Nghi n cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của lá cây cà na (elaeocarpus hygrophilus kurz) (2)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH - TRÌ KIM NGỌC NGHI N CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ CÂY CÀ NA (Elaeocarpus hygrophilus Kurz) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH - TRÌ KIM NGỌC NGHI N CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ CÂY CÀ NA (Elaeocarpus hygrophilus Kurz) Ngành: Dƣợc liệu - Dƣợc học cổ truyền Mã số: 8720206 Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VÕ VĂN LẸO Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 LỜI CẢM ƠN Lời em xin chân thành bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc đến Thầy TS Võ Văn Lẹo, người hướng nghiên cứu, bảo tận tình, động viên, quan tâm lo lắng cho em trình thực luận văn Em xin cám ơn Thầy PGS.TS Trần Hùng quan tâm tạo điều kiện thuận lợi cho em bạn thực luận văn tốt nghiệp Em xin cám ơn Thầy TS Nguyễn Viết Kình Cô PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương dành thời gian để đọc phản biện luận văn giúp luận văn em hoàn thiện hơn, đồng thời Thầy giảng dạy cho chúng em nhiều điều cần biết nghiên cứu khoa học Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Bộ môn Dược liệu trường Đại học y dược TP Hồ Chí Minh truyền đạt cho chúng em kiến thức chuyên môn thật sâu sắc Cảm ơn anh chị giảng viên, nghiên cứu viên, cô, chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em hoàn thành luận văn Xin gửi lời cảm ơn anh, chị, bạn lớp cao học Dược liệu 2016 – 2018 sát cánh bên nổ lực vượt qua khó khăn suốt q trình học tập nhiệt tình giúp đỡ em suốt thời gian qua Lời cảm ơn cuối em xin dành cho gia đình, người ln quan tâm, chăm sóc tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành tốt đề tài Trì Kim Ngọc LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Trì Kim Ngọc v TĨM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dƣợc học – Năm học 2016-2018 NGHI N CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY CÀ NA (Elaeocarpus hygrophilus Kurz) Trì Kim Ngọc Giảng viên hƣớng dẫn: TS Võ Văn Lẹo Mở đầu Cà na (Elaeocarpus hygrophilus Kurz, Elaeocarpaceae) mọc hoang nhiều tỉnh miền Tây Các cơng trình nghiên cứu giới lồi gần nhƣ dừng lại quả, cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học phận khác Cà na Do luận văn đƣợc thực với mục tiêu phân lập hợp chất từ Cà na theo định hƣớng tác dụng chống oxy hóa mơ hình DPPH Đối tƣợng: Lá Cà na (Elaeocarpus hygrophilus Kurz), 14 kg khô Phƣơng pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa phân đoạn cao chiết chất phân lập đƣợc mơ hình DPPH Sử dụng phƣơng pháp chiết phân bố lỏng - lỏng, sắc ký cột chân không, sắc ký cột cổ điển phƣơng pháp tinh chế khác để phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa mạnh Xác định cấu trúc dựa vào liệu phổ UV, phổ khối phổ NMR Kết bàn luận Kết thử nghiệm DPPH cho thấy khả chống oxy hóa cao giảm dần: Cao ethyl acetat (84,62 %) > cao nƣớc (66,4 %) > cao cloroform (25,81 %) > cao n-hexan (2,74 %) Do cao ethyl acetat đƣợc tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học Phân lập đƣợc chất: acid 3-Omethyl ellagic 4’-O-α-rhamnopyranosid (564,00 mg), 3-O-methyl myricetin (8,00 mg), quercetin (12,00 mg), myricetin (430,00 mg), acid gallic (67,00 mg) myricitrin (79,65 mg) IC50 chất phân lập đƣợc giảm dần theo thứ tự: quercetin (IC50 = 4,7 µmol/l) > myricetrin (IC50 = 9,1 µmol/l) > acid gallic (IC50 = 9,4 µmol/l) > myricetin (IC50 = 10,7 µmol/l) > acid ascorbic (IC50 = 13,1µmol/l) > 3-O-methyl myricetin (IC50 = 13,6 µmol/l) Kết luận: từ cao ethyl acetat thu đƣợc chất tinh khiết: Khối lƣợng chất thu đƣợc tƣơng đối nhiều, hƣớng tới việc xây dựng chất chu n d ng kiểm nghiệm dƣợc liệu, chế ph m ho c sử dụng nghiên cứu tác dụng sinh học vi Thesis of master of pharmacy, course: 2016-2018 Major: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy BIOACTIVE-GUIDED ISOLATION FOR THE ANTIOXIDANT CONSTITUENTS OF ELAEOCARPUS HYGROPHILUS KURZ Tri Kim Ngoc Supervisor: Dr Vo Van Leo Introduction Elaeocarpus hygrophilus Kurz is a wild grow in the western provinces Until now there have been few studies on the chemical composition and bio-activity of leaves and other parts of the plant As a result, in this thesis our aim is to carry out a bio-guided isolation for the antioxidant components on DPPH of Elaeocarpus hygrophilus leaves Materials: Elaeocarpus hygrophilus leaves (14 kg of dry leaves) Methods In vitro screening of fractions, isolating compounds for the antioxidant activity on DPPH assay Distribution of liquid-liquid extraction, vacuum liquid chromatography, silica gel column chromatography, and recrystallization of crystals in suitable solvents Structure elucidations were based on NMR and MS methods Results and discussions DPPH assay showed that the antioxidant activity of extracts was as follows: ethyl acetat extract (84.62 %) > water extract (66.4 %) > chloroform extract (25.81 %) > n-hexan extract (2.74 %) Therefore, ethyl acetat extract was chosen for isolations later substances were obtained: 3-Omethylellagic acid 4’-O-α-rhamnopyranosid (564 mg), 3-O-methyl myricetin (8 mg), quercetin (12 mg), myricetin (430 mg), acid gallic (67 mg) and myricitrin (79.65 mg) IC50 values of substances isolated and extracts comparing with vitamin C were as follows: quercetin (IC50 = 4.7 µmol/l) > myricitrin (IC50 = 9.1 µmol/l) > acid gallic (IC50 = 9.4 µmol/l) > myricetin (IC50 = 10.7 µmol/l) > vitamin C (IC50 = 13.1 µmol/l) > 3-O-methyl myricetin (IC50 = 13.6 µmol/l) Conclusions: substances were obtained from EtOAc extract of Elaeocarpus leaves They can be standardized for conference standards using in biotests, in quality control of Elaeocarpus leaves or preparations related vii MỤC LỤC TÓM TẮT LUẬN VĂN v MỤC LỤC vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC CÁC BẢNG xi DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ xii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đ c điểm chi Elaeocarpus 1.1.3 Đ c điểm Cà na Elaeocarpus hygrophilus 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.3 TÁC DỤNG DƢỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG CỦA CÂY CÀ NA 11 1.3.1 Tác dụng dƣợc lý 11 1.3.2 Công dụng y học cổ truyền 12 1.4 MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA 12 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 17 2.1.1 Nguyên liệu 17 2.1.2 Dung mơi hóa chất 17 2.1.3 Dụng cụ, trang thiết bị 17 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Nghiên cứu thực vật học 18 2.2.2 Thử tinh khiết 19 2.2.3 Xác định hàm lƣợng chất chiết đƣợc dƣợc liệu 19 2.2.4 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 20 2.2.5 Chiết xuất cao toàn phần 20 2.2.6 Tách phân đoạn chiết phân bố lỏng – lỏng 20 2.2.7 Phƣơng pháp sàng lọc tác dụng chống oxy hóa mơ hình in vitro 21 2.2.8 Phân lập tinh chế chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa 23 viii 2.2.9 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc 24 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 NGHIÊN CỨU THỰC VẬT HỌC 26 3.1.1 Đ c điểm hình thái 26 3.1.2 Đ c điểm vi phẫu 27 3.1.3 Soi bột Cà na (40X) 31 3.2 THỬ TINH KHIẾT 32 3.2.1 Xác định độ m 32 3.2.2 Xác định độ tro 32 3.3 HÀM LƢỢNG CHẤT CHIẾT ĐƢỢC TRONG LÁ CÀ NA 32 3.4 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 33 3.4.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 33 3.4.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn 34 3.4.3 Chiết xuất, tách phân đoạn từ cao toàn phần 36 3.4.4 Kiểm tra khả chống oxy hóa cao chiết phân đoạn 38 3.4.5 Phân lập chất từ cao EA 40 3.4.6 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập đƣợc SKLM 46 3.4.7 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập đƣợc UPLC 50 3.4.8 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc 54 3.4.9 Tóm tắt kết q trình chiết xuất phân lập 80 3.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA TRÊN CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC 80 3.5.1 Định tính SKLM 80 3.5.2 Thử HTCO chất phân lập phƣơng pháp DPPH 81 Chƣơng - BÀN LUẬN 90 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 93 KẾT LUẬN 93 ĐỀ NGHỊ 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 PHỤ LỤC PL-1 ix DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ nguyên Chữ tắt Ý nghĩa 13 13 Cộng hƣởng từ hạt nhân C13 1 Cộng hƣởng từ hạt nhân proton C-NMR H-NMR C-Nuclear Magnetic Resonance H-Nuclear Magnetic Resonance br broad Đỉnh rộng d doublet Đỉnh đôi DĐVN Dƣợc điển Việt Nam DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO dimethyl sulfoxide DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EA Ethyl acetate FRAP Ferric reducing antioxidant power HMBC HSQC Thử nghiệm đánh giá khả khử ion sắt III Hetherronuclear Multiple Bond Correlation Hetherronuclear Single Quantum Correlation HTCO Hoạt tính chống oxy hóa IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% IR Infrared Specroscopy Phổ hồng ngoại J Coupling constant Hằng số ghép m multiplet Nhiều đỉnh MDA Malonyl dialdehyde MeOH Methanol x Chữ nguyên Chữ tắt Ý nghĩa MHz Mega Hertz MS Mass Spectroscopy Phổ khối NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân ppm parts per million Phần triệu PDA Photodiode Array Dãy diod quang ROS Rective oxygen species s singlet SKC Sắc ký cột SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng t triplet TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử UV-Vis Ultraviolet and Visible Tử ngoại khả kiến VLC Vacuum liquid chromatography Sắc ký (cột) chân không VS Vanillin-sulfuric acid Đỉnh đơn Đỉnh ba Thuốc thử vanillin 1% cồn acid sulfuric 5% cồn PL-44 Phụ lục 57 Phổ 13C-NMR EH-6 (Myricitrin) đo DMSO-d6 (125 MHz) Phụ lục 58 Phổ 13C-NMR EH-6 đo DMSO-d6 (vùng C 15 – 180 ppm) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-45 Phụ lục 59 Phổ 13C-NMR EH-6 đo DMSO-d6 (vùng C 70 – 110 ppm) Phụ lục 60 Phổ 1H-NMR EH-6 đo DMSO-d6 (500 MHz) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-46 Phụ lục 61 Phổ 1H-NMR EH-6 đo DMSO-d6 (vùng H 4,0 – 7,0 ,ppm) Phụ lục 62 Phổ 1H-NMR EH-6 đo DMSO-d6 (vùng H 0,5 –4,0 ,ppm) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-47 Phụ lục 63 Phổ 1H-NMR EH-6 đo DMSO-d6 (vùng H 3,0 –4,1 ,ppm) Phụ lục 64 Phổ COSY EH-6 đo DMSO-d6 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-48 Phụ lục 65 Phổ COSY EH-6 đo DMSO-d6 (vùng H 1,0 – 7,0 ppm) Phụ lục 66 Phổ COSY EH-6 đo DMSO-d6 (vùng H 3,0 – 5,4 ppm) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-49 Phụ lục 67 Phổ COSY EH-6 đo DMSO-d6 (vùng H 3,0 – 4,0 ppm) Phụ lục 68 Phổ COSY EH-6 đo DMSO-d6 (vùng H 1,0 – 3,5 ppm) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-50 Phụ lục 69 Phổ DEPT EH-6 đo DMSO-d6 Phụ lục 70 Phổ DEPT EH-6 đo DMSO-d6 ( C 15 – 110 ppm) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-51 Phụ lục 71 Phổ HMBC EH-6 đo DMSO-d6 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-52 Phụ lục 72 Phổ HMBC EH-6 đo DMSO-d6 (vùng H 5,0 – 13,0; C 90 – 180 ppm) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-53 Phụ lục 73 Phổ HMBC EH-6 đo DMSO-d6 (vùng H 5,0 – 7,0 ; C 90 – 165 ppm) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-54 Phụ lục 74 Phổ HMBC EH-6 đo DMSO-d6 (vùng H 5,0 – 13,0; C 90 – 180 ppm) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-55 Phụ lục 75 Phổ HSQC EH-6 đo DMSO-d6 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-56 Phụ lục 76 Phổ HSQC EH-6 đo DMSO-d6 (vùng H 5,0 – 7,0 ppm; C 91 – 110 ppm) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-57 Phụ lục 77 Phổ HSQC EH-6 đo DMSO-d6 (vùng H 3,0 – 4,1 ppm; C 68 – 73 ppm) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-58 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... Có cơng trình nghi? ?n cứu thành ph? ?n hóa học hoạt tính sinh học ph? ?n khác Cà na Đây ngu? ?n nguy? ?n liệu có tiềm n? ?ng, nhƣng chƣa đƣợc khai thác sử dụng mức Do đề tài ? ?Nghi? ?n cứu thành ph? ?n hóa học. .. định hƣớng tác dụng chống oxy hóa mơ hình DPPH Đối tƣợng: Lá Cà na (Elaeocarpus hygrophilus Kurz), 14 kg khô Phƣơng pháp nghi? ?n cứu Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa ph? ?n đo? ?n cao chiết chất ph? ?n. .. cơng trình nghi? ?n cứu giới loài g? ?n nhƣ dừng lại quả, cơng trình nghi? ?n cứu thành ph? ?n hóa học hoạt tính sinh học ph? ?n khác Cà na Do lu? ?n v? ?n đƣợc thực với mục tiêu ph? ?n lập hợp chất từ Cà na