Bàn tay ma

Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CC : Column Chromatography (Sắc ký cột)

TLC : Thin-layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

SKLM : Sắc ký lớp mỏng

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

MS : Mass Spectrometry (Phổ khối lượng)

LC-MS : Liqud chromatography –Mass Spectroscopy

EI-MS : Electron Impact Mass Spectrometry (Phổ khối va chạm electron)

(Bắn phá bằng chùm nguyên tử tốc độ cao) FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy

(Phổ hồng ngoại biến đổi Fourie)

NMR : Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

1

H-NMR : Proton Magnetic Resonance Spectrometry

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)

13

C-NMR : 13C-Nuclear Magnetic resonance

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13)

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

HSQC : Heteronuclear Single - Quantum Coherence

HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên được thừa hưởng nguồn thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loài dược liệu quí Ngay từ xa xưa, cha ông ta đã biết khai thác nguồn tài nguyên quý báu này để làm thực phẩm, thuốc chữa bệnh, vật liệu xây dựng và nhiên liệu phục vụ đời sống

Nền y dược học cổ truyền ở Việt Nam đã có lịch sử phát triển từ lâu đời Từ nhiều thế kỷ nay, những chế phẩm y học cổ truyền được coi như một kho tàng dược liệu quí báu Tiếp thu truyền thống quý báu của các thế hệ cha ông, ngày nay, Đảng và Nhà nước ta đã xây dựng một chiến lược phát triển lâu dài với nhiều chính sách ưu đãi tạo điều kiện cho ngành Y dược học

cổ truyền tiếp tục kế thừa, bảo tồn đồng thời phát huy hết những khả năng tiềm ẩn nhằm xây dựng nền Y dược học Việt Nam ngày càng khoa học hiện đại góp phần đắc lực trong công tác chăm sóc sức khoẻ của nhân dân

Những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ từ lâu đã được ứng dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được sử dụng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm… Chế phẩm thảo dược đều là hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau và trong hầu hết các trường hợp đều chưa xác định rõ hoạt chất của từng chất Vì vậy, những bài thuốc sử dụng thảo dược và bản thân các thảo dược là đối tượng cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về cấu trúc các chất có hoạt tính sinh học cao có trong cây cỏ Từ đó định hướng cho việc nghiên cứu, chiết xuất để tìm ra các loại thuốc mới hoặc bằng con đường tổng hợp, bán tổng hợp để tạo ra những chất có hoạt tính cao góp phần trong việc phòng

bệnh, chữa bệnh, giảm tỉ lệ tử vong, nâng cao tuổi thọ Vì vậy việc nghiên

cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có ý nghĩa khoa học và thực tiễn rất cao

Cây Bàn tay ma có tên khoa học Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum

thuộc họ Proteaceae, là cây thuốc dân gian của Việt Nam Nghiên cứu sơ bộ

về tác dụng dược học cho biết, lá cây Bàn tay ma có tác dụng kháng sinh

mạnh Theo kinh nghiệm dân gian, lá cây có tác dụng tiêu độc, hay được nhân dân sử dụng để chữa bệnh thấp khớp, nấu nước tắm cho phụ nữ sau khi sinh

đẻ cho khoẻ người và đỡ đau nhức, dùng để chữa lao hạch, chữa các bệnh lý

về gan, thận, đặc biệt trong những trường hợp viêm gan cấp và mãn tính [1, 2]

Cây Bàn tay ma đã được dùng trong dân gian từ lâu, nhưng nghiên cứu thành phần hóa học cây Bàn tay ma thì chưa thấy có tài liệu nào công bố Để góp phần làm rõ hơn về thành phần hóa học của cây Bàn tay ma, tạo thuận lợi cho việc dùng, sử dụng cây thuốc này làm dược liệu và nguyên liệu cho các

mục đích khác, tôi mạnh dạn chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hoá học của lá cây Bàn tay ma - Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum họ Proteaceae ở Cao Bằng” Đối tượng nghiên cứu là lá cây Bàn tay ma, cây mọc hoang, thu

hái quanh năm tại huyện Hòa An tỉnh Cao Bằng

Họ này được hầu như tất cả các nhà phân loại học công nhận Được thiết lập vững chắc trong phân loại học Linnaeus cổ điển, nó cũng được các

hệ thống phân loại dựa trên miêu tả theo nhánh như hệ thống APG và hệ thống APG II công nhận Trong các hệ thống này nó được đặt trong bộ Proteales, nhưng vị trí của bộ này lại không cố định

Proteaceae nói chung là các cây thân gỗ hay cây bụi, ngoại trừ một số loài thuộc chi Stirlingia là cây thân thảo Lá của chúng thường xanh với sự dao động mạnh về kích thước, hình dáng và mép lá

Proteaceae là họ chủ yếu ở Nam bán cầu, với các trung tâm đa dạng chính ở Australia và Nam Phi Nó cũng có tại miền trung châu Phi, Nam và Trung Mỹ, Ấn Độ, miền Đông và Đông nam châu Á, các đảo của châu Đại Dương Chỉ có 2 loài tại New Zealand, mặc dù chứng cứ phấn hoa hóa thạch cho thấy trước kia tại đây có nhiều loài hơn

Họ Proteaceae hiện tại được chia ra thành 5 phân họ, bao gồm: Bellendenoideae, Persoonioideae, Symphionematoideae, Proteoideae và Grevilleoideae

Có nhiều loài cây thuộc họ Proteaceae được sử dụng trong y học dân gian nhiều dân tộc, ở các nước Châu Phi, Châu Mỹ La tinh, Châu Á và Đông Nam Á Tại Chile và New Zealand, hai loài của chi Macadamia được trồng ở quy mô thương mại để lấy hạt ăn được Gevuina avellana (phỉ Chile) được

trồng để lấy hạt, hạt này cũng ăn được và được sử dụng trong công nghiệp dược phẩm để dưỡng da do các tính chất giữ ẩm của nó, như là thành phần của kem chống nắng Ở Chile có các loài Lomatia ferruginea, Lomatia hirsuta rất có giá trị vì chúng có thể tạo ra cảnh quan đẹp kỳ lạ kiểu nhiệt đới tại các khu vực có khí hậu ôn đới Chúng đã được du nhập vào Tây Âu và miền tây Hoa Kỳ Embothrium coccineum (cây lửa Chile hay Notro) có giá trị cảnh quan do nó có hoa màu đỏ thẫm, phát triển tốt trên Quốc đảo Anh và có thể thấy tại quần đảo Faroe ở vĩ độ 62° vĩ bắc Nhiều loài Proteaceae được trồng trong vườn ươm, như là thực vật hàng rào cũng là vì tán lá và hoa nổi bật của chúng Một vài loài có tầm quan trọng đối với ngành trồng hoa, đặc biệt một vài loài trong các chi Banksia và Protea Các loài khác, nhỏ hơn nhưng cũng được trồng tại một vài nơi trên thế giới là Telopea speciosissima (waratah), từ các dãy núi tại New South Wales, Australia

Một vài loài trong khí hậu ôn đới cũng được trồng ở quy mô địa phương tại Australia vì vẻ đẹp của chúng: Persoonia pinifolia (geebung lá thông) vì hoa vàng chói lọi và quả giống như quả nho Adenanthos sericeus (cây bụi lá quăn) được trồng vì lá mầu lòe loẹt và hoa nhỏ màu đỏ hay da cam của chúng Hicksbeachia pinnatifolia được trồng vì quả và lá của nó ăn được [6-7], [10], [12-14], [17- 23]

1.1.2 Những nghiên cứu hóa học thực vật họ Proteaceae

Cho đến nay đã có nhiều loài thực vật họ Proteaceae được nghiên cứu

thành phần hoá học, đã phân lập và nhận dạng được một số chất, thuộc các nhóm chất khác nhau phổ biến là ancaloit, glucosit, axit hữu cơ, flavonoit, phenol và steroit [9], [11], [16]

1.1.2.1- Các hợp chất ancaloit đƣợc phân lập từ họ Proteaceae

Trong số các chất đã phân lập được từ các loài thuộc họ Proteaceae thì

kiểu cấu trúc các hợp chất ancaloit được tìm thấy nhiều nhất Chủ yếu là cấu trúc ancaloit khung tropan [9], [4]

Mười bốn ancaloit đầu tiên được biết đến trong họ Proteaceae được

phân lập từ những búp non và hoa của loài Bellendena montanat tại

Tasmania bởi các tác giả IRC Bick, Gillard JW và H Leow [25] Trong đó, phổ biến là cấu trúc bellendine (1) và các dẫn xuất của nó bao gồm: 2,3-

dihydrobellendine (2); 5,11-dihydroisobellendine(3); isobellendine (5); 2,3- epidihydrobellendine (4); 3 α -acetoxy-6 β- hydroxytropane (6); 6 β -acetoxy-

3 α -isobutoxytropane (7); 3α-acetoxy-6β-isobutoxytropane (8); darlingine

(9); và 2,3-Dihydrodarlingine (10) [9]

O

CH3O

N

H 3 C

O

CH3O

H3C

CH3O

O

CH3O

O N

Từ thân và lá của Darlingina darlingiana; từ thân, lá và rễ của Darlingina ferruginea ở Queensland người ta cũng đã phân lập được 10 hợp

chất ancaloit [9] trong đó có 2 hợp chất có khung tropan là

5,11-Dihydrodarlingine (11); 10-Hydroxydarlingine (12) và 8 ancaloit có chứa dị vòng metylpirolidin đó là các chất: Darlingianine (13); Dihydrodarlingianine (14);Tetrahydrodarlingianine(15);Dehydrodarlingianine(16); Isodarlingianine

( 17 ); Dehydrodarlinine (18); Darlinine (19); Epidarlinine (20):

N

HO

3 N

Knightia là một chi nhỏ của họ Proteaceae Từ lá của loài Knightia deplanchei và loài Knightia strobilina ở New Caledonia, các tác giả Bick

IR, Gillard JW, HM Leow, J Pusset, Sévenet T, Mauri Lounasmaa, Peter M Wovkulich, Ernest Wenkert thuộc trường Đại học Tasmania, Hobart, Australia đã phân lập được 16 hợp chấtancaloit Tất cả các hợp chất này đều chứa khung tropan [9], [26],[31]

O O

CH 3

O O

O

O

CH 3 N

O O

CH3O HO

O

O

CH 3

N O

Protea rubropilosa, Protea lacticolor, Protea neriifolia, Protea eximia

là các loài thực vật thuộc chi Protea của họ Proteaceae [24] Từ các loài thực

vật này người ta đã phân lập được các hợp chất fenol glycosit Các dẫn xuất

này có đặc điểm chung là: thay thế nguyên tử Hidro của nhóm OH ở vị trí C1

của fenol bằng các gốc đường [9]

O

OH O

HO

OH OH O

HO

O

OH O

HO

OH OH O

;1-O-[(3-Hydroxy-3-HO

O

OH O

HO

OH OH O O

OH O

OH

OH HO

O O

O O HO

OH HO

OH O

O OH

O O

OH HO

alcohol;4-O-(6-O-O O

OH O

alcohol;1'-O-(4-glucopyranoside

1.1.2.3 Các hợp chất phenol

Các hợp chất phenol là loại hợp chất phổ biến được tìm thấy trong quá

trình phân lập các chất có trong hoa và quả của các loài Ardisia japonica và Protea roupelliae của chi Protea thuộc họ Proteaceae [9] Trong y học cổ truyền Trung Quốc, người ta sử dụng Ardisia japonica như một cây thuốc

quý và được xem là một trong 50 vị thuốc cơ bản [31]

1,3-Dimethoxy-2-methyl-5-(8-OH H

1.1.2.4 Các hợp chất axit béo mạch dài

Chi Grevillea là một chi tương đối lớn của họ Proteaceae Từ loài

Grevillea decora của chi này người ta phân lập và xác định được cấu trúc 5

hợp chất axit [19, 20], [9] đó là: (E) - 21-Hexacosenoic acid (53) ; Dihydroxy- cinnamic acid (54); (E)- 9-Hydroxy-21-hexacosenoic acid (55) ; (E)- 11-Hydroxy-21-hexacosenoic acid (56) ; 23-Octacosenoic acid (57) ; từ

2,5-chi Macadamia, một 2,5-chi thực vật có hoa của họ Proteaceae [28] người ta

cũng đã phân lập và xác đinh được cấu trúc của 2 axit khác là: Physetoleic

acid (58); 2-Hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl) acetic acid (59) [9]

CH

3

O HO

HO

OH O

hiện được β- sitosterol trong lá cây Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HÓA HỌC THỰC VẬT HELICIOPSIS LOTABA

Lần đầu tiên tại Trung Quốc, từ lá của loài Heliciopsis lobata (Merr.)

Sleum, các tác giả: Li Dan; Liu Ming-Sheng; Li Zhan-Lin; Khang Sinh-Li; HuaHui-Ming dùng phương phápsắc ký cột trên silica gel, trung tính và oxit

nhôm Sephadex LH -20, đã phân lập được 7 hợp chất và cấu trúc của 7 chất

này đã được xác định bởi dữ liệu quang phổ và hóa lý.Bảy hợp chất đó được

xác định là: myricetin (62); myricitrin (63);

syringetin-3-O-beta-D-glucopyranoside (64); hydroquinone (65); D-1-O-methyl-Myo -inositol (66);

medioresinol (67) và beta-sitosterol (68) [11]

OH

O OH

(62): Myricetin hay (3,5,7,3’, 4’, 5’- hexahidroxyflavon)

Myricetin là một flavonol tự nhiên, một flavonoid có nhiều trong trái

cây, rau, thảo mộc, cũng như các thực vật khác Nó là một trong những hợp

chất phenolic có trong rượu vang đỏ

Myricetin có các tính chất chống oxy hóa Trong nghiên cứu in vitro

cho thấy rằng myricetin ở nồng độ cao có thể thay đổi cholesterol LDL như

vậy làm cho sự hấp thu bởi các tế bào máu trắng là tăng lên Một nghiên cứu

quan trọng khác ở Phần Lan cho thấy cao myricetin có khả năng làm giảm tế

bào ung thư tuyến tiền liệt [27]

OH HO

O

OH HO

HO

(65) Hydroquinone (66): D-1-O-methyl-myo-inositol

O

O HO

OH

CH3

OH O

O

OH O O

OH

OH OH

O OH

(64): 5,7,4’-trihidroxy-3’,5’- dimethoxy -3-O-β-glucopyrannozyl flavon

O O

OCH3

OH

OCH3

OCH3OH

H

(67): Medioresinol

Tại khoa Hóa Dược tự nhiên trường Đại học Dược Nam Kinh, Trung

Quốc các tác giả Mingsheng Liu, Lingyi Kong, W.F Fong, Quanquan He,

Dejun Jin và Xiaolin Shen đã phân lập được 3 hợp chất phenolic glycosit:

6'-E-(2 "-methyl-butenoyl) arbutin ( 69); 6'-[(E) -4''-Hydroxycinnamoyl] arbutin

(70); 6'-[(E) -3'', 4''-Dihydroxycinnamoyl] arbutin (71) từ lá của Heliciopsis

lobata (Merr.) Sleum, cấu trúc của nó đã được làm sáng tỏ bằng các phương

pháp phân tích quang phổ [16]

O

OH OH

OH

O C

OH

(69): 6'-[(E) -2''-methyl -butenoyl] arbutin

OH OH

OH

O C

OH

O C

OH

O

OH OH

(71): 6'-[(E) -3'', 4''-Dihydroxycinnamoyl] arbutin

1.2.1- Những nghiên cứu về cây Heliciopsis lotaba (Merr.) Sleum trong nước

Cây Bàn tay ma Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum là loài thực vật có ở

Việt Nam, dân gian hay dùng lá cây này để chữa một số bệnh Song cho đến nay chưa thấy có tài liệu nào công bố về thành phần hoá học và tác dụng dược

lý của cây này

1.2.2 - Cây Bàn tay ma- Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum

1.2.2.1 Đặc điểm thực vật học – phân bố [1]

Cây Bàn tay ma có tên khoa học là Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum, thuộc họ Chẹo thui - Proteaceae Ngoài ra cây còn có tên gọi khác theo tiếng

địa phương của người dân tộc Tày là cây Hang quang (đuôi nai )

Cây mọc trong rừng núi ở Bắc Kạn, Vĩnh Phúc, Ninh Bình, Lạng Sơn, Quảng Ninh Trên thế giới cây được phân bố nhiều ở vùng núi Vân Nam (Trung Quốc)…

1.2.2.2 Đăc điểm sinh thái

+ Dạng cây : Cây gỗ nhỏ, cao tới 7-8 m hay hơn Cành nhỏ và cuống lá

non, thường có lông nhung

+ Lá : Cuống lá dài, lá có thể xẻ sâu lông chim gần hình bầu dục, xẻ

sâu 3 – 9 thuỳ dạng trứng, lá dài từ 40 – 80 cm, rộng từ 20 – 40 cm, cứng dài, mép lá nguyên hay có gợn sóng, nhiều người tưởng tượng như bàn tay ma quỷ nên gọi tên là “Mừ phi” (Bàn tay ma), có khi lá dài rủ xuống nên người Tày còn gọi là Hang Quang (đuôi nai) [2]

+ Hoa : Hoa đơn tính, hay hình bầu dục, gần như không cuống

+ Quả : Quả hình trứng hay hình bầu dục, dẹt, không có lông, khi chín

có màu nâu đen Hạt đơn độc, hình bầu dục Ra hoa tháng sáu

Ảnh 1.1: Cây Bàn tay ma

Ảnh 1.2: Lá cây Bàn tay ma

1.2.2.3 Những ứng dụng của cây Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum

Cây Bàn tay ma Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum có nhiều tác dụng

trong việc điều trị bệnh Theo kinh nghệm của dân gian, vị thuốc có tác dụng lợi tiểu, chống viêm, dùng trong các trường hợp viêm gan siêu vi trùng, vàng

da, mắt vàng, đái ít, nước tiểu sẫm màu, ăn kém…Có thể dùng trong trường hợp viêm thận: phù mặt, nước tiểu đỏ… Ðồng bào người Dao dùng cây chữa bệnh thấp khớp, chữa bệnh lao hạch, nấu nước tắm cho phụ nữ sau khi sinh đẻ cho khoẻ người và chống đau nhức [1]

Cách dùng và liều lượng: Thường dùng để sắc uống, có thể dùng đơn độc hoặc phối hợp với các vị thuốc khác Bàn tay ma là vị thuốc chính có mặt trong hầu hết các các đơn thuốc chữa bệnh về gan của các lương y nổi tiếng của tỉnh Cao Bằng, Bắc Kạn [2] Liều dùng từ 20 – 50 gam khô (thường vị thuốc không gây ra một tác dụng phụ khó chịu nào) Dưới đây là một số bài

thuốc dân gian, trong đó Bàn tay ma được xếp là đầu vị:

+ Chữa viêm gan siêu vi trùng, vàng da, mắt vàng, đái ít, nước tiểu sẫm màu, ăn kém :

- Rễ cây bàn tay ma : 20 gam - Thổ phục linh: 10 gam

- Thau chắc khe ( Mộc thông): 20 gam - Lá cây nhãn: 10 gam

- Bồ khai đỏ: 10 gam

Cách sử dụng: Sắc uống, ngày một thang, 10 -15 ngày một liệu trình

+ Bài thuốc chữa bệnh xơ gan cổ trướng (Đặc biệt là xơ gan do rượu, bụng

to, mắt vàng nhẹ, không ăn được, đái ít, chức năng thận suy giảm)

- Rễ cây bàn tay ma: 20 gam - Thạch xương bồ : 10 gam

- Rễ chua ngút : 10 gam - Cây chỉ thiên: 10 gam

- Rễ chua me : 10 gam - Bồng bồng rường : 10 gam

- Long nha thảo : 20 gam - Thổ phục linh: 10 gam

- Rễ dâu : 10 gam

+ Bài thuốc chữa viêm gan virus

- Rễ thân cành cây Bàn tay ma thái lát Lấy 100 – 200 gam sắc nước uống thay nước hàng ngày

- Bàn tay ma: 100 gam, vỏ xoan hồi: 100 gam Sắc nước uống thay nước hàng ngày

+ Bài thuốc chữa bệnh Gut

- Lấy 200 gam bàn tay ma sắc nước uống thay nước hàng ngày Uống 1 đến 2 tháng liền Có thể thêm vào đó tầm gửi cây Xau xau hiệu quả càng cao

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

Cây Bàn tay ma - Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum có nhiều tác dụng

trong việc điều trị bệnh Theo kinh nghiệm của dân gian, vị thuốc có tác dụng lợi tiểu, chống viêm, dùng trong các trường hợp viêm gan siêu vi trùng, vàng

da, mắt vàng, đái ìt, nước tiểu sẫm màu, ăn kém…Có thể dùng trong trường hợp viêm thận: phù mặt, nước tiểu đỏ, mẩn ngứa, mề đay, dị ứng Tuy nhiên,

về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây này cho đến nay chưa có kết quả nghiên cứu nào được công bố

Nhiệm vụ của luận văn là phân lập và xác định cấu trúc hoá học của

các chất phân lập được trong lá cây Bàn tay ma - Heliciopsis lobata (Merr.)

Sleum thu hái tại huyện Hòa An tỉnh Cao Bằng

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu.

Nguyên liệu để nghiên cứu là lá cây Bàn tay ma Mẫu cây tươi được thu hái vào tháng 11 năm 2009 tại huyện Hòa An tỉnh Cao Bằng

Mẫu cây dùng để nghiên cứu hoá thực vật đã được TS Lê Ngọc Công (Chủ nhiệm khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp,Trường Đại học Sư phạm

Thái Nguyên) giám định tên khoa học là Heliciopsis lobata (Merr.)Sleum họ

Proteaceae Ngoài ra, cây còn có tên gọi theo tiếng địa phương của người dân tộc Tày là cây Hang quang (đuôi nai)

Bộ phận mẫu được thái nhỏ đem sấy ở nhiệt độ 1100C trong 15 phút để diệt men, sau đó hong khô ở nơi thoáng mát hoặc sấy ở nhiệt độ 500

C - 60 0C tới khi khô hoàn toàn Mẫu khô được nghiền nhỏ, cho vào bính ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng nhiều lần cho đến khi dung dịch hầu như hoàn toàn mất màu

Sau khi cất loại dung môi, căn cô được dưới dạng xiro thêm nước vào

đến 0,5 lìt sau đó chiết lần lượt bằng dung môi có độ phân cực tăng dần: hexan, etyl axetat, n- butanol

Các dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 rồi cất kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 500

C dưới áp suất thấp Thu được 4 loại cặn tương ứng n –hexan, etylaxetat, butanol và metanol Các cặn thô được phân chia bằng sắc kì cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết tinh phân đoạn và kết

tinh lại trong hệ dung môi thìch hợp để thu được các chất sạch (Sơ đồ 2.1)

Những phần cặn chiết cho phản ứng dương tình với các loại biotest được định hướng là những đối tượng ưu tiên để phân lập các hoạt chất của mẫu cây đem nghiên cứu

Quá trính nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm

2.1.2 Thử hoạt tính sinh học

Thử hoạt tình vi sinh vật kiểm định đối với các dịch chiết thô được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên, từ kết quả thử hoạt tình sẽ xác định bản chất hoá học của hoạt chất

2.1.3 Phương pháp phân tích, phân lập các hợp chất từ dịch chiết

Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây bàn tay ma chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc

kí, hòa tan và kết tinh lại trong dung môi thìch hợp Các phương pháp gồm:

- Sắc kì lớp mỏng (SKLM)

- Sắc kì cột silicagen, thường dùng silicagen Merck 63- 200nm

- Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại

2.1.4 Phương pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất

Các chất phân lập ở dạng tinh khiết được xác định những hằng số vật

lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H- NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối lượng (MS) và các phổ phân giải cao Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng

2.2 DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Dụng cụ, hoá chất

Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế phải

sử dụng loại tinh khiết phân tìch (PA)

Sắc kì lớp mỏng dùng bản mỏng đế nhôm DC – Alufolien Kiesegel 60

F254 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần

có trong các dich chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được

Bảng 2.1: Các hệ dung môi triển khai SKLM

STT Hệ dung môi (Tỉ lệ thể tìch) Kì hiệu

C

Các giá trị Rf trong hệ dung mơi triển khai cĩ biểu thức:

Các giá trị Rf trong hệ dung mơi triển khai biểu thị là Rf A (B, C,…) x 100 Sắc ký cột sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 đến 0,200 mm)

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Nhiệt độ nĩng chảy đo trên kình hiển vi Boëtus hoặc trên máy Electrothermal IA-9200

- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hố học - Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam) dưới dạng viên nén KBr

- Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP (Viện Hố học –Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam) theo kiểu va chạm electron (EI) ở 70eV, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dị MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dị DAD

- Phổ 1H và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn nội TMS, dung mơi CDCl3, CD3OD, DMSO-d6

2.3 CÁC DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY BÀN TAY MA- HELICIOPSIS

LOTABA (MERR.)SLEUM

2.3.1 Thu nhận các dịch chiết

Mẫu cây tươi sau khi thu hái, rửa sạch được sấy khơ đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phịng cho đến khi hầu như hết màu Dịch chiết được cất loại dung mơi ở áp suất giảm Cặn dịch chiết metanol sau khi thêm nước được chiết lần lượt với n-hexan, etylaxetat, n-butanol và thu

Chiều dài di chuyển của chất thử

Chiều dài di chuyển của dung mơi

Rf =

được các cặn chiết tương ứng, làm khan bằng Na2SO4 Việc thu nhận các dịch

chiết từ lá cây Bàn tay ma - Heliciopsis lobata (Merr.)Sleum tóm tắt trong sơ

đồ 2.1

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu lá cây Bàn tay ma

- Heliciopsis lobata (Merr.)Sleum

Các phân đoạn dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc rồi cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, cặn được sấy khô và cân đến khối lượng

không đổi Như vậy, từ lá cây Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum, sẽ có 4 loại

cặn chiết được ký hiệu là:

HL EL BL ML

Trong đó:

HL: Cặn chiết n-Hexan của lá Heliciopsis lobata (Merr.)Sleum

EL : Cặn chiết EtOAc của lá cây Heliciopsis lobata (Merr.)Sleum BL: Cặn chiết BuOH của lá cây Heliciopsis lobata (Merr.)Sleum

ML : Cặn chiết MeOH của lá cây Heliciopsis lobata (Merr.)Sleum

Kết quả thu nhận các dịch chiết từ lá cây Bàn tay ma được nêu trong bảng 2.2

Bảng 2.2 : Khối lƣợng các cặn chiết thu đƣợc từ lá cây Bàn tay ma

- Heliciopsis lobata (Merr.)Sleum

Mẫu thu

vào tháng

11 / 2009

Khối lượng mẫu khô (g)

Khối lượng cặn chiết thu được (g) n-hexan EtOAc BuOH MeOH

1 giọt H2SO4 đậm đặc) Lấy 1ml dịch cloroform rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong một thời gian là phản ứng dương tình

2.3.2.2 Phát hiện các ancaloit

Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy

lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit

Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là phản ứng dương tình

Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorf, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tình

Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính

2.3.2.3 Phát hiện các flavonoit

Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ìt bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bính cách thuỷ vài phút Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tình với các flavonoit

2.3.2.4 Phát hiện các cumarin

Dịch để thử định tình được chuẩn bị như mục 2.3.2.1 Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi mỗi ống cho thêm 4ml nước cất Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm

có thể xem là phản ứng dương tình, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong mất màu vàng xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tình

Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, sẽ là dương tình cho cumarin

2.3.2.5 Định tính các glycozit tim

Chuẩn bị dịch thử định tình cũng làm như mục 2.3.2.1

+ Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tình với vòng butenolid

+ Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch

Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5%

Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%

Cách tiến hành:

Lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tình với các glucosit tim

2.3.2.6 Định tính các saponin

Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1 lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho

2ml dịch thử Ống 1 cho 1ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tình

Trên cơ sở dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất

có hoạt tình sinh lý cao trong thực vật được tiến hành theo phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc [3], thu được kết quả phân tìch định tình các

nhóm chất trong lá cây Bàn tay ma - Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum được

nêu trong bảng 2.3

Bảng 2.3: Phát hiện các nhóm chất trong lá cây Bàn tay ma

-Heliciopsis lobata (Merr.)Sleum

STT Nhóm chất Thuốc thử đặc hiệu Hiện tƣợng

Kết quả

1 Đường khử Felinh Cho kết tủa màu đỏ gạch ++

2 Ancaloit Dragendorf Màu vàng da cam +

3 Steroit Liberman-Bourchard Màu xanh vàng ++

4 Flavonoit Xianidin Từ hồng đến đỏ ++

6 Cumarin Axit và kiềm Kết tủa bông ++

7 Glycozit tim Kelle-Kiliani Không có hiện tượng gí -

8 Saponin Tạo bọt Bọt bền trong axit ++

Ghi chú : Dấu (+) : Phản ứng dương tình

- Thử hoạt tình vi sinh vật kiểm định

+ Thử định tình theo phương pháp khuyếch tán trên thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn

+ Các chủng vi sinh vật gồm đại diện các nhóm:

* Vi khuẩn Gr (-) Escherichia coli

* Vi khuẩn: Streptococcus pyogenes

* Vi khuẩn: Salmonella spp

* Vi khuẩn: Shigella spp

* Vi khuẩn Gr (+) Staphylococcus auresu

Bảng 2.4 : Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết

từ lá cây Bàn tay ma - Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum

Nhận xét: Các mẫu thử đều có tác dụng kháng các chủng vi sinh vật trên

Kết quả thực nghiệm thu được xem hình 2.1

Hình 2.1: Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm)

theo phương pháp khuyếch tán trên thạch

: