Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng ức chế α – glucosidase của lá sa kê artocarpus altilis (parkinson) fosberg, moraceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN THỊ ÁNH HỒNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ α – GLUCOSIDASE CỦA LÁ SA KÊ ARTOCARPUS ALTILIS (PARKINSON) FOSBERG, MORACEAE LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN THỊ ÁNH HỒNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ α – GLUCOSIDASE CỦA LÁ SA KÊ ARTOCARPUS ALTILIS (PARKINSON) FOSBERG, MORACEAE LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: Ts TRẦN THỊ VÂN ANH Chuyên ngành: Dược Học Cổ Truyền Mã số: 60 72 04 06 Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Thị Ánh Hồng TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học – Năm học 2015-2017 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ α – GLUCOSIDASE CỦA LÁ SA KÊ (ARTOCARPUS ALTILIS (PARKINSON) FOSBERG, MORACEAE) Nguyễn Thị Ánh Hồng Giảng viên hướng dẫn: TS Trần Thị Vân Anh Đặt vấn đề: Trong dân gian, Sa kê sử dụng để chữa phù thũng, viêm gan vàng da, chữa gút, đái tháo đường, hạ huyết áp Lá Sa kê sử dụng bánh tẻ (SK-xanh) vàng vừa rụng (SK-vàng), nhiên chưa có cơng trình so sánh đánh giá tác dụng Sa kê thời điểm thu hái khác Do đó, đề tài tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học theo hướng tác dụng ức chế α - glucosidase Sa kê (Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg) để có sở khoa học cho việc sử dụng Sa kê chữa bệnh Phương pháp nghiên cứu: Phân tích sơ thành phần hóa học dược liệu Sa kê theo phương pháp Ciuley cải tiến Nghiên cứu thành phần hóa học sử dụng phương pháp sắc kí cột nhanh, sắc ký cột cổ điển pre – HPLC Các phân đoạn chiết tách định hướng theo kết thử nghiệm hoạt tính ức chế α-glucosidase Cấu trúc chất phân lập xác định phổ MS NMR Các chất phân lập đánh giá hoạt tính ức chế α-glucosidase xác nhận diện cao nguyên liệu UPLC Kết quả: Thành phần hóa học SK – xanh SK – vàng tương đồng có diện nhóm hợp chất flavonoid, saponin, tannin, triterpenoid, antraquinon, chất khử Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase cao chiết nước cao chiết cồn SK-xanh SK-vàng cho thấy cao chiết cồn SK vàng có hoạt tính tốt (IC50 = 40,33 µg/ml) kg bột Sa kê chiết ngấm kiệt với cồn 96% thu 400 g dịch chiết đậm đặc Tiến hành lắc phân bố lỏng-lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần thu 146,38 cao ether dầu hỏa, 88,8 g cao dicloromethan (SK-B), 31,85g cao ethyl acetat 11 g cao buthanol bão hịa nước, 40g cao nước Cao DCM (SK-B) có hoạt tính ức chế enzyme tốt (IC50 = 18,31 µg/ml) Bằng kĩ thuật sắc kí, từ cao DCM phân lập chất XK-1, XK-2, XK-3 xác định 2’,4’,4-trihydroxy-2,3-[2-methyl-2-(4-methylpent-3-enyl)-pyran] dihydrochalcon; 8-geranyl-4,5,7-trihydroxyflavon ((E)-8-(3,7dimethylocta-2,6-dienyl)-5,7-dihydroxy-2-(4hydroxyphenyl)chroman-4-on); 2-geranyl – 2’, 3, 4, 4’ – tetrahydroxyldihydrochalcon Định tính UPLC cho thấy XK1, XK2, XK3 thành phần cao tồn phần có tác dụng ức chế α-glucosidase Kết thử hoạt tính ức chế α-glucosidase cho thấy chất XK1(IC50 = 81,32 µM), XK2 (IC50 = 54,53µM) thể hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase XK3 khơng thể hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase nồng độ khảo sát so với chứng dương Arcabose Kết luận: Lá Sa kê vàng có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase tốt Sa kê xanh chiết với dung mơi cồn Thành phần hóa học có tác dụng ức chế enzyme tập trung phân đoạn phân cực phân cực trung bình chất phân lập từ cao diclomethan SK-vàng geranyl flavonoid có tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase THESIS FOR THE DEGREE MASTER OF PHARMACY – Course 2015 – 2017 BIO-ASSAY GUIDED ISOLATION OF ALPHA-GLUCOSIDASE INHIBITORY CONSTITUENTS FROM THE LEAVES OF ARTOCARPUS ALTILIS (PARKINSON) FOSBERG, MORACEAE By: Nguyen Thi Anh Hong Supervisor: PhD Tran Thi Van Anh ABSTRACT Introduction: Artocarpus altilis (Sake) leaves are used in Vietnam as a traditional medicine for the treatment of edema, hepatitis jaundice, gout, diabetes and high blood pressure People can use green leaves (SK – green) and fell yellow leaves (SK – yellow); however, there is no research on comparing and evaluating the chemical constituents of SaKe leaves which are collected in different time Therefore, the purpose of this study was to investigate the chemical constituents of Artocarpus altilis for inhibitory activity against α – glucosidase to have a scientific evidence for using Sake leaves Method: Preliminary identification of chemical compositions of Sake leaves were conducted by modified Ciuley method For separation and isolation, different column chromatography techniques (vaccumn column chromatography, classical column chromatography and pre-HPLC ) were used The fractions were tested for their inhibitory activity against alpha-glucosidase in vitro The chemical structures of isolated compounds were identified by spectroscopic methods including NMR and MS Finally, isolated compounds were assayed for their inhibitory activity against α-glucosidase and confirmed their presence in crude extract by UPLC method Results: Chemical constituents of SK – green leaves and SK – yellow leaves were similar The study revealed the presence of flavonoids, saponins, tannins, triterpenoids, antraquinons and reductants compounds Screening water extract and alcohol extract of SK-green leaves and SK-yellow leaves in bio-assay revealed that alcohol extract of SK-yellow leaves have the strongest inhibition activity against α-glucosidase with IC50 = 40.33µg/ml SK-yellow leaves powder (4 kg) were percolated with 96 % ethanol to yield 400 g crude extracts The ethanol extract was suspended in water and further fractionated successively with petroleum ether, dichloromethane, ethyl acetat and buthanol to yield petroleum ether extracts (146.38 g), dicloromethane extracts (88.8 g) and ethyl acetat extracts (31,85 g), buthanol extracts (11 g), water extracts (40 g) Dicloromethane extracts showed the strongest inhibitoty activity against α-glucosidase with IC50 = 18,31 µg/ml From dicloromethan extract, three compounds (XK-1, XK-2, XK-3) were isolated The structures of three compounds were determined to be 2’,4’,4-trihydroxy-2,3-[2-methyl-2-(4-methylpent-3-enyl)-pyran] dihydrochalcone; 8-geranyl-4,5,7-trihydroxyflavone ((E)-8-(3,7- dimethylocta-2,6-dienyl)-5,7-dihydroxy-2(4- hydroxyphenyl)chroman-4-on); 2-geranyl – 2’, 3, 4, 4’ – tetrahydroxyldihydrochalcone, respectively The qualitative analysis with UPLC method showed that XK1, XK2, XK3 were the major components of active extract XK1 and XK2 inhibited α-glucosidase with IC50 = 81.32 μM and 54.53 μM, respectively XK3 did not show α-glucosidase inhibitory activity with the investigated concentrations compared to the positive control of arcabose Conclusions: SK – yellow leaves have a stronger α-glucosidase inhibitory activity than that of SK - green leaves when they were extracted with alcohol The major chemical compositions having inhibitory αglucosidase activity are concentrated in the less-polar and moderately polarized fractions Three compounds isolated from dichloromethan extract of SK-yellow leaves are geranyl flavonoids which have inhibitory activity against α-glucosidase MỤC LỤC MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC SƠ ĐỒ x CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ CHI ARTOCAPUS J R FORST & G FORST 2.1.1 Vị trí phân loại thực vật chi Artocapus J R Forst & G Forst 2.1.2 Đặc điểm thực vật chi Artocarpus J R Forst & G Forst 2.1.3 Một số loài chi Artocarpus J R Forst & G Forst phân bố 2.1.4 Thành phần hóa học chi Artocarpus J R Forst & G Forst 2.1.5 Tác dụng dược lý số loài thuộc chi Artocarpus J R Forst & G Forst 2.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY SA KÊ 12 2.1 Đặc điểm thực vật học Sa kê 12 2.2.2 Phân bố 14 2.2.3 Bộ phận dùng 14 2.2.4 Thành phần hóa học .15 2.2.5 Tác dụng dược lý .22 2.2.6 Nghiên cứu độc tính cấp .26 2.2.7 Công dụng Sa kê .26 2.2.8 Một số thuốc có Sa kê 27 CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .28 3.1.1 Nguyên liệu 28 3.1.2 Dụng cụ trang thiết bị 28 3.1.3 Hóa chất, thuốc thử 29 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.2.1 Kiểm tra nguyên liệu .30 3.2.2 Xác định độ ẩm dược liệu 31 3.2.3 Xác định sơ thành phần hóa học 31 3.2.4 Nghiên cứu thành phần hóa học 31 3.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzym α – glucosidase .34 3.2.6 Định tính phương pháp sắc ký lỏng siêu cao áp (UPLC) .38 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40 4.1 Kiểm tra nguyên liệu .40 4.1.1 Mô tả hình thái 40 4.1.2 Định danh dược liệu 40 4.1.3 Khảo sát vi học 40 4.2 Hàm lượng chất chiết .43 4.3 Xác định sơ thành phần hóa thực vật Sa kê 44 4.4 Khảo sát sơ thành phần hóa học SK–xanh SK-vàng theo định hướng ức chế α-glucosidase 45 4.4.1 Thử hoạt tính ức chế α-glucosidase cao chiết SK-xanh SK-vàng 45 4.4.2 Khảo sát sơ thành phần hóa học SK-vàngvà SK-xanh SKLM .46 4.4.3 Khảo sát sơ thành phần hóa học SK-vàng SK-xanh UPLC .47 4.5 Nghiên cứu thành phần hóa học XK-vàng 48 4.5.1 Chiết xuất cao 48 4.5.2 Phân tách cao chiết toàn phần 48 4.5.3 Phân tách cao DCM (SK-B) 53 4.5.4 Xác định cấu trúc chất phân lập .68 4.6 Định tính XK1, XK2, XK3 cao tồn phần UPLC 77 4.7 Thử hoạt tính ức chế α-glucosidase chất phân lập 77 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .79 5.1 Kết luận 79 5.1.1 Kiểm tra nguyên liệu Sa kê .79 5.1.2 Thử hoạt tính ức chế enzym α – glucosidase SK-xanh XKvàng 79 5.1.3 Khảo sát sơ thành phần hóa học SK-xanh SK-vàng SKLM UPLC .80 5.1.4 Nghiên cứu thành phần hóa học SK-vàng theo định hướng ức chế enzym α – glucosidase 80 5.2 Bàn luận đề nghị 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………… 100 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt 13 C-NMR H-NMR Chữ nguyên 13 C-Nuclear Magnetic Resonance H-Nuclear Magnetic Resonance Ý nghĩa Cộng hưởng từ hạt nhân C13 Cộng hưởng từ hạt nhân proton COSY Correlated Spectroscopy Phổ tương quan 1H – 1H d doublet Đỉnh đôi DCM Dichloromethane Dicloromethan dd doublet of doublets Đỉnh đôi kép DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid EA Ethyl acetate Ethyl acetat HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ HMBC HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ HSQC IC50 Inhibitor concentration 50% Nồng độ ức chế 50% J coupling constant Hằng số ghép J m multiplet Nhiều đỉnh, đỉnh bội MS Mas spectrometry Khối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân pNG p-nitrophenyl-α-D-glucospyranoside p-nitrophenyl-α-Dglucospyranoside s singlet Đỉnh đơn SKLM Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng tR Retention time Thời gian lưu XK Sa kê UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng siêu cao áp UV Ultra violet (Phổ) tử ngoại VLC Vacuum liquid chromatography Sắc ký (cột) chân không VS Vanilin - sulfuric Thuốc thử Vanilin-sulfuric DANH MỤC HÌNH Hình Một số thành phần phân lập từ chi Artocarpus Hình 2.2 Cây Sa kê 13 Hình 2.3 Lá Sa kê 14 Hình 2.4 Hoa Sa kê 14 Hình 2.5 Quả Artocarpus altilis var nonseminifera 14 Hình 2.6 Quả Artocarpus altilis var seminifera .14 Hình Lá Sa kê nguyên liệu 40 Hình Tế bào lỗ khí kiểu hỗn bào biểu bì Sa kê .41 Hình Hình vi phẫu gân Sa kê 42 Hình 4.4 Hình vi phẫu phiến Sa kê .42 Hình 4.5 Hình soi bột Sa kê 43 Hình 4.6 SKLM phân tích thành phần cao VC XC 46 Hình 4.7 Sắc ký đồ định tính cao cồn SK-vàngbằng UPLC bước sóng 276 nm 47 Hình Sắc ký đồ UPLC phân tích mẫu cao phân đoạn từ SK-vàng 52 Hình 4.9 SKLM phân đoạn phân lập từ cao DCM .54 Hình 4.10 SKLM phân đoạn B – B-6-5 .56 Hình 11 SKLM kết chạy cột phân đoạn B-6-5 .57 Hình 12 Kết chạy cột phân đoạn B-6-5-F 59 Hình 13 SKLM kiểm tra tinh khiết chất XK1 .59 Hình 14 Sắc ký đồ thử tinh khiết chất XK1 UPLC 60 Hình 15: SKLM phân đoạn B-9 B-9 -5 61 Hình 16 Sắc ký đồ phân đoạn B-9-5 sau pre - UPLC 62 Hình 17: SKLM kiểm tra tinh khiết chất XK2 63 Hình 18: Kết thử tinh khiết chất XK2 UPLC 63 Hình 19 SKLM phân đoạn B-10 .64 Hình 20 SKLM chạy cột phân đoạn B-10-5 65 Hình 21 SKLM chạy cột phân đoạn B-10-5-9 66 Hình 22: SKLM kiểm tinh khiết XK3 67 Hình 23 Kết thử tinh khiết chất XK3 UPLC 67 Hình 24 Phổ UV chất XK1 .69 Hình 25 Cấu trúc chất XK1 tương tác HMBC quan trọng 71 Hình 26 Phổ UV chất XK2 72 Hình 27 Cấu trúc chất XK2 tương tác HMBC COSY quan trọng 74 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-26 Phụ lục 35: Phổ HSQC XK2 (CDCl3) Phụ lục 36: Phổ HSQC XK2 trích vùng 75-130; 4,5 – 7,5 ppm (CDCl3) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-27 Phụ lục 37: Phổ HSQC XK2 trích vùng 15-45; 1,2 – 3,4 ppm (CDCl3) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-28 Phụ lục 38: Phổ khối MS XK3 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-29 Phụ lục 39: Phổ 1H-NMR XK3 (CDCl3, 500 MHz) Phụ lục 40: Phổ 1H-NMR XK3 trích vùng 5-7,8 ppm (CDCl3, 500 MHz) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-30 Phụ lục 41: Phổ 1H-NMR XK3 trích vùng 1,6-3,5 ppm (CDCl3, 500 MHz) Phụ lục 42: Phổ 13C-NMR XK3 (CDCl3, 125 MHz) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-31 Phụ lục 43: Phổ 13C-NMR XK3 (CDCl3, 125 MHz) Phụ lục 44: Phổ 13C-NMR XK3 trích vùng 100-165ppm (CDCl3, 125 MHz) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-32 Phụ lục 45: Phổ 13C-NMR XK3 trích vùng 15-41ppm (CDCl3, 125 MHz) Phụ lục 46: Phổ COSY XK3 (CDCl3) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-33 Phụ lục 47: Phổ COSY XK3 trích vùng 6,2 -7,6 ppm (CDCl3) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-34 Phụ lục 48: Phổ COSY XK3 trích vùng 1,5 -5,5 ppm(CDCl3) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-35 Phụ lục 49: Phổ HMBC XK3 (CDCl3) Phụ lục 50: Phổ HMBC XK3 trích vùng từ 105 – 205; 6,4 – 7,6 ppm(CDCl3) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-36 Phụ lục 51: Phổ HMBC XK3 trích vùng từ 120 – 205; 1,4 – 3,6 ppm (CDCl3) Phụ lục 52: Phổ HMBC XK3 trích vùng từ 15 – 40; 4,8 – 6,8ppm (CDCl3) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-37 Phụ lục 53: Phổ HMBC XK3 trích vùng từ 15 – 45; 1,5 – 3,5 ppm (CDCl3) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-38 Phụ lục 54: Phổ HSQC XK3 (CDCl3) Phụ lục 55: Phổ HSQC XK3 trích vùng 100 – 135; – 7,5 ppm (CDCl3) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-39 Phụ lục 56: Phổ HSQC XK3 trích vùng 14 – 42; 1,2 – 3,6 ppm (CDCl3) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-40 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN THỊ ÁNH HỒNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ α – GLUCOSIDASE CỦA LÁ SA KÊ ARTOCARPUS ALTILIS (PARKINSON) FOSBERG, MORACEAE. .. khác Tác giả Nguyễn Thị Ánh Hồng TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học – Năm học 2015-2017 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ α – GLUCOSIDASE CỦA LÁ SA KÊ (ARTOCARPUS. .. theo hướng tác dụng ức chế α - glucosidase Sa kê (Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg) để có sở khoa học cho việc sử dụng Sa kê chữa bệnh Phương pháp nghiên cứu: Phân tích sơ thành phần hóa học