Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của cây tía tô dại ( hyptis suaveolens (l ) poit , lamiaceae )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH TRẦN NGỌC TÍN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA CỦA CÂY TÍA TƠ DẠI (HYPTIS SUAVEOLENS (L.) POIT., LAMIACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH TRẦN NGỌC TÍN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA CỦA CÂY TÍA TƠ DẠI (HYPTIS SUAVEOLENS (L.) POIT., LAMIACEAE) NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYÈN Mà SỐ: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VÕ VĂN LẸO THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các kết quả, số liệu trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Trần Ngọc Tín TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC – KHÓA 2019 – 2021 Ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền – Mã số: 8720206 Đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa Tía tơ dại (Hyptis suaveolens (L.) Poit., Lamiaceae) Học viên thực : Trần Ngọc Tín Người hướng dẫn khoa học : TS Võ Văn Lẹo Mở đầu Tía tơ dại – Hyptis suaveolens L (Poit), dược liệu dùng y học dân gian khu vực châu Á, để chữa cảm cúm, sốt, đau đầu, bệnh đường tiêu hóa, bệnh ngồi da…Bên cạnh đó, nghiên cứu cho thấy lồi có tác dụng dược lý tiềm kháng viêm, chống đái tháo đường, kháng ung thư, bào vệ gan… Tuy nhiên, cơng trình nghiên cứu lồi Việt Nam cịn hạn chế Từ đó, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa Tía tơ dại Hyptis suaveolens (L.) Poit., Lamiaceae.”đã thực Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng phận mặt đất Hyptis suaveolens L (Poit.) thu hái Ninh Thuận Đề tài sử dụng phương pháp sàng lọc tác dụng chống oxy hóa cao phân đoạn chất phân lập thử nghiệm DPPH Sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt, chiết phân bố lỏng-lỏng, sắc ký cột cổ điển phương pháp tinh chế khác để phân lập hợp chất tinh khiết từ phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa Việc xác định cấu trúc dựa vào phổ MS NMR Kết bàn luận Mô tả đặc điểm hình thái, giải phẫu cấu tử đặc trưng bột dược liệu Hyptis suaveolens Từ 10 kg bột dược liệu, thu phân đoạn Hs-H (47 g), Hs-C (97 g), Hs-E (77 g) Hs-W (600 g) Hoạt tính chống oxy hóa cao giảm dần theo thứ tự: Hs-E (IC50 = 9,50 ± 0,02 µg/ml) > Hs-W (IC50 = 42,21 ± 0,07 µg/ml) > Hs-C (IC50 = 50,69 ± 0,02 µg/ml) > Hs-H (IC50 = 464,24 ± 0,67 µg/ml) Từ 60g cao Hs-C thu hợp chất: acid ursolic (HSC1, 77,7 mg) acid hyptadienic (HSC2, 24,3 mg) Từ 30 g cao Hs-E phân lập hợp chất: acid tormentic (HSE1, 4mg), esculetin (HSE2, 7,5 mg) methyl rosmarinat (HSE3, 20mg) Kết thử hoạt tính chống oxy hóa cho thấy HSE2 (IC50 =11,94 ± 0,048 µM) HSE3 (IC50 =11,25 ± 0,047 µM ) thể hoạt tính chống oxy hóa mạnh khoảng hai lần so với acid ascorbic (IC50 =29,81 ± 0,1270 µM) HSC1 HSC2 cho tác dụng chống oxy hóa tương đối thấp (IC50 > 500µg/ml) Kết luận Hai hợp chất từ phân đoạn cloroform ba hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat phân lập Trong đó, acid tormentic lần đầu phân lập loài Hyptis suaveolens , esculetin lần đầu phân lập từ chi Hyptis Esculetin methyl rosmarinat thể hoạt tính mạnh so với acid ascorbic thử nghiệm DPPH Acid ursolic acid hyptadienic thể hoạt tính tương đối yếu thử nghiệm DPPH ABSTRACT Thesis of Pharmacy Master’s degree – Academic year: 2019 – 2021 Bioactivity-guided isolation of antioxidant activity-oriented chemical constituents from the aerial parts of Hyptis suaveolens L (Poit.) Lamiaceae Tran Ngoc Tin Instructor: Dr Vo Van Leo Introduction Hyptis suaveolens L (Poit.) is a medicinal herb used in traditional medicine in many Asian countries for the treatment of flu, fever, headache, gastrointestinal diseases, and skin diseases… In addition, recent studies have also shown that this plant has other potential pharmacological effects, such as anti-inflammation, anti-diabetes, anti-cancer, and liver protection… However, research on this species in Vietnam is still limited This study was conducted to investigate compounds of antioxidant activity of Hyptis suaveolens Material and methods The aerial parts of Hyptis suaveolens were collected in Ninh Thuan Antioxidant activity was surveyed by DPPH free radical method for fractions and isolates, with percolation extraction, liquid-liquid extraction, column chromatography, and other refining methods taken into practice Chemical structures were elucidated by MS and NMR spectra Results and discussion Assessment of morpho-anatomical characteristics and feature components of medicinal powder From dried aerial parts of H.suaveolens (10 kg), five solvent-partitioned fractions were obtained from ethanol extract (2.3 l), namely, Hs-H (47 g), Hs-C (97 g), Hs-E (77 g) and Hs-W (600 g) The antioxidant activity of fractions reduces in the following order: HsE (IC50 = 9.50 ± 0.02 µg/ml), Hs-W (IC50 = 42.21 ± 0.07 µg/ml), Hs-C (IC50 = 50.69 ± 0.02 µg/ml), Hs-H (IC50 = 464.24 ± 0.67 µg/ml) From 60g of Hs-C fraction, two compounds were isolated: ursolic acid (HSC1, 77.7 mg) and hyptadienic acid (HSC2, 24.3 mg) From 30 g of Hs-E fraction, three compounds were isolated: tormentic acid (HSE1, 4mg), esculetin (HSE2, 7.5 mg), and methyl rosmarinate (HSE3, 20 mg) The results showed that HSE2 and HSE3 possessed two times higher antioxidant potential, with IC50 =11.94 ± 0.048 µM and 11.25 ± 0.047 µM respectively, in comparison with that of ascorbic acid (IC50 =29.81 ± 0.1270 µM) HSC1 and HSC2 showed moderately weak antioxidant effects (IC50 > 500µg/ml) Conclusion The isolation of chloroform fraction delivered two compounds, and ethyl acetate fraction delivered three Tormentic acid was isolated for the first time from Hyptis suaveolens, esculetin was isolated for the first time in the genus Hyptis Esculetin and methyl rosmarinate displayed stronger antioxidant activity than ascorbic acid in the DPPH assay, whereas this effect was relatively weak in the case of ursolic acid and hyptadienic acid MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG BIỂU iii DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ iv ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Vị trí phân loại .2 1.1.2 Chi Hyptis 1.1.3 Loài Hyptis suaveolens (L.) Poit 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 Thành phần hóa học số lồi thuộc chi Hyptis 1.2.2 Thành phần hóa học loài Hyptis suaveolens (L.) Poit 1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 16 1.3.1 Tác dụng dược lý chi Hyptis .16 1.3.2 Tác dụng dược lý loài Hyptis suaveolens (L.) Poit 17 1.3.3 Công dụng y học dân gian y học cổ truyền 21 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA 22 1.4.1 Cơ chế 22 1.4.2 Phương pháp DPPH 23 1.4.3 Phương pháp β-caroten / acid linoleic .23 1.4.4 Phương pháp khử sắt III (FRAP) 24 1.4.5 Phương pháp TBA – MDA .24 1.4.6 Phương pháp đo khả hấp thụ gốc oxy hóa ORAC 24 1.4.7 Phương pháp tổng lực khử - Reducing power 25 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.1.1 Nguyên liệu .26 2.1.2 Dung môi hóa chất 26 2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 26 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.2.1 Khảo sát thực vật học mẫu dược liệu 28 2.2.2 Định danh thực vật phương pháp giải trình tự ADN 28 2.2.3 Thử tinh khiết 28 2.2.4 Khảo sát thành phần hóa học .28 2.2.5 Thử hoạt tính chống oxy hóa mơ hình DPPH 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ 33 3.1 KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC 33 3.1.1 Định danh phương pháp giải trình tự ADN 33 3.1.2 Đặc điểm hình thái thực vật 33 3.1.3 Đặc điểm vi phẫu .35 3.1.4 Đặc điểm bột dược liệu .39 3.2 THỬ TINH KHIẾT .39 3.3 PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HĨA THỰC VẬT 40 3.4 KHẢO SÁT DUNG MÔI CHIẾT XUẤT CAO TOÀN PHẦN 41 3.5 CHIẾT XUẤT, KHẢO SÁT HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG SINH HỌC .41 3.5.1 Chiết xuất cao toàn phần cao phân đoạn Tía tơ dại 41 3.5.2 Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn Tía tơ dại 43 3.6 PHÂN LẬP TỪ CAO EtOAc (Hs-E) 44 3.6.1 Phân tách phân đoạn từ cao EtOAc (Hs-E) .44 3.6.2 Phân lập chất từ phân đoạn Hs-E5 46 3.6.3 Phân lập chất từ phân đoạn Hs-E3 Hs-E4 47 3.6.4 Phân lập chất từ phân đoạn Hs-E6 47 3.7 PHÂN LẬP TỪ CAO CHCl3 (Hs-C) 50 3.7.1 Phân tách phân đoạn từ cao CHCl3 (Hs-C) .50 3.7.2 Phân lập chất từ cao phân đoạn Hs-C2 53 3.8 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC CHẤT PHÂN LẬP 57 3.8.1 Chất HSC1 57 3.8.2 Chất HSC2 59 3.8.3 Chất HSE1 63 3.8.4 Chất HSE2 66 3.8.5 Chất HSE3 68 3.9 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CHẤT TINH KHIẾT .72 3.10 BÀN LUẬN 74 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC PHỤ LỤC i DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ nguyên Tiếng Việt 13C-NMR 13 C-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân 13C 1H-NMR H- Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân 1H ABTS 2,2’-Azino-Biss (3ethylbenzothiazoline-6-Sulphonic Acid) CH3COOH Acid acetic ADN Acid desoxynucleic ALP Alkaline phosphatase ALT Alanin Aminotransferase ARN Acid ribonucleic AST Aspartat aminotransferase br broad CAT Catalase COSY Correlation Spectroscopy d doublet dd doublet of doublet ddd doublet of doublet of doublet DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power Đỉnh rộng Phân đỉnh đơi Khả chống oxy hóa khử ion sắt GC-MS Gas chromatography-Mass Sắc ký khí đầu dị khối phổ spectrometry GLUT4 Glucose transporter type GSH Gluttathion HMBC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence ii HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% ID50 Inhibitory dose 50% Liều ức chế 50% IL Interleukin J Coupling constant LDH Lactase dehydrogenase m multiple MDA Malondialdehyd MeOH Methanol MPO Myeloperoxydase MS Mass Spectrometry Phổ khối lượng ORAC Oxygen radical absorbance capacity Khả hấp thu gốc Hằng số ghép Phân đỉnh phức tạp oxygen PEPCK Phosphoenolpyruvat carboxykinase PPAR Peroxisome proliferator-activated Thụ thể tăng sinh peroxisome receptor ppm Parts per milion RNS Reactive Nitrogen Species Gốc tự chứa Nito ROS Reactive Oxygen Species Gốc tự có oxy s singlet Đỉnh đơn SOD Superoxide Dismutase t triplet Đỉnh ba TNF Tumor Necrosis Factors Yếu tố hoại tử khối u t-PA tissue plasminogen activator chất hoạt hóa plasminogen mô TT Thuốc thử UV Ultra Violatet VS Vanillin sulfuric δ Tử ngoại Độ dời hóa học