Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen nelumbo nucifera

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN/ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOIDVÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ SEN

NELUMBO NUCIFERA

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌCChuyên ngành: CÔNG NGHÊ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Ngọc Hồng

Th.S: Nguyễn Thị Thu HươngSinh viên thực hiện : Trần Thị Kim Ngân

MSSV: 1151110218 Lớp: 11DSH04

TP Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan: Đồ án này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân,được thực hiện dưới sự đồng hướng dẫn khoa học của Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồngvà Thạc sĩ Nguyễn Thị Thu Hương.

Các số liệu, những kết luận được trình bày trong đồ án này hoàn toàn trungthực và chưa từng được công bố dưới bất cứ hình thức nào.

Em xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mìnhSinh viên

Trần Thị Kim Ngân

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Ngọc Hồng vàTh.S Nguyễn Thị Thu Hương, là giáo viên đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, tạo mọi điềukiện thuận lợi để tôi hoàn thành đồ án này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô đã giảng dạy tại khoa Công nghệ sinh học– Thực phẩm – Môi trường đã truyền đạt những kiến thức quý cho tôi trong suốt khoảng thời gian học tập tại Trường Đại học Công nghệ TP.HCM.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của tập thể cán bộ, các anh,chị và các bạn trong Phòng thí nghiệm – Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM.

Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Sinh viên

Trần Thị Kim Ngân

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 9

5 Phương pháp nghiên cứu 9

6 Các kết quả đạt được của đề tài .10

7 Kết cấu của ĐATN 10

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

1.1 Tổng quan về cây Sen 11

1.4 Tổng quan về khả năng kháng oxy hóa 24

1.4.1 Quá trình oxy hóa và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hóa 24

1.4.2 Tính chống oxy hóa của các hợp chất trong lá sen 25

1.5 Tổng quan về phương pháp khối phổ LC-MS 26

1.5.1 Phổ khối lượng 26

1.5.2 Cấu tạo một khối phổ kế 27

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.1 Vật liệu nghiên cứu 35

2.2 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 35

2.3 Phương pháp thí nghiệm 36

2.3.1 Phương pháp vi học kiểm nghiệm dược liệu 37

2.3.2 Thử độ tinh khiết dược liệu 39

2.3.3 Quá trình chiết và thu nhận cao chiết 41

2.3.4 Phương pháp xác định lượng cao thu được 43

2.3.5 Phương pháp định tính các thành phần hóa học trong lá sen .44

2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số 45

2.3.7 Phương pháp định lượng flavonoid tổng số 45

2.3.8 Phương pháp định lượng alkaloid tổng số 46

2.3.9 Phương pháp xác định năng lực khử 48

2.3.10 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH 49

2.3.11 Phương pháp phân tích phổ khối lượng MS 50

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1 Khảo sát vi phẫu và soi bột lá sen 53

3.2 Thử độ tinh khiết dược liệu 55

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn đến lượng cao thu được 56

3.4 Định tính các thành phần hóa học có trong dịch chiết lá sen 58

3.5 Định lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết 61

3.6 Định lượng Flavonoid tổng số 64

3.7 Định lượng alkaloid tổng số 67

3.8 Xác định năng lực khử 68

3.9 Xác định hoạt tính kháng gốc tự do DPPH 69

3.10 Kết quả phân tích TPHH của dịch chiết lá sen bằng HPLC-ESI/MS 74

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78

4.1 Kết luận 78

4.2 Kiến nghị 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

IC50: half maximal inhibitory concentration

LC-MS: Liquid Chromatography–Mass Spectrometry

TPHH: Thành Phần Hóa Học

TPC: Total Polyphenols Content (Hàm lượng polyphenol tổng số)TFC: Total Flavonoids Content (Hàm lượng flavonoid tổng số)db: gam dược liệu khô

.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Độ ẩm dược liệu 55

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến lượng chất khô thu được 56

Bảng 3.3: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá sen 59

Bảng 3.4: Kết quả đường chuẩn Acid Gallic 60

Bảng 3.5: Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số 61

Bảng 3.6: Kết quả đường chuẩn Rutin 63

Bảng 3.7: Kết quả hàm lượng Flavonoid tổng số 64

Bảng 3.8: Kết quả hàm lượng alkaloid toàn phần 65

Bảng 3.9: Năng lực khử của dịch chiết ethanol tối ưu 66

Bảng 3.10: Giá trị %I và kết quả IC50của vitamin C 68

Bảng 3.11: Giá trị %I và IC50 của mẫu lá sen trưởng thành chiết bằng ethanol 96% 70

Bảng 3.12: Giá trị %I và IC50 của lá sen non chiết bằng ethanol 70% 71

Bảng 3.13: Kết quả phân tích TPHH của dịch chiết cồn từ lá sen 73

Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số chất có trong lá sen 13

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của một số chất có trong tâm sen 14

Hình 1.5: Một số hợp chất phenol 17

Hình 1.6: Sơ đồ của một khối phổ kế 27

Hình 2.1: Lá sen non 34

Hình 2.2: Lá sen trưởng thành 34

Hình 2.3: Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 35

Hình 2.4: Sơ đồ tiến trình nhuộm vi phẫu 37

Hình 2.5: Sơ đồ quy trình chiết và phân tích cao chiết lá sen 40

Hình 2.6: Sơ đồ xác định alkaloid toàn phần 46

Hình 2.7: Sơ đồ tiến trình năng lực khử 48

Hình 3.1: Vi phẫu cấu trúc lá sen 53

Hình 3.2: Bột lá sen 53

Hình 3.3: Vi phẫu bột lá sen 54

Hình 3.4: Sự biến đổi màu sắc dịch chiết ở các nồng độ cồn khác nhau 56

Hình 3.5: Sự biến đổi màu sắc khi hơ dịch chiết qua NH4OH 57

Hình 3.6: Sự tạo tủa với thuốc thử Mayer 57

Hình 3.7: Cột bọt trước và sau khi để yên 15 phút 58

Hình 3.8: Kết tủa đỏ gạch hình thành 58

Hình 3.9: Sự đổi màu của dịch chiết 59

Hình 3.10: Dung dịch dựng đường chuẩn Acid Gallic 60

Hình 3.11: Đường chuẩn Acid Gallic 61

Hình 3.12: Dung dịch Rutin chuẩn 63

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.13: Đường chuẩn Rutin 64

Hình 3.14: Mẫu lá sen phản ứng AlCl3 64

Hình 3.15: Đồ thị năng lực khử của dịch chiết 67

Hình 3.16: Sự đổi màu dung dịch do hiện tưởng khử Fe3+ 68

Hình 3.17: Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của vitamin C 69

Hình 3.18: Phản ứng màu của dung dịch DPPH + Vitamin C 69

Hình 3.19: Phản ứng của dịch mẫu + DPPH 70

Hình 3.20: Biểu đồ % I (% ức chế) của mẫu lá sen trưởng thành cồn 96% 70

Hình 3.21: Biểu đồ % I (% ức chế) của mẫu lá sen non trong ethanol 70% 71

Hình 3.22: Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của 2 đối tượng lá sen và vitamin C 71

Hình 3.23: Sắc ký đồ HPLC-ESI/MS của dịch chiết cồn 96% từ lá sen 73

Sen là loại cây quen thuộc với người dân Việt Nam, là loại cây mà hầu như tấtcả các bộ phận đều được sử dụng để phục vụ cho việc trang trí, thực phẩm, dượcphẩm chữa bệnh…Dù vậy, việc nghiên cứu các hoạt chất sinh học có trong sen vẫncòn rất hạn chế ở nước ta.

Việc nghiên cứu sản xuất ra các chất chiết từ thiên nhiên để bổ sung vào đồuống, thực phẩm nói riêng và trong các ngành công nghiệp khác nói chung luônđược quan tâm mà chủ yếu là các hợp chất phenolic như flavonoid và các hợp chấtalkaloid.

Những hợp chất nay tồn tại nhiều trong các loại hoa lá, củ quả…của nhiều loạithảo dược, Những thành phần này được sử dụng như một loại thực phẩm chứcnăng nhằm mục đích ngừa bệnh do có tính chống oxy hóa mạnh Chúng được sửdụng với nhiều mục đích khác nhau trong các ngành công nghiệp như thực phẩm,dược phẩm, mỹ phẩm…

Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm, làmột điều kiện tốt để sen tồn tại và phát triển Việc nghiên cứu, phân tích các thànhphần hóa học có trong sen sẽ là một bước đi cụ thể nhằm tìm ra các hợp chất thứcấp có dược tính tốt trong cây sen, trong đó có alkaloid và flavonoid, tạo tiền đề cơbản cho việc ứng dụng các hợp chất này vào trong các chế phẩm phòng và chữabệnh cho người.

Sen là một loài thực vật gần gũi với đời sống của người dân Việt Nam Tất cảcác bộ phận của sen đều được sử dụng để phục vụ cho con người: lá dùng gói xôi,hoa sen dùng để trang trí, hạt sen thì dùng nấu chè, tâm sen lại có dược tính an thầncho những ai mắc căn bệnh mất ngủ Trong dân gian, lá sen được dùng nấu nướcuống thay trà, nhưng hiện nay, chỉ có một số ít các công trình nghiên cứu về lá sen

cũng như những thành phần dược tính có giá trị của nó Do vậy, đề tài “Nghiên

cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen Nelumbo

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

nucifera” được thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho việc tạo sản phẩm trà túi lọc từ

lá sen hoặc tạo viên nang chức năng mang lại nhiều giá trị thực tiễn.

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Những nghiên cứu trong nước

- Tiến sĩ Hoàng Thị Tuyết Nhung đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất vàtinh chế Conessin, Kaempferon, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đốichiếu trong kiểm nghiệm thuốc”.Trong đó Nuciferin là chất được chiết xuất và

tinh sạch từ cây Sen (Nelumbo nucifera).

- Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch chiết câysen thu hái ở Đà Nẵng.

- Xây dựng qui trình định lượng đồng thời quercetin, kaempferol, catechin vàquercetin-3-0-glucuronid trong lá sen bằng phương pháp HPLC với đầu dòPDA.

- Độc tính mãn và tác dụng chống béo phì từ lá trà xanh và lá sen

- Phương pháp khối lượng định lượng alkaloid toàn phần của lá sen và sự thayđổi hàm lượng alkaloid theo tuổi và thời vụ thu lá.

- Nghiên cứu thành phần hóa học của tâm sen và gương sen,

- Tinh chế và xác định một vài tính chất đặc trưng của lectin từ nhị hoa sen

(Nelumbo nucifera) và hoa cây thiên lý (Telosma condata)

- Chiết xuất alkaloid từ lá sen làm thuốc senin chữa bệnh loạn nhịp tim.- Tác dụng chống loạn nhịp tim của lá sen.

Những nghiên cứu nước ngoài

Trên thế giới đã có những nghiên cứu về cây Sen như:

- Phân tích thành phần Alkaloid trong lá sen bằng phương pháp sử dụng tia UVvà đo phổ khối lượng.

- Xác định hàm lượng các hợp chất phenolic trong hoa sen (Nelumbo nucifera)bằng phương pháp điện di mao dẫn.

- Xác định Nuciferin và các đồng phân của nó bằng phương pháp sắc ký lỏngcao năng ngược pha.

- Xác định một số thành phần flavonoid, alkaloid, mở ra hướng ứng dụng trongviệc khai thác các chế phẩm chức năng giúp ngăn ngừa và điều trị bệnh

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nhiệm vụ 1: Nghiên cứu về cơ sở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiêncứu, làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo.

- Nhiệm vụ 2: Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, thông qua các phương phápxác định, khảo sát, phân tích.

- Nhiệm vụ 3: Thu nhận dịch chiết lá sen bằng phương pháp ngâm dầm trongethanol

- Nhiệm vụ 4: Định tính sơ bộ các thành phần hóa học có trong lá sen

- Nhiệm vụ 5: Xác định hàm lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số vàalkaloid tổng số từ dịch chiết lá sen

- Nhiệm vụ 6: Đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua giá trị IC50 hay nồngđộ ức chế 50% gốc tự do của dịch chiết lá sen, đánh giá năng lực khử và thử

nghiệm in vitro trên mô hình DPPH.

- Nhiệm vụ 7: Khảo sát các thành phần hóa học trong lá sen bằng phương phápHPLC-ESI/MS

5 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: Các tài liệu về lá sen, sơ bộ thànhphần hóa học của lá sen, các phương pháp xác định hàm lượng các hợp chất thứcấp, mô hình đánh giá khả năng kháng oxy hóa, phương pháp HPLC/MS

6 Các kết quả đạt được của đề tài.

- Thu nhận được dịch chiết lá sen bằng phương pháp ngâm dầm trong ethanol96% có hàm lượng phenolic và alkaloid cao (đối với lá sen trưởng thành) và trong ethanol 70% (đối với lá sen non).

- Định tính sơ bộ các thành phần hóa học trong dịch chiết cồn lá sen.

- Định lượng được: polyphenol tổng số, flavonoid tổng số, alkaloid toàn phầncủa dịch chiết.

- Xác định được các thành phần flavonoid, alkaloid trong dịch chiết lá sen

- Tìm ra giá trị IC50, so sánh khả năng kháng oxy hóa trên mô hình DPPH vớiVitamin C và so sánh năng lực khử của dịch chiết với Acid Gallic.

7 Kết cấu của đề tài.

- Mở đầu

- Chương 1: Tổng quan tài liệu, cơ sở khoa học của đề tài- Chương 2: Vật liệu, hóa chất và phương pháp nghiên cứu- Chương 3: Kết quả và thảo luận

- Chương 4: Kiến nghị

Loài (species): N nuciferaDanh pháp: Nelumbo nucifera

Hình 1.1: Cây sen

1.1.2 Đặc điểm thực vật học, sinh thái

Về mặt thực vật học, Nelumbo nucifera (Gaertn,) đôi khi còn được gọi theo cácdanh pháp cũ như Nelumbium speciosum (Willd.) hay Nymphaea nelumbo Đây là một

loại cây thủy sinh sống lâu năm Trong thời kỳ cổ đại nó đã từng là loại cây mọc phổbiến dọc theo bờ sông Nin ở Ai Cập cùng với một loài hoa súng có quan hệ họ hàng

gần gũi có tên gọi dài dòng là hoa sen xanh linh thiêng sông Nin (Nymphaea caerulea)

Dạng thân thảo mọc dưới nước, sống dai nhờ thân rễ (ngó sen) Ngó sen màu trắng,tiết diện gần tròn, có khía dọc màu nâu, ngọn có mang chồi hình chóp nhọn Thân rễphình to thành củ, màu vàng nâu, hình dùi trống, gồm nhiều đoạn, thắt lại ở giữa, trongcó nhiều khuyết rộng.

Lá hình lọng có 2 thùy sâu đối xứng nhau, dài 30-55 cm, rộng 20-30 cm, mép láhơi uốn lượn, mặt trên xanh đậm, nhẵn bóng; mặt dưới xanh nhạt, nhám Gân tỏa tròn,nổi rõ ở mặt dưới Cuống lá màu xanh, hình trụ, dài 1-1,5m, rám, có nhiều gai.

Hoa đơn độc, to, màu hồng hay trắng Cuống hoa màu xanh, dài 1,3-1,5 m, giàchuyển sang màu nâu, có nhiều gai nhọn Cuống lá và cuống hoa có nhiều khoangrỗng bên trong Đế hoa rất lồi dạng hình nón ngược, mép lồi lõm, xốp, non màu vàng,

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

già màu xanh, dài 5-7 cm, đường kính 6-8 cm, chứa nhiều quả sen Bao hoa gồm 16 phiến xếp xoắn ốc không phân biệt rõ lá đài và cánh hoa, bên ngoài 3-5 phiến màuxanh hơi hồng, dài 3-6 cm; bên trong các phiến thuôn dài hình thuyền, dài 9-16 cm,rộng 4-9 cm, màu trắng hồng, đậm hơn ở bìa và ngọn cánh hoa, nhiều gân dọc nổi rõ ởmặt dưới; móng rất ngắn, màu trắng, hình chữ nhật hơi loe.

12-Bộ nhị: nhiều, rời, đều, đính xoắn ốc, chỉ nhị màu trắng, hình sợi, dài 7-9 mm,nhẵn; chung đới màu trắng, hình sợi, dài 1,2-1,3 cm, đầu chung đới kéo dài thành hìnhchùy (gạo sen), màu trắng, dài 4-5 mm; bao phấn 2 ô, màu vàng, thuôn dài, nứt dọc,hướng ngoại, đính đáy, hạt phấn hình bầu dục hay hình trứng, màu vàng, dài 57-75µ m, có rãnh Bộ nhụy nhiều lá noãn rời đính thành nhiều vòng vùi sâu trong đế hoa,bầu màu vàng nhạt, hình bầu dục dài 6-11 mm, rộng 3-4 mm, 1 ô có 1 noãn đính nóc.Vòi nhụy rất ngắn, đầu nhụy hình tròn, lõm ở giữa Quả bế màu xanh, nhẵn, hình bầudục, dài 1,7-2,5 cm, đường kính 0,6-1,2 cm, Hạt màu trắng, dài 1,3-1,5 m, đường kính5-6 mm, 2 lá mầm dày mập màu trắng bên trong có tâm sen màu xanh.

Tâm sen gồm rễ mầm, thân mầm, chồi mầm và 2 lá đầu tiên; rễ mầm không rõ;thân mầm màu xanh, dài 3-4 mm, tiết diện bầu dục, nhẵn bóng; 2 lá đầu tiên, 1 to, 1nhỏ, cuống lá mầm màu xanh, hình móc câu, tiết diện đa giác, dài 1,8-2 cm, phiến lámầm hai mép cuộn vào giữa tạo thành một đoạn dài 6-7 mm.

Nelumbo lutea là loài sen thứ hai có màu trắng thấy phổ biến ở Bắc Mỹ.

Thế giới có 1 chi 2 loài, phân bố ở nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, châu Úc, BắcMỹ Ở Việt Nam có 1 loài.

1.1.3 Thành phần hóa học

Lá có nhiều alkaloid đã được phân lập và xác định cấu trúc: nuciferin, anonain,roemerin, pronuciferin, N-nornuciferin, O-nornuciferin, N-methyl-coclaurin, 4-methyl-N-methylcoclaurin, nepherin, liriodenin, dehydroroemerin, armepavin,dehydronuciferin, dehydroanonain, N- methylsococlaurin, Nuciferin là thành phầnchính, Ngoài alkaloid ra, lá sen còn có các flavonoid: quercetin, isoquercitrin,leucocyanidin, leucodelphinidin.

Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số chất có trong lá sen

Tâm sen có các alkaloid sau đã được biết: liensinin, isoliensinin, methyl-corypalin, neferin, lotusin, 1(p-hydroxybenzyl) 6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetra-hydroisoquinolin,

Gương sen có quercetin, 4,9% chất đạm, 0,6% chất béo, 9% carbohydrat và mộtlượng nhỏ vitamin C 0,017%,

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của một số chất có trong tâm sen

Hạt Sen chứa nhiều tinh bột (60%), đường raffinose, 1% chất đạm, 2% chất béo vàcó một số chất khác như canxi 0,089%, phosphor 0,285%, sắt 0,0064%, với các chấtlotusine, demethyl coclaurine, liensinine, isoliensinine.

Tua nhị Sen có tannin.

Ngó Sen chứa 70% tinh bột, 8% asparagin, arginin, trigonellin, tyrosinglucose,vitamin C, A, B, PP, tinh bột và một ít tannin.

1.1.4 Tính vị, tác dụng

Hạt Sen: Vị ngọt, tính bình; có tác dụng bổ tỳ dưỡng tâm, sáp trường, cổ tinh.Tâm Sen: Vị rất đắng, có tác dụng an thần nhẹ.

Gương Sen: Có tác dụng tiêu ứ, cầm máu.

Tua nhị Sen: Vị chát, tính ấm; có tác dụng sáp tinh, ích thận, thanh tâm, chỉ huyết Lá Sen: Vị đắng, tính mát; có tác dụng hạ huyết áp, an thần, thanh thử,lợi thấp, tánứ, chỉ huyết.

Ngó Sen: Có tác dụng cầm máu, tráng dương, an thần.

1.1.5 Công dụng, chỉ định, phối hợp

Hạt Sen: Chữa các bệnh đường ruột như tỳ hư, tiết tả, lỵ; di mộng tinh, đới hạ, hồihộp mất ngủ, cơ thể suy nhược, kém ăn ít ngủ Ngày dùng 12-20g có thể đến 100g,

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

dạng thuốc sắc hay hoàn tán Là thực phẩm cao cấp để dùng cho người già yếu, trẻ conhoặc dùng chế biến các món ăn quý, chất lượng cao như làm mứt, nấu chè; là phụ liệucho các món ăn dân tộc như bánh phồng tôm.

Tâm Sen: Chữa sốt và khát nước, di mộng tinh, tim đập nhanh, huyết áp cao, hồihộp hoảng hốt mất ngủ, Dùng 1,5-3g.

Gương Sen: Chữa chảy máu tử cung, băng huyết, đau bụng dưới do máu ứ, tiêu ramáu, nôn ra máu Dùng 10-15g, Trong các bài thuốc chữa băng huyết, rong huyết,thường có kèm gương sen bên cạnh các vị thuốc khác.

Tua nhị Sen: Chữa băng huyết, thổ huyết, di mộng tinh, trĩ bạch đới, đái dầm, tiểunhiều, Dùng 3-10g.

Lá Sen: trị say nóng, viêm ruột, nôn ra máu dạ dày, chảy máu cam và các chứngchảy máu khác Dùng 5-12g sấy trên than hoặc ngày dùng độ 1 lá, sắc nước uống Còndùng chữa chứng béo phì; dùng 15g lá sen rửa sạch đun với nước sôi trong 50 phúthoặc hãm với nước sôi trong 10 phút, mỗi sáng uống 1 ấm.

Ngó Sen: Dùng chữa bệnh sốt có khát nước và dùng cầm máu (tiêu ra máu, tiểu ramáu, nôn ra máu, chảy máu cam, xuất huyết sau sinh) và trị bạch đới, tiêu chảy Dùngngó sen 5-12g phơi khô sắc uống hàng ngày hoặc có thể giã lá sen tươi lấy nước uống.

Các bài thuốc dân gian từ lá sen

Giảm béo phì: Dùng lá sen sấy khô đun lấy nước uống thay trà lá vối hàng ngàyhoặc cho một giúm nhỏ vào tách (ly) rồi hãm với nước sôi, sau khoảng 2 - 5 phút thìuống Uống thường xuyên và liên tục sẽ giảm lượng mỡ dư thừa trong cơ thể đáng kể,giúp bạn có thân hình khỏe và đẹp.

Chữa háo khát: Lá sen non (loại lá còn cuộn lại chưa mở càng tốt) rửa sạch, tháinhỏ, ép lấy nước uống làm nhiều lần trong ngày Hoặc thái nhỏ, trộn với các loại raughém, ăn sống hằng ngày Người bị tiêu chảy vừa chữa khỏi, cơ thể đang bị thiếu nướcdùng rất tốt.

Chữa máu hôi không ra hết sau khi sinh: Lá sen sao thơm 20-30g tán nhỏ, uống vớinước hoặc đồng tiện (nước tiểu trẻ em) hoặc sắc với 200ml nước còn 50ml, uống làmmột lần trong ngày.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Chữa sốt xuất huyết: Lá sen 40g, ngó sen hoặc cỏ nhọ nồi 40g, rau má 30g, hạt mãđề 20g, sắc uống ngày một thang Nếu xuất huyết nhiều, có thể tăng liều của lá và ngósen lên 50-60g.

Chữa chảy máu não và các biến chứng kèm theo ở bệnh nhân tăng huyết áp: Lá sen15,5g, cam thảo 15,5g, đỗ trọng 12,5g, sinh địa, mạch môn, tang ký sinh, bạch thược mỗi vị 10g, sắc uống ngày một thang.

Chữa băng huyết, chảy máu cam, tiêu chảy ra máu: Lá sen 40g để sống, rau má 12gsao vàng, thái nhỏ, sắc với 400ml nước còn 100ml, uống làm hai lần trong ngày.

Chữa ho ra máu, nôn ra máu: Lá sen, ngó sen, sinh địa mỗi vị 30g; trắc bá, ngảicứu mỗi vị 20g Tất cả thái nhỏ, phơi khô, sắc uống trong ngày.

Chữa mất ngủ: Lá sen loại bánh tẻ 30g rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô, sắc hoặc hãmuống Có thể dùng viên nén gồm cao mềm lá sen 0,03g, bột mịn lá sen 0,09g, tá dượcvừa đủ cho một viên, Ngày uống 3-6 viên trước khi đi ngủ 3 giờ Hoặc sirô lá sen gồmcao mềm lá sen 4g, cồn 45% 20ml, sirô đơn vừa đủ cho 1,000ml, Người lớn uống15ml, trẻ em tùy tuổi 5ml.

1.2 Tổng quan về hợp chất Phenolics

Đây là nhóm hợp chất lớn trong các nhóm hợp chất thứ cấp ở thực vật, Các nhàkhoa học đã phát hiện ra hơn 8,000 hợp chất phenol tự nhiên Đặc biệt trongcấu trúc của nhóm này trong phân tử có vòng 6C (vòng benzen) gắn trực tiếpmột hay nhiều nhóm hydroxyl (OH) Vì vậy chúng là những alcol bậc 4 vàđược đặc trưng bởi tính acid yếu.

1.2.1 Phân loại

- Dựa vào thành phần chính và cấu trúc phenol, người ta chia chúng thành 3

nhóm là phenol đơn giản, phenol phức tạp và nhóm polyphenol, Phân loạinày dựa trên bộ khung carbon của các hợp chất trong đó là C6 là nhómphenyl, C1 là nhóm methyl, C2 là nhóm acetyl, C3 là nhóm thế có 3 carbon,C4 là nhóm thế có 4 carbon C6 (phenol đơn giản, benzoquinone), C6-C1(acid phenolic), C6-C2 (acetophenone, phenylacetic acid), C6-C3 (acidhydroxycinnamic, coumarin, phenylpropene, chromone), C6-C4(naphthoquinone), C -C -C (xanthone), C -C -C (stilbene, anthraquinone),

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

C6-C3-C6 (flavonoid, isoflavonoid), (C6-C1)2 (tannin thủy phân), (C6C3)2(lignan, neolignan), (C6-C3-C6)2 (biflavonoid), (C6-C3)n (lignin), (C6)n(catechol melanin), (C6-C3-C6)n (tannin ngưng tụ).

Nhóm hợp chất polyphenol là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất phenol,

có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc sự trung hợp của các đơn phân,Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng

Hình 1.5: Một số hợp chất phenol

1.2.2 Tính chất hóa học

Các hợp chất phenol có cấu tạo và tính chất đa dạng nhưng do có những đặcđiểm giống nhau ở cấu trúc được cấu thành từ các vòng benzene nên chúng có một sốtính chất chung :

Phản ứng của nhóm hydroxyl Phản ứng phá vòng benzen Phản ứng tạo phức với kim loại Phản ứng este hóa

1.2.3 Vai trò của các hợp chất trong phenol trong thực vật

Thực vật tổng hợp rất nhiều các chất thứ sinh so với động vật vì chúng khôngthể lẫn trốn đươc kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phòng thủ hóa học này, Nhìn chungvai trò bảo vệ của các hợp chất phenol dựa trên đặc tính kháng khuẩn, kháng dinhdưỡng của chúng

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Các phenol còn có vai trò then chốt trong hình thành các sắc tố của hoa như đỏ,xanh, tím…Đặc tính chống oxyl hóa (antioxidant) hay tạo phức với kim loại; tạo racác tín hiệu thông tin giữ phần ở trên cũng như dưới mặt đất, giữa các cây khác vớisinh vật khác; phenol còn là các tác nhân che chắn tia tử ngoại (UV) từ mặt trời Khảnăng che chắn tia UV giúp cho thực vật có thể chuyển từ sống dưới nước lên cạn hoàntoàn

Các nghiên cứu còn cho thấy trao đổi hợp chất phenol không chỉ là bảo vệchống lại các yếu tố sinh học, vô sinh mà còn có tham gia quá trình điều hòa ở cấp độphân tử giúp cây sinh trưởng và phát triển bình thường

Các flavonoid như flavonol và anthoxyane có vai trò quan trọng trong việc điềuchỉnh sự phân bố năng lượng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quả quang hợp Một sốhợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự nhiên của hoa, quả, hấp dẫn côn trùngthụ phấn cho hoa.

1.2.4 Flavonoid

Flavonoid là một trong các nhóm polyphenol thường gặp ở thực vật, với hơn4,500 hợp chất, phần lớn dễ tan trong nước màu vàng nên được gọi là “flavonoid”(flavus – tiếng Latin, có nghĩa là màu vàng, một sắc tố xanh đỏ tím hoặc không màucũng được sắp xếp vào nhóm flavonoid nếu chúng có chung đặc điểm cấu tạo hóa học.

Flavonoid là sản phẩm của con đường acid shikimic, chúng có khung carbonchung là C6-C3-C6 Flavonoid gồm hai vòng benzen A, B và vòng pyran C, trong đóA kết hợp với C tạo thành khung chroman.

1.1.1.1 Tính chất của Flavonoids

Tính chất vật lý

- Tính chất vật lý là cơ sở để lựa chọn những phương pháp phân lập, phân tíchvà xác định các hợp chất flavonid Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt,flavol vàng nhạt đến vàng, chalcone và auro vàng đậm đến đỏ cam Các chấtthuộc nhóm isoflavonne, flavanol, isoflavanone, flavanone, leucoantoxyanidin,catechin không màu Các dẫn chất anthocyanidin có màu thay đổi tùy theo pHmôi trường.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Tính tan trong dung môi: khả năng hào tan cuar flavonoid không giống nhau,tùy thuộc vào số nhóm OH và các nhóm thế khác của chúng Flavonoidglycoside không tan trong ether, tan được trong nước nóng, tốt nhất là cồnnóng Các dẫn xuất 7-hydroxyl thường dễ tan trong kiềm loãng.

- Một đặc điểm quan trọng của flavonoid là có khả năng hấp thụ tia tử ngoại.Nguyên nhân này có thể do hệ thống nối đôi liên hợp tạo ra bởi hai vòngbenzen A, B và vòng pyran C Flavonoid có hai dãy hấp thụ cực đại, giải 1 ởbước sóng > 290nm, giải 2 ở bước sóng 220 – 280 nm

Tính chất hóa học

- Flavonoid đa dạng về cấu trúc hóa học, vì vậy khả năng phản ứng hóa hoc củachúng rất lớn phụ thuộc vào nhiều yếu tố : vị trí các nhóm OH, hệ thống nốiđôi liên tiếp và các nhóm thế Dưới đây là các phản ứng hóa học cơ bản củaflavonoid

Phản ứng của nhóm OH: gồm phản ứng oxyl hóa, phản ứng tạo thànhliên kết hydrogen, phản ứng este hóa,

Phản ứng của vòng thơm : phản ứng diazo hóa

Phản ứng của nhóm carboxyl: phản ứng shinoda, phản ứng tạo phức vớikim loại, Đây là phản ứng khử, có sự tham gia của kim loại như Fe, Zn, Mg vàHCl, Sản phẩm có màu da cam, hồng hoặc đỏ Phản ứng này đặc trưng cho cácflvonoid có nhóm C=O ở vị trí C4 và nối đôi giữa C2 và C3 Điển hình làflavonol, flavanone, flavanonol.

Tính chất sinh học

Tác dụng sinh học của các flavonoid rất đa dạng và phong phú, Các cơchế hóa học của chúng có nhiều điểm còn chưa sáng tỏ, tuy nhiên cơ chế đóngvai trò quyết định là tác dụng chống oxyl hóa Nhờ đó flavonoid có thể triệt tiêugốc tự do có hại trong cơ thể, giúp cơ thể động vật và con người phòng chốngbệnh tật.

- Flavonoid có khả năng kiềm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởigốc tự do hoạt động, Tuy nhiên hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ thuộcvào đặc điểm cấu tọa hóa học của từng chất flavonoid cụ thể Do bản chất cấu

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

tạo polyphenol nên flavonoid ở trong tế bào thực vật hoặc ở trong cơ thể độngvật chịu tác động của các biến đổi oxy hóa khử, bị oxyl hóa từng bước và tồntại ở dạng hydroxyl, semiquinone, Semiquinone hoặc quinone là những gốc tựdo bền vững, gọi là gốc phenoxyl, kí hiệu ArO* Chúng có thể nhận điện tử vàhydrogen từ chất cho khác nhau để trở lại dạng hydroquinone, Các chất này cókhả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động sinh ra trong quá trình sinh lývà bệnh lý để triệt tiêu chúng.

- Sự có mặt của các nhóm hydroxyl nhân thơm của các flavonoid cũng như cácpolyphenol làm cho chúng có khả năng tương tác với protein Tương tác này cóthể làm hoạt hóa hay ức chế hoạt động của enzyme Tác dụng của flavonoid lêncác enzyme là một trong những cơ sở hóa sinh để định hướng cho việc sử dụngcác chất flavonoid để chữa bệnh.

- Các công trình nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định flavonoid có khả năngchống ung thư Các flavonoid có tác dụng kiềm hãm các enzyme oxy hóa, kìmhãm quá trình đường phân, quá trình hô hấp, kìm hãm quá trình giảm phân, hạnchế sự phá vỡ cân bằng các quá trình trao đổi chất bình thường trong tế bào.- Nhiều flavonoid có hoạt tính của vitamin P có tác dụng làm tăng sức bền và

tính đàn hồi của thành mao mạch Củng cố và làm giảm tính thấm thành mạch,bảo vệ thành mạch trong các bệnh làm tăng tính thấm thành mạch như đáiđường, trĩ, giãn tĩnh mạch.

1.3 Tổng quan về hợp chất alkaloid

Năm 1806 một dược sĩ là Friedrich Wilhelm Sertüner phân lập được một chất từnhựa thuốc phiện có tính kiềm và gây ngủ mạnh đã đặt tên là “Cinchonino”, sau đóchiết được chất kết tinh từ vỏ cây Canhkina và đặt tên là “Cinchonino”, sau đó P,J,Pelletier và J,B,Caventou lại chiết được hai chất có tính kềm từ một loài Strychnos đặttên là strychnin và brucin Đến năm 1819 một dược sĩ là Wilhelm Meissner đề nghịxếp các chất có tính kiềm lấy từ thực vật ra thành một nhóm riêng và ông đề nghị gọitên là alkaloid do đó người ta ghi nhận Meissener là người đầu tiên đưa ra khái niệmvề alkaloid và có định nghĩa: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, cóphản ứng kiềm và lấy từ thực vật ra.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Ngoài tính kiềm, alkaloid còn có những đặc tính khác như có hoạt tính sinh họcmạnh, có tác dụng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid… Sau nàyPôlônôpski đã định nghĩa: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số cónhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong độngvật, thường có dược lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốcthử gọi là thuốc thử chung của alkaloid.

Tuy nhiên cũng có một số chất được xếp vào nhóm alkaloid nhưng nitơ không có dịvòng mà ở mạch nhánh như: Ephedrin trong ma hoàng (Ephedra sinica Staf,),capsaisin trong ớt (Capsicum annuum L,), hordenin trong mầm mạch nha (Hordenum

sativum Jess,), colchicin trong hạt cây tỏi độc (Colchicum autumnale L,); một số

alkaloid không có phản ứng với kiềm như colchicin lấy từ hạt tỏi độc, ricinin lấy từ hạt

thầu dầu (Ricinus communis L,), theobromin trong hạt cây cacao (Theobroma cacaoL,) và có alkaloid có phản ứng acid yếu như arecaidin và guvacin trong hạt cau (Areca

catechu L.)

Tính chất vật lý

Thể chất: Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên công thức cấu tạo có oxy nghĩa là trong

công thức có C, H, N, O, những alkaloid này thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường Vídụ: Morphine (C17H19NO3), codein (C18H21NO3), strychnin (C21H22N2O2), quinin(C20H24N2O2), reserpin (C33H40O9N2)…

Những alkaloid thành phần cấu tạo không có oxy thường ở thể lỏng Ví dụ như:Coniin (C8H17N), nicotin (C10H14N2), spartein (C15H26N2) Tuy nhiên cũng có vài chấttrong thành phần cấu tạo có oxy vẫn ở thể lỏng như arecolin (C8H13NO2), pilocarpidin(C10H14N2O2) và có vài chất không có oxy vẫn ở thể rắn như sempecvirin (C19H16N2),conexin (C24H40N2),

Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh được và có điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng cómột số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy ở nhiệt độ trước khi chảy,

Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi được và thường vững bền, không bị phân hủy ởnhiệt độ sôi nên cất kéo được bằng hơi nước để lấy ra khỏi dược liệu,

- Mùi vị: Đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như

capsaixin, piperin…

- Màu sắc: Hầu hết các alkaloid đều không màu trừ một số ít alkaloid có màu vàng

như berberin, palmatin, chelidonin,

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Độ tan: Nói chung các alkaloid base không tan trong nước, dễ tan trong các dung

môi hữu cơ như methanol, ethanol, ether, chloroform, benzen,, trái lại các muốialkaloid thì dễ tan trong nước, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ ít phâncực,

Có một số trường hợp ngoại lệ, alkaloid base lại tan được trong nước như coniin,nicotin, spactein, colchicin, cafein (tan 1/80 trong nước lạnh và 1/2 trong nước sôi).Một số alkaloid có chức phenol như morphine, cephelin tan trong dung dịch kiềm.Muối alkaloid như berberin nitrat lại rất ít tan trong nước.

Dựa vào độ tan khác nhau của alkaloid base và muối alkaloid người ta sử dụngdung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid.

- Năng suất quay cực: Phần lớn alkaloid có khả năng quay cực (vì trong cấu trúc có

cacbon không đối xứng), thường tả tuyền, một số nhỏ hữu tuyền như cinchonin,quinidin, aconitin, pilocacpin…một số không có tác dụng với ánh sáng phân cực (vìkhông có cacbon không đối xứng) như piperin, papaverin, naxein… một số alkaloid làhỗn hợp đồng phân tả tuyền và hữu tuyền (raxemic) như atropin, atropamin,… năngsuất quay cực là hằng số giúp ta kiểm tra độ tinh khiết của alkaloid, Khi có hai dạng Dvà L thì alkaloid dạng L có tác dụng sinh lý mạnh hơn dạng D.

Tính chất hóa học

- Hầu như alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như basemạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có chất tính base rất yếunhư cafein, piperin… vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid không có phản ứngkiềm như colchicin, ricinin, theobromin và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếunhư arecaidin, guvacin.

Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng nhữngkiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH… khi định lượngalkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để lựa chọn chỉthị màu cho thích hợp.

- Tác dụng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng.

- Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt…) tạo ra muối phức.

- Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung củaalkaloid, Những phản ứng chung này được chia làm 2 loại:

Phản ứng tạo tủa:

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆPCó hai nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid

Nhóm thuốc thử thứ nhất cho tủa rất ít tan trong nước, Tủa này sinh ra hầu hết là dosự kết hợp của một cation lớn là alkaloid với một anion lớn thường là anion phức hợpcủa thuốc thử.

Có nhiều thuốc thử tạo tủa với alkaloid:

+ Thuốc thử Mayer (K2HgI4 – kalitetraiodomercurat): Cho tủa trắng hay màu vàngnhạt.

+ Thuốc thử Bouchardat (iodo – iodid): Cho tủa nâu.

+ Thuốc thử Dragendorff (KBiI4 – Kali tetraiodobismutat III): Cho tủa vàng camđến đỏ.

+ Muối Reinecke [NH4[Cr(SCN)4(NH3)2],H2O – amoni tetra sulfocyanua diamincromat III]

+ Thuốc thử Scheibler [acid phosphovonframic – H3P (W3O10)4].+ Thuốc thử Godeffroy [acid silicovonframic – H3Si [(W3O10)4].+ Thuốc thử Sonnenschein [acid photphomolybdic – H3P (Mo3O10)4].

Phản ứng tạo tủa này rất nhạy, độ nhạy của mỗi loại thuốc thử đối với từng alkaloidcó khác nhau, Ví dụ: Thuốc thử Mayer còn xuất hiện tủa với morphin khi pha loãng1/2,700 nhưng với quinin ở độ pha loãng 1/125,000, Cafein còn tạo tủa với thuốc thửDragendorff ở độ pha loãng 1/600, nhưng với thuốc thử Bouchardat ở độ pha loãng1/10,000.

Trong phân tích alkaloid, một số thuốc thử tạo tủa trên còn được dùng với ý nghĩakhác: Thuốc thử Dragendorff còn được dùng phun hiện màu trong sắc ký giấy và sắcký lớp mỏng Muối Reinecke dùng trong định lượng alkaloid bằng phương pháp somàu Acid photphomolybdic và acid photphovonframmic được dùng trong định lượngalkaloid bằng phương pháp cân và phương pháp so màu.

Nhóm thuốc thử thứ hai cho những kết tủa ở dạng tinh thể:+ Dung dịch vàng clorid

+ Dung dịch platin clorid

+ Dung dịch nước bão hòa acid picric+ Acid picrolonic

+ Acid styphnic

Thuốc thử tạo màu thường là những hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ hòa trong acidH2SO4 đậm đặc Những thuốc thử tạo màu quan trọng là: Acid sulfuric đậm đặc(d=1,84), acid nitric đậm đặc (d=1,4), thuốc thử Fröhde (acid sulfomolybdic), thuốcthử Marquis (sulfofocmol), thuốc thử Mandelin (acid sulfovanadic), thuốc thửErdmann (acid sulfonitric), thuốc thử Wasicky (p, dimetylaminobenzaldehyt hòa trongH2SO4), thuốc thử Merke (acid sulfoselenic).

Trong dịch chiết có nhiều alkaloid và còn lẫn tạp chất khác thì phản ứng lên màukhông thật rõ bằng những alkaloid đã được chiết và phân lập ở dạng tinh khiết.Do đóđể kết luận được chắc chắn người ta thường dùng phản ứng màu kết hợp với phươngpháp sắc ký lớp mỏng có alkaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh.

1.4 Tổng quan về khả năng kháng oxy hóa

1.4.1 Quá trình oxy hóa và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hóa

Gốc tự do là các nguyên tử không trọn vẹn, số điện tử vòng ngoài của nó là sốlẻ nên không bền vững, nó phải kết hợp với một nguyên tử khác để có số điện tử chẵnđể bền vững, Sự bền vững này chỉ trong chốc lát, chính nó lại tạo ra một nguyên tửkhông trọn vẹn khác và tiếp tục kết hợp với một nguyên tử khác rồi trở thành nguyêntử không trọn vẹn và tiếp tục chu kỳ bất tận như thế Phản ứng hóa học của nó rấtmãnh liệt và nó sẽ kéo theo một điện tử của phân tử khác về nó, cho ra những phân tửkhác bị hư hại hay bị oxy hóa, Một khi phân tử bị oxy hóa rồi thì phân tử đó sẽ tự mấtđi tất cả các chức năng vốn có của nó, tiếp đó chính nó lại là tác nhân oxi hóa các phântử chung quanh nó, làm hư hại các tế bào của các phân tử xung quanh Và quá trìnhnày cứ tiếp tục như thế sẽ tạo thành các tế bào không bình thường dẫn tới các loại bệnhnhư: xơ vữa động mạch, ung thư…

Theo các tài liệu nghiên cứu đã công bố, các bệnh như: ung thư, tim mạch, lãohóa…có liên quan rất gần với các quy luật về quá trình oxy hóa trong các tế bào sống.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Các quá trình oxy hóa diễn ra dưới tác dụng của các gốc tự do trong tế bào là cần thiếtđể tạo ra năng lượng hoặc trong các quá trình sinh tổng hợp của cơ thể Gốc tự do lànhững hợp chất hoạt động mạnh, được tạo ra trong cơ thể trong quá trình trao đổi chấthay được đưa vào từ bên ngoài do virút, vi khuẩn…Các gốc tự do được tạo thành gồmcác gốc có hoạt tính cao như hydroxyl (OH), ion sắt (Fe2+O),Cu(OH)2 những gốc tự docó hoạt tính trung bình và yếu như peroxyl (ROO), hydrogen peroxde H2O2, singletoxy (O1), nitric oxide (NO), ankoxyl…

Thông thường các gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡngđược kiểm soát chặt chẽ thông qua quá trình kháng oxy hóa nội tại bằng các hợp chấtnhư glutathione, vitamin E, vitamin C và enzym superoxide dismutase, Ngoài ra cơ thểcòn có các tế bào như neutrophill, monocyte, B-cell…có khả năng chống lại các yếu tốoxy hóa ngoại lai xâm nhập.

Tuy nhiên, trong các tế bào có thể xuất hiện hiện tượng các gốc tự do được tạora quá nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên ngoài như cácchất độc, do nhiễm vi sinh vật, do ozone, bức xạ, tia UV, nhiễm phóng xạ, do thuốc lá,môi trường ô nhiễm…Các gốc tự do dư thừa trong khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệđể ngăn chặn, có khả năng tương tác, phá hủy màng lipid không bão hòa của tế bào,làm giảm khả năng bảo vệ các tế bào dẫn đến sự xâm nhập các tác nhân gây bệnh từbên ngoài oxy hoá các nucleotid căn bản làm thay đổi cấu trúc AND, dẫn đến các quátrình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư, làm hỏng cấu trúc protein hoặc hoạt hóaenzym trong các quá trình trao đổi chất gây bệnh…

1.4.2 Tính chống oxy hóa của các hợp chất trong lá sen

Trong cơ thể con người có sẵn một vài enzyme dùng để bảo vệ và ngăn ngừanhiều loại gốc tự do làm nguy hại tế bào như: superoxide dismutase phân hóa nhiềutrong các tế bào hồng cầu và gan, Tuy nhiên với số lượng gốc tự do quá nhiều nên cơthể phải nhờ đến các chất chống oxy hóa từ bên ngoài như vitamin E, vitamin C…Tuynhiên người ta đặc biệt chú tâm tới khả năng chống oxy hóa của các hợp chấtpolyphenol có trong các loại thực phẩm như: lá dâu tằm, trà xanh, lá chè…

Công thức hóa học của các geranyl dihydrochalcone (2, 4, 5, 8, 9), geranylflavonoids (1, 3, 6, 7) có mặt các hydrogen phenolic thể hiện khả năng kháng oxy hóa

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

mạnh, Quá trình kháng oxy hóa của chúng được thể hiện bằng cách tác động trực tiếplên các gốc tự do được sinh ra trong cơ thể, chúng sẽ tương tác với các gốc tự do đưachúng về trạng thái các chất bền qua đó làm cho quá trình oxy hóa bị loại bỏ thông quacác dạng phản ứng sau:

RO2*+ AH ROOH + A* (1)RO* + AH ROH + A (2)RO2*+ A* ROOA* (3)RO*+ A* ROA (4)

Các chất A* tạo ra trong các phản ứng (1) (2) khác với các gốc RO2* , RO* vìchúng không có khả năng lấy các ion H+ từ các acid béo không no hay của các hợpchất trong cơ thể nên không tạo ra các gốc tự do mới để tiếp tục khởi động quá trìnhoxy hóa Các sản phẩm tạo ra trong phản ứng (3)(4) là những sản phẩm khá bền và kếtquả là chuỗi phản ứng của các gốc tự do sẽ kết thúc sớm hơn.

1.5 Tổng quan về phương pháp khối phổ LC-MS

1.5.1 Phổ khối lượng

Một trong những phổ có ứng dụng nhiều nhất hiện nay trong phân tích và xácđịnh các chất tự nhiên là phổ khối lượng (mass spectrometry, MS, thường được gọi làphổ khối), Phổ khối cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từphân tử.

Phổ khối không xác định trực tiếp khối lượng của ion mà xác định tỉ lệ giữakhối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z), Ở các phân tử nhỏ, điện tích của ionthường là 1 nên giá trị m/z của phổ khối liên quan trực tiếp tới khối lượng của ion, Vớicác đại phân tử, điện tích của ion có thể lớn hơn 1, Khi đó, để xác định khối lượngphân tử (M) cấn phải biết số điện tích của ion.

Dưới những điều kiện nhất định, phân tử các chất bị mất đi electron tạo nên ionphân tử (hay còn gọi là ion mẹ) M+, Ion mẹ này có thể tiếp tục “vỡ” ra thành các mảnhnhỏ hơn là các ion con và các mảnh trung hòa Vì khối lượng của các electron rất nhỏ,có thể bỏ qua, nên khối lượng của M+ chính là khối lượng của phân tử.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ionmẹ sẽ tuân theo những quy định nhất định Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ranhững phân mảnh giống nhau Từ khối lượng phân tử và các mảnh của phân tử, cùngvới các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chấtchưa biết, So sánh phổ khối của một chất với phổ khối của một chất đã biết có thể giúpđịnh danh chất đó dễ dàng và chính xác.

Khối phổ kế có thể hoạt động độc lập như một thiết bị đo phổ các chất tinhkhiết hay ghép nối với các thiết bị sắc ký như sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí, điện dimao quản… như một detector và đồng thời cung cấp các thông tin cấu trúc.

1.5.2 Cấu tạo một khối phổ kế

Cấu tạo của một khối phổ kế gồm có các bộ phận chính sau: (a) Đầu vào, (b)buồng ion hóa, (c) bộ phận phân tích khối, (d) detector và (e) máy tính ghi nhậ xử lý,lưu trữ kết quả và điều khiển hệ thống, Các bộ phận từ (b) - (d) được đặt trong mộtbuồng chân không sâu, Tùy theo từng kỹ thuật phối khổ mà cấu tạo và nguyên lý hoạtđộng của từng bộ phận có thể khác nhau.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đầu vào

Hình 1.6: Sơ đồ của một khối phổ kế

Đầu vào là nơi mẫu được đưa vào máy phổ khối, Mẫu có thể được đưa vào trựctiếp hay được ghép nối với đầu ra của một hệ thống sắc ký Mẫu có thể được đưa vàodưới dạng rắn, lỏng hay khí nhưng được ion hóa trong buồng ion hóa Cổ điển nhất làmẫu được hóa hơi, Với các kỹ thuật ion hóa mới, mẫu có thể được ion hóa trực tiếp từdạng lỏng hay dạng rắn Ngày nay, việc ghép nối đã trở nên dễ dàng và khối phổ đangdần trở thành một detector phổ thông cho các hệ thống sắc ký.

Buồng ion hóa

Buồng ion hóa là nơi mẫu thử được biến thành các ion để đi vào hệ thống phântích, Hiện nay, có nhiều kỹ thuật để biến các phân tử trung hòa thành ion Tùy từng kỹthuật, mức độ bị ion hóa của các phân tử có thể khác nhau, từ ion hóa mạnh cho cácchất dễ bay hơi và bền tới ion hóa nhẹ nhàng cho các phân tử lớn, khó bay hơi.

Cách cổ điển nhất để ion hóa các chất là kỹ thuật bắn phá electron hay sau này cònđược gọi là ion hóa bằng electron (electron impact hay electron ionization, EI) Ngườita dùng một chùm electron để “bắn phá” phân tử mẫu ở trạng thái hơi, Điều kiện chuẩnđể thực hiện EI là 70eV, Phổ EI thu được ở điều kiện này có thể dùng để so sánh vớiphổ chuẩn để xác định các chất.

EI là phương pháp ion hóa mạnh, nhiều chất trong điều kiện này bị phân mảnh đếnmức không còn nhậ thấy ion M+ nữa Để có thể phát hiện được M+, nhiều kỹ thuật ionhóa nhẹ nhàng hơn đã được áp dụng, Ion hóa hóa học (Chemical Ionization, CI) là mộttrong những kỹ thuật sớm nhất được sử dụng Nguyên tắc của phương pháp là trong

buồng ion hóa, người ta đưa vào một chất khí khác (được gọi là khí thử) Chất này sẽbị ion hóa và các ion này sẽ tác động lên mẫu để ion hóa mẫu tạo ra M+ hay các ioncộng tương ứng Các khí thử thường dùng trong CI là methan, isobutan hay ammonia.Quá trình ion hóa mẫu thử M với khí thử là ammonia xảy ra như sau:

Với ESI, dung dịch mẫu được phun thành những hạt nhỏ vào một buồng chânkhông dưới một điện trường mạnh Các giọt dung dịch bị tích điện và bay hoiw dungmôi sẽ vỡ giọt thành các hạt nhỏ hơn và cuối cùng thành các ion Các ion (dương hayâm) cần được phân tích sẽ được đẩy vào bộ phận phân tích khối, Các phân tử bị ‘vỡ’nhẹ nhàng hơn tạo ra ít phân mảnh và có cường độ lớn hơn Với các polymer (với Mtới vài chục ngàn đơn vị khối), điện tích của các ion (z) sẽ >1 (có thể tới 20 hay hơn)do vậy vẫn có thể được phân tích trong thiết bị phổ với m/z 1000-2000.

APCI tạo ra các ion dương được proton hóa hay ion âm do loại bỏ khỏi phân tử,Dung dịch mẫu được hóa hơi bởi nhiệt độ dưới dạng phun mù và đi vào trong vùngplasma của các ion dung môi tạo bởi hồ quang ở áp suất khí quyển Sự cho nhậnproton xảy ra giữa mẫu và dung môi tạo nên các ion của mẫu thử.

Trong TSP, dung dịch mẫu được bơm dưới áp suất tương đối cao qua 1 maoquản được nung nóng bởi bằng nhiệt điện Khi ra khỏi ống mao quản, dung môi được

hóa hơi hỗ trợ cho việc phun dung dịch thành các hạt mù rồi thành các ion đẩy vào bộphận phân tích khối, TSP có thể áp dụng cho những hệ thống có tốc độ dòng cao(HPLC) Tuy nhiên, ngày nay kỹ thuật này phần lớn được thay thế bằng ESI.

Ngoài những phương pháp ion hóa trên được sử dụng nhiều trong phân tích cáchợp chất phân tử nhỏ còn có nhiều kỹ thuật ion hóa khác sử dụng cho các đại phân tử.Ví dụ, kỹ thuật bắn phá nhanh bằng nguyên tử (Fast Atom Bombardment, FAB), cáckỹ thuật giải hấp trường (Field Desorption, FD), giải hấp laser (Laser Desorption, LD)và một trong những kỹ thuật đang được sử dụng nhiều là kỹ thuật giải hấp laser hỗ trợbởi chất nền (matrix – assisted laser desorption ionization, MALDI) Với MALDI,mẫu được trộn với dung dịch chất nền và được làm khô dung môi trên phiến kim loạirồi đưa vào buồng ion hóa của máy phổ khối chứ không kêt nối trực tiếp được với hệthống sắc ký.

Bộ phận phân tích khối

Nhiệm vụ của bộ phận phân tích khối là phân tách hỗn hợp các ion sinh ra bởi bộphận ion hóa thành từng loại riêng biệt theo m/z để đưa các ion này tới detector để ghinhận phổ, Có nhiều cơ chế để tách riêng các ion như sử dụng từ trường, điện trường vàvận tốc của các ion…Các bộ phận phân tích khối đang được sử dụng trong phổ khốigồm có các loại sau: cung từ (magnetic sector), tứ cực (quadrupole), bẫy ion (ion trap),thời gian bay (time of flight) và cộng hưởng bằng gia tốc ion – biến đổi Fourier(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance, FT-ICR).

Kinh điển nhất trong các bộ phân tích khối là thiết bị sử dụng từ trường, Dưới mộttừ trường mạnh, quỹ đạo các ion sẽ thay đổi và khác nhau phụ thuộc vào điện tích vàkhối lượng ion Thay đổi từ trường sẽ thay đổi quỹ đạo các ion, lần lượt đưa chúng đivào detector, Đây cũng là 1 trong 2 loại phân tích ion mạnh và có độ chính xác caonhất được dùng trong các máy khối phổ phân giải cao (HR-MS).

Bộ phân tích tứ cực gồm 4 thanh kim loại có tiết diện tròn hay hyperbol đặt songsong với nhau dài khoảng 100 - 200 mm Một điện thế một chiều không đổi được điềubiến bởi điện thế tần số radio được áp lên tứ cực tạo nên một điện trường trong tứ cực.Dưới tác động của điện trường, chỉ có những ion nhất định bay dọc theo tứ cực đi tớidetector Các ion khác quỹ đạo bị lệch và va vào các thanh tứ cực hoặc bay ra ngoài.

Tứ cực và bẫy ion cho phép phân tích các chất có m/z tới 5000 Độ chính xác khốicủa tứ cực và bẫy ion không cao (0,1 đơn vị khối) nhưng nhỏ gọn, đơn giản, dễ sửdụng và rẻ tiền hơn nên được áp dụng nhiều trong các hệ LC-MS.

Một cách khác để tách các ion ra khỏi hỗn hợp là dựa vào vận tốc của các ion Ởcùng một mức năng lượng, vận tốc của ion phụ thuộc vào khối lượng của ion Phân tửcàng nhẹ vận tốc càng lớn Đo lường thời gian để ion từ điểm xuất phát bay tớidetector sẽ tính ra được khối lượng của ion Do vậy, kỹ thuật này được gọi là xác địnhthời gian bay của ion (TOF), TOF có độ phân giải tương đối cao (tới 20,000), với sốkhối chính xác hơn (tới 0,0001) Khoảng phân tích khối của TOF là không giới hạn, rấthữu dụng cho việc phân tích các đại phân tử.

Một kỹ thuật mới để phân tích khối là cộng hưởng bằng gia tốc ion - biến đổiFourier (FT-ICR) Các ion được giữ trong một buồng cộng hưởng dưới một từ trườngmạnh ở bên và một điện trường theo hướng trục Giống như trong cộng hưởng từ hạtnhân, tất cả các ion trong buồn được kích thích bởi một xung tần số radio băng rộng(10KHz - 1MHz), Các ion sẽ hấp thu năng lượng phù hợp để cộng hưởng Các ioncùng loại khi hấp thu năng lượng (cộng hưởng) chuyển động đồng nhất tạo ra một tầnsố nhất định phụ thuộc vào m/z.Tất cả các tần số của các ion tạo ra sẽ được ghi nhậndưới dạng các dao động cảm ứng tự do tắt dần theo thời gian và sau đó được biến đổiFourier để trở thành dạng phổ khối truyền thống, FT-ICR có độ phân giải và độ chính

xác khối rất cao (tới 1 ppm), khoảng phân tích khối rộng (hiện nay là m/z tới 10,000).Độ nhạy của FT-ICR cũng rất cao, giới hạn phát hiện có thể đạt tới mức attomole Khiphối hợp với ESI, FT-ICR có thể phân tích các protein tới 15,000 đơn vị khối.

Ngoài các kỹ thuật phân tích khối đã nêu trên, còn có các loại khác đã hoặc đang được phát triển như bẫy quỹ đạo (orbital trap) hay dựa trên tính linh động của ion (ionmobility) và các kỹ thuật lai hay kết hợp giữa các loại trên.

Detector

Là nơi tiếp nhận các ion và biến thành các tín hiện điện để được ghi nhận thành cáctín hiệu phổ khối, Có nhiều loại detector khác nhau nhưng thường là loại ống nhânđiện, ống nhân quang… các tín hiện điện thu được từ detector sẽ được số hoá và lưutrữ dưới dang các tập tin kỹ thuật số.

Trong phân tích khổ phối, việc xác định chính xác một ion (M+ hay các phânmảnh) rất quan trọng cho việc xác định chất được phân tích Một hợp chất xác định,trong những điều kiện xác định sẽ cho các ion xác định trên phổ khối Tuy nhiên, mộtion có số khối xác định trên phổ khối lại có thể xuất phát từ nhiều chất khác nhau.Trong phân tích một hỗn hợp bằng sắc ký - khối phổ, nếu điều kiện sắc ký không đảmbảo, các chất tách ra không hoàn toàn dẫn tới phổ khối thu được sẽ có các ion của cácphân tử khác làm ảnh hưởng tới việc nhận định kết quả Trong các trường hợp này,việc xác định MS thông thường (một lần) khong cho được kết quả chính xác Để khắcphục, người ta sử dụng các kỹ thuật khối phổ n lần với n thường là 2 hay đôi khi hơn.Kỹ thuật này được gọi là MS/MS hay MSn.

Nguyên tắc của các kỹ thuật này là lực chọn một ion xác định (thường làM+ nhưng cũng có thể là các ion con) trong các ion của lần ion hoá thứ nhất và loại bỏtất cả các ion khác trong bộ phận phân tích ion Các ion này sau đó được cho tiếp xúcvới 1 lượng nhỏ các khí (thường là argon) Với vận tốc cao, các ion này sẽ va đập vàocác phân tử khí và phân thành các mảnh nhỏ hơn Các ion sinh ra trong lần phân mảnhthứ 2 này sẽ được phân tích và ghi nhận phổ MS, Vì phổ khối ghi nhận được chỉ từ 1loại ion duy nhất nên không còn bị ảnh hưởng của các tạp chất trong mẫu nữa Việcnhận định kết quả trên phổ MS/MS sẽ chính xác hơn, đặc biệt khih hàm lượng chấtphân tích thấp và năm trong hỗn hợp phức tạp.

Với bẫy ion, cả 3 giai đoạn trên đều xảy tra trong bẫy theo trình tự thời gian Vìcác ion được giữ lại trong bẫy nên việc phân mảnh có thể được thực hiện thêm nhiềulần nữa, Tuy nhiên, độ nhạy của kỹ thuật này ở các lần sau giảm đi nhanh chóng do sốion giảm, Trên thực tế, người ta thường chỉ sử dụng MS2.

Ngoài hai thiết kế cơ bản trên, còn có các loại lai khác như: Q-Trap (kết hợpgiữa tứ cực và bẫy ion), Q-Tof (kết hợp giữa tứ cực và TOF), IT-Tof (kết hợp giữa bẫyion và TOF)… Các loại thiết bị này kết nối với GC, HPLC…hiện có mặt trên thịtrường.

Một phương tiện rất hữu hiệu trong phân tích các chất, đặc biệt là trong phântích các chất có nguồn gốc tự nhiên Phổ khối cho nhiều thông tin về các trúc để xácđịnh cấu trúc một chất mới hay định danh một chất đã biết Phổ khối có độ nhạy cao,khoảng tuyến tính động học rộng rất thích hợp cho phân tích định lượng, đặc biệt làtrong phân tích vết.Khi kết hợp với hệ thống sắc ký, phổ khối có thể sử dụng như mộtdetector phổ thông, phát hiện hầu hết các chất nhưng với chế độ chọn lọc ion nó lại làdetector chọn lọc cho những chất xác định rất có ích trong việc định lượng các chấttrong một hỗn hợp phức tạp Các thiết bị phổ khối ngày càng nhạy và tin cậy hơn; giớihạn phân tích khối ngày càng mở rộng; việc sử dụng ngày càng dễ dang và giá thànhngày càng hạ, Điều này làm cho thiết bị khổ phối dần trở thành các phương tiện phântích thường quy trong phân tích dược liệu.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Lá sen được thu hái tại khu vực quận 7, thành phố Hồ Chí Minh.

- Lá sen thu hái gồm 2 dạng: một loại lá còn non, lá còn cuộn lại, chiều dài khoảng từ 10-15cm và một loại lá đã trưởng thành (lá xòe rộng đường kính từ20-30cm).

Hình 2.1: Lá sen non Hình 2.2: Lá sen trưởng thành

2.2 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm

Dụng cụ thí nghiệm

- Máy sấy; Máy cô quay chân không; Máy lọc chân không.

- Máy lắc; Hệ thống chạy khối phổ MS; Máy quang phổ UV-Vis 2000- Bể điều nhiệt; Bếp đun cách thủy.

Hóa chất

- Thuốc thử Folin-Ciocateau của hãng Sigma; Dung dịch Na2CO3 bão hòa 20%; Acid Gallic.

- Rutin, dung dịch AlCl3 2%, đệm photphast (pH=6,6)

- Vitamin C ; 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), Methanol- Dung dịch FeCl3 0,1%; dung dịch K3Fe(CN)6 1% ; CCl3COOH 10%- Chloroform, NH4OH 25%, H3PO4 3%, NH4OH 10%.

- Ethanol 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, PE, Cloroform, Ethyl acetate.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3 Phương pháp thí nghiệm

Sơ đồ tiến trình thí nghiệm

Lá sen trưởngthành và lá non

Vi phẫu lá còn tươiSấy khôĐịnh tính sơ bộ

Ngâm dầm trong cồn với cácnồng độ khác nhau

Polyphenol tổng sốFlavonoid tổngAlkaloid tổng số

Thu caoĐịnh lượng một số

hợp chất thức cấpThử hoạt tínhkháng oxy hóa

Xác định hàmlượng cao thu được

Xác định TPHH bằngphương pháp LC-MSHình 2.3: Sơ đồ tiến trình thí nghiệm

2.3.1 Phương pháp vi học kiểm nghiệm dược liệu

Nhuộm vi phẫu