Nghiên cứu thành phần hoá học hướng tác dụng chống oxy hóa của lá cà dăm mitragyna speciosa (korth ) havil

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH QUÁCH HỒ XUÂN HỒNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ CÀ DĂM Mitragyna speciosa (Korth.) Havil LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh, năm 2020 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH QUÁCH HỒ XUÂN HỒNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ CÀ DĂM Mitragyna speciosa (Korth.) Havil LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Ngành: Dược liệu Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: TS VÕ VĂN LẸO TP Hồ Chí Minh, năm 2020 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Qch Hồ Xn Hồng iii TĨM TẮT Luận văn thạc sĩ – Khóa 2017-2020 Ngành: Dược liệu - Dược cổ truyền – Mã số: 8720206 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ CÀ DĂM Mitragyna speciosa (Korth.) Havil Quách Hồ Xuân Hồng Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Văn Lẹo Mở đầu đặt vấn đề Cà dăm loài mọc phổ biến nước Đông Nam Á mọc hoang khắp đất nước ta Trên giới, Cà dăm nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu chứng minh có tác dụng giảm đau, kháng viêm, chống trầm cảm, trị tiêu chảy, cao huyết áp, ho, tiểu đường Tại Việt Nam, cơng trình nghiên cứu lồi cịn ít, lý thực đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa Cà dăm (Mytragina speciosa (Korth.) Havil.)” Đối tượng Lá Cà dăm thu hái tỉnh Bến Tre vào tháng 01/2018 Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn chất phân lập mơ hình DPPH Sử dụng phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng, sắc ký cột pha thuận, sắc ký rây phân tử phương pháp tinh chế khác để phân lập hợp chất tinh khiết từ phân đoạn Xác định cấu trúc chất phân lập phương pháp phổ học (MS, NMR) Kết bàn luận Ở nồng độ 50 µg/ml, cao có hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự cao EtOAc (87,6%) > cao n-hexan (47,7%) > cao nước (44,9%) > cao CHCl3 (27,9%) Vì cao EtOAc chọn để nghiên cứu hóa học iv Bột dược liệu (9,9 kg) chiết ngấm kiệt với cồn 80%, cơ, loại clorophyll, pha lỗng với nước chiết phân bố lỏng-lỏng, loại dung môi thu cao cloroform (70 g), cao ethyl acetat (131 g) cao nước (90 g) Từ 70 g cao cloroform, qua phân lập sắc ký cột với silica gel thu hỗn hợp alkaloid gồm mitraphyllin đồng phân mitraphyllin (77 mg) Từ 131 g cao ethyl acetat qua trình phân lập thu hợp chất 4,4’-bi[catechol] (61 mg) acid protocatechuic (68 mg) Từ 90 g cao nước thu hợp chất daucosterol (62 mg) IC50 chất phân lập giảm dần theo thứ tự: 4,4’-bi[catechol] (IC50 = 11,9 M) > acid protocatechuic (IC50 = 15,0 M) > acid ascorbic (IC50 = 39,8 M) Kết luận Đề tài phân lập 4,4’-bi[catechol], protocatechuic (từ cao EtOAc), daucosterol (từ cao nước) hỗn hợp gồm mitraphyllin đồng phân mitraphyllin Trong số này, 4,4’-bi[catechol] acid protocatechuic có hoạt tính chống oxy hóa mạnh vitamin C Các chất phân lập dùng phân tích định tính, định lượng thử nghiệm sinh học tương lai v ABSTRACT Master’s thesis – Academic course: 2017 – 2020 Speciality: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy Speciality code: 8720206 BIOACTIVITY-GUIDED ISOLATION OF ANTIOXIDANT CONSTITUENTS FROM THE LEAVES OF MITRAGYNA SPECIOSA (Korth.) Havil Quach Ho Xuan Hong Supervisors: Dr Vo Van Leo Introduction Mitragyna speciosa (Korth.) Havil is a common species in many Asean countries In Vietnam, it grows in several regions from the north to the south A lot of researches on M speciosa showed that M speciosa extracts and/or its compounds have analgesic, antiinflammatory, anti-depressant, anti-diarrheal, anti-hypertension, cough-suppressant and anti-diabetics effects In Vietnam, the researches on Mitragyna speciosa is still sparse, so we carried out the study to examine its chemical components and bioactivities Materials Leaves of M speciosa were collected in Bến Tre province in January, 2018 Methods The antioxidant activity extracts, fractions and isolated compounds is tested by in-vitro DPPH assay Percolation, liquid-liquid distribution, column chromatography and other purification methods are used for extraction and isolation Structure determination was based on UV, MS and NMR spectrometric methods Results and discussion Screening to choose the highest antioxidant fraction: at the concentration of 50 μg/ml, the antioxidant activities of fractions decrease in order: ethyl acetate fraction (87,6%), n-hexan fraction (47,7%), water fraction (44,9%) and chloroform fraction (27,9%) Dried aerial parts of M.speciosa (9,9 kg) was extracted with 80% ethanol, solvent was removed by evaporating under reduced pressure to give the ethanol extract The extract was diluted with water and distributed into fractions: chloroform (10 g), ethyl acetate (131 g) and water fraction (90 g) vi From chloroform fraction, mixture of two compounds including mitraphylline and its stereoisomer (77 mg) was isolated From ethyl acetate fraction, 4,4’-bi[catechol] (61 mg) and protocatechuic acid (68 mg) were collected From water fraction, daucosterol (62 mg) was isolated IC50 values of substances isolated and extracts comparing with ascorbic acid were as follows: 4,4’-bi[catechol] (IC50 = 11,9 M) > protocatechuic acid (IC50 = 15,0 M) > ascorbic acid (IC50 = 39,8 M) Conclutions In the study, compounds including 4,4’-bi[catechol], protocatechuic acid, daucosterol and mixture of mitraphylline and its stereoisomer were isolated Among them, 4,4’-bi[catechol] and protocatechuic acid have the strongest activity on the DPPH assay The compounds isolated can be used in qualitative and quantitative determination or in biotest in the future vii MỤC LỤC MỤC LỤC vii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU THỰC VẬT HỌC Vị trí phân loại Đặc điểm loài Mitragyna speciosa [2] THÀNH PHẦN HÓA HỌC Thành phần hóa học số loài thuộc chi Mitragyna Thành phần hóa học lồi Mitragyna speciosa 13 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA LOÀI MITRAGYNA SPECIOSA 20 Tác dụng giảm đau 20 Ảnh hưởng đến nồng độ amin máu 20 Tác dụng hành vi nhận thức 20 Tác dụng thần kinh ngoại biên 21 Hội chứng ngưng thuốc, lệ thuộc thuốc, dung nạp thuốc dung nạp chéo 21 Tác dụng giấc ngủ 21 Tác dụng đường ruột 22 Tác dụng trơn ống dẫn tinh 22 Tác dụng trơn tử cung bàng quang 22 Tác dụng phản ứng viêm 22 Tác dụng tim mạch 22 Tác dụng chống ho 23 Tác dụng hạ đường huyết 23 Tác dụng tiết acid dày 23 CÔNG DỤNG 23 CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA 24 Thử nghiệm đánh giá khả đánh bắt gốc Superoxyd O2•– 24 viii Thử nghiệm sử dụng TBA – đo lượng MDA 25 Thử nghiệm sử dụng DPPH 25 Thử nghiệm sử dụng β – caroten 26 Thử nghiệm sử dụng khả kết hợp với ion sắt II 26 Thử nghiệm đánh giá khả khử ion sắt III (Phương pháp FRAP) 27 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 28 Nguyên liệu 28 Dung mơi hóa chất 28 Trang thiết bị nghiên cứu 28 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 Khảo sát thực vật học 29 Thử tinh khiết 29 Phân tích sơ thành phần hoá thực vật 29 Khảo sát dung môi chiết 29 Chiết xuất cao toàn phần 30 Tách phân đoạn 30 Phân lập chất tinh khiết 30 Tinh khiết hoá 30 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 30 Xác định cấu trúc chất phân lập 30 Thử tác dụng chống oxy hố mơ hình DPPH 31 Xác định khả chống oxy hóa chất tinh khiết 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC 35 Đặc điểm hình thái 35 Đặc điểm vi phẫu 35 Soi bột 38 THỬ TINH KHIẾT 38 HÀM LƯỢNG CHẤT CHIẾT ĐƯỢC 39 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 39 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 39 ix Xác định HTCO cao phân đoạn dịch chiết M.speciosa 40 Chiết xuất tách phân đoạn 43 Phân lập 44 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 47 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 50 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa SKLM 58 Xác định IC50 chất tinh khiết phương pháp DPPH 58 CHƯƠNG BÀN LUẬN 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC 71 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 82 PL-16 Phổ 13C-CPD (DMSO-d6, 125 MHz) vùng 55-145 ppm MS3 PL-17 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) MS3 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 83 PL-18 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) vùng 0,6-2,4 ppm MS3 PL-19 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) vùng 2,8-5,4 ppm MS3 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 84 PL-20 Phổ HSQC (DMSO-d6, 125/500 MHz) MS3 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 85 PL-21 Phổ HMBC (DMSO-d6, 125/500 MHz) MS3 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 86 PL-22 Phổ 13C-CPD (DMSO-d6, 125 MHz) MS5 PL-23 Phổ 13C-CPD (DMSO-d6, 125 MHz) vùng 12-78 ppm MS5 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 87 PL-24 Phổ 13C-CPD (DMSO-d6, 125 MHz) vùng 106-180 ppm MS5 PL-25 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) MS5 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 88 PL-26 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) vùng 1,1-2,5 ppm MS5 PL-27 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) vùng 3,2-4,4 ppm MS5 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 89 PL-28 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) vùng 6,80-8,25 ppm MS5 PL-29 Phổ HSQC (DMSO-d6, 125/500 MHz) MS5 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 90 PL-30 Phổ HMBC (DMSO-d6, 125/500 MHz) MS5 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 91 PL-30 Phổ HMBC (DMSO-d6, 125/500 MHz) vùng δH 6,8-8,2, δC 30-80 của MS5 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 92 PL-31 Phổ HMBC (DMSO-d6, 125/500 MHz) vùng δH 6,8-8,2, δC 105-170 của MS5 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 93 PL-32 Phổ HMBC (DMSO-d6, 125/500 MHz) vùng δH 2,0-4,5, δC 105-185 của MS5 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 94 PL-33 Phổ HMBC (DMSO-d6, 125/500 MHz) vùng δH 1,0-4,5, δC 10-80 của MS5 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 95 PL-34 Phổ 1H-1H COSY (DMSO-d6, 500 MHz) MS5 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 96 PL-35 Phổ 1H-1H COSY (DMSO-d6, 500 MHz) vùng 6,8-7,5 ppm MS5 PL-36 Phổ 1H-1H COSY (DMSO-d6, 500 MHz) vùng 1,0-4,5 ppm MS5 ... TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH QUÁCH HỒ XUÂN HỒNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ CÀ DĂM Mitragyna speciosa (Korth. ) Havil LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Ngành:... văn thạc sĩ – Khóa 2017-2020 Ngành: Dược liệu - Dược cổ truyền – Mã số: 8720206 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HỐ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA CỦA LÁ CÀ DĂM Mitragyna speciosa (Korth. ) Havil Quách Hồ... hướng tác dụng chống oxy hóa Cà dăm (Mytragina speciosa (Korth. ) Havil .)? ?? Đối tượng Lá Cà dăm thu hái tỉnh Bến Tre vào tháng 01/2018 Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa cao