Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa của cây hồng rừng thu hái tại SaPa, Lào Cai

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VĂN THÙY LINH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY HỒNG RỪNG THU HÁI TẠI SAPA, LÀO CAI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VĂN THÙY LINH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY HỒNG RỪNG THU HÁI TẠI SAPA, LÀO CAI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU - DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực hồn thành luận văn này, em nhận đƣợc nhiều quan tâm, động viên giúp đỡ tận tình từ thầy cơ, gia đình bạn bè Nhân dịp này, em xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển Thầy trực tiếp hƣớng dẫn, bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành luận văn Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: PGS TS Trần Thế Bách, TS Nguyễn Văn Tài hỗ trợ cho em nhiều trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, bạn anh chị môn Dƣợc học cổ truyền, môn Thực vật - Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, mơn Hóa thực vật I, môn Dƣợc lý - Viện Dƣợc Liệu, Viện sinh thái tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, Trạm kiểm lâm Núi xẻ - Sapa, Vƣờn quốc gia Hoàng Liên hỗ trợ em suốt trình nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, tồn thể thầy giáo, cán Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội tạo điều kiện để em lĩnh hội kiến thức quý giá ngành Dƣợc thời gian qua Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, ngƣời thân ln sát cánh, động viên em hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2019 Học viên Văn Thùy Linh DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Tên viết tắt 13 C-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon (13) Nuclear magnetic resonance) H-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton ALAT Alanin aminotransferase ASAT Aspartat aminotransferase BuOH Butanol CAT Catalase CC Sắc ký cột (Column chromatography) D Diospyros DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ESI-MS Phổ khối lƣợng ion hóa tia điện (Electrospray ionization mass spectrometry) EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol GSH Glutathion GSH - Px Glutathion peroxidase IC50 Nồng độ ức chế 50% IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) LOP Lipid Oxidation Product MBC Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MDA Malondialdehyd MIC Nồng độ ức chế tối thiểu MS Phổ khối (Mass Spectrometry) NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) ROS/RNS/RCN Reactive oxygen species/Reactive nitrogen species/Reactive chlorine species UV-VIS Phổ tử ngoại DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ CK Creatin-kinase EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid HDL High-density lipoprotein LDL Low-density lipoprotein MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 NBT Nitro blue tetrazolium SKLM Sắc ký lớp mỏng SOD Superoxide dismutase TBA Tert-butyl alcohol TCA Trichloroacetic acid TG Triglycerid MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN CHI DIOSPYROS .3 1.1.1 Vị trí phân loại chi Diospyros .3 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố .3 1.1.3 Một số loài thuộc chi Diospyros .4 1.1.4 Tác dụng sinh học 10 1.1.5 Tổng quan Hồng rừng .11 1.2 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA .13 1.2.1 Gốc tự 13 1.2.2 Chất chống oxy hóa 13 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 14 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu .14 2.1.2 Thiết bị hóa chất nghiên cứu 14 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.2.1 Giám định tên khoa học đặc điểm thực vật nghiên cứu .15 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 16 2.2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu - đánh giá kết 23 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 3.1 VỀ THỰC VẬT .24 3.1.1 Đặc điểm thực vật 24 3.1.2 Giám định tên khoa học .26 3.1.3 Đặc điểm vi phẫu thân Hồng rừng 26 3.1.4 Đặc điểm phần bột thân Hồng rừng 29 3.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CAO CÁC PHÂN ĐOẠN 31 3.2.1 Định tính sơ số nhóm chất hữu Hồng rừng 31 3.2.2 Chiết xuất .36 3.2.3 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro cao phân đoạn dịch chiết phƣơng pháp dọn gốc tự do: 38 3.3 PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA MỘT SỐ CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ĐÃ LỰA CHỌN .43 3.3.1 Phân lập 43 3.3.2 Xác định cấu trúc 49 3.3.3 Thử tác dụng chống oxy hóa chất phân lập đƣợc phƣơng pháp dọn gốc tự 56 Chƣơng BÀN LUẬN 61 4.1 VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 61 4.1.1 Đặc điểm hình thái giám định tên khoa học loài nghiên cứu 61 4.1.2 Đặc điểm vi học loài nghiên cứu 62 4.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CAO CÁC PHÂN ĐOẠN 62 4.2.1 Định tính sơ số nhóm chất hữu 62 4.2.2 Chiết xuất .62 4.2.3 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro cao phân đoạn dịch chiết phƣơng pháp dọn gốc tự 63 4.3 PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA IN VITRO CỦA MỘT SỐ CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ĐÃ LỰA CHỌN 64 4.3.1 Phân lập, xác định cấu trúc 64 4.3.2 Thử tác dụng chống oxy hóa chất phân lập đƣợc phƣơng pháp dọn gốc tự 66 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học số thuộc chi Diospyros Bảng 2.1 Hỗn hợp phản ứng 19 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất hữu phƣơng pháp hóa học 34 Bảng 3.2 Độ ẩm dƣợc liệu hồng mẫu cao 37 Bảng 3.3 % độ ẩm cao so với dƣợc liệu ban đầu 38 Bảng 3.4 Khả dọn gốc DPPH cao chiết phân đoạn từ Hồng rừng 39 Bảng 3.5 Giá trị IC50 mẫu thử mơ hình dọn gốc DPPH 40 Bảng 3.6 Khả dọn gốc Superoxide cao chiết Hồng rừng 41 Bảng 3.7 Hoạt tính dọn gốc Superoxide Quercetin .43 Bảng 3.8 Giá trị IC50 mẫu thử mơ hình dọn gốc tự Superoxide 43 Bảng 3.9 Dữ kiện phổ NMR hợp chất I2Đ4,5F5,6 50 Bảng 3.10 Dữ kiện phổ NMR hợp chất A5Đ4F8 52 Bảng 3.11 Dữ kiện phổ NMR hợp chất Đ3F5,6 54 Bảng 3.12 Dữ kiện phổ NMR hợp chất C6N3I4Đ4,5F5,6 56 Bảng 3.13 Khả dọn gốc DPPH chất chiết phân đoạn từ Hồng rừng .57 Bảng 3.14 Khả dọn gốc DPPH Quercetin 58 Bảng 3.15 Khả dọn gốc Superoxide chất phân lập đƣợc 59 Bảng 3.16 Hoạt tính dọn gốc Superoxide Quercetin 60 Bảng 3.17 Giá trị IC50 mẫu thử mơ hình dọn gốc tự Superoxide 60 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH Quercetin 39 Biểu đồ 3.2 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao n-hexan 39 Biểu đồ 3.3 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao DCM .40 Biểu đồ 3.4 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao n-butanol 40 Biểu đồ 3.5 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao EtOH .40 Biểu đồ 3.6 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao EtOAc 40 Biểu đồ 3.7 Hoạt tính dọn gốc tự SOD cao EtOAc .41 Biểu đồ 3.8 Hoạt tính dọn gốc tự SOD cao nƣớc 41 Biểu đồ 3.9 Hoạt tính dọn gốc tự SOD cao n-hexan .42 Biểu đồ 3.10 Hoạt tính dọn gốc tự SOD cao DCM .42 Biểu đồ 3.11 Hoạt tính dọn gốc tự SOD cao EtOH .42 Biểu đồ 3.12 Hoạt tính dọn gốc tự SOD cao n-butanol .42 Biểu đồ 3.13 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH Quercetin 58 Biểu đồ 3.14 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH Quercetrin 58 Biểu đồ 3.15 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH Mearnsetin 58 Biểu đồ 3.16 Hoạt tính dọn gốc tự SOD Mearnsetin 59 Biểu đồ 3.17 Hoạt tính dọn gốc tự SOD Quercetrin .59 Biểu đồ 3.18 Hoạt tính dọn gốc tự SOD Quercetin 60 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Diospyros kaki Thunb Hình 1.2 Diospyros lotus L Hình 1.3 Diospyros oleifera Cheng Hình 1.4 Diospyros virginiana L Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn 17 Hình 3.1 Đặc điểm quan sinh dƣỡng Hồng rừng .25 Hình 3.2 Đặc điểm hoa lƣỡng tính Hồng rừng .25 Hình 3.3 Đặc điểm hoa đực Hồng rừng 26 Hình 3.4 Đặc điểm hạt Hồng rừng .26 Hình 3.5 Vi phẫu thân Hồng rừng .27 Hình 3.6 Vi phẫu Hồng rừng, phần gân 28 Hình 3.7 Vi phẫu Hồng rừng, phần phiến 29 Hình 3.8 Ảnh bột thân Hồng rừng 30 Hình 3.9 Ảnh bột Hồng rừng 31 Hình 3.10 Sắc ký đồ cao tồn phần với hệ II điều kiện quan sát .35 Hình 3.11 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn từ loài 37 Hình 3.12 Sắc ký đồ cao EtOAc với hệ V điều kiện quan sát 45 Hình 3.13 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao EtOAc 47 Hình 3.14 Sơ đồ phân lập chất từ cao phân đoạn EtOAc 48 Hình 3.15 Cấu trúc hóa học Quercetin 49 Hình 3.16 Cấu trúc hóa học Quercetrin 50 Hình 3.17 Cấu trúc hóa học 4’-O-methyl myricetin .53 Hình 3.18 Cấu trúc hóa học 3-O-β-arabinofuranoside-4’-methoxy myricetin 54 ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VĂN THÙY LINH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA... thân ln sát cánh, động viên em hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2019 Học viên Văn Thùy Linh DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Tên viết tắt 13 C-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân