Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây cúc tím thu hái tại thái nguyên

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài " Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hoá học cây cúc tím thu hái tại Thái Nguyên**, vói nội dung: - Nghiên cứu về mặt thực

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ược HÀ NỘI

Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Bích Thu

Nơi Thực hiện: VIỆN Dược LIỆU - BỘ Y TẾ

BM DƯỢC LIỆU - ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI Thời gian thực hiện: 02/2007 - 05/2007

HÀ N Ộ I-2007

Tôi xin chân thành cảm ơn: Tiến sỹ Nguyễn Thị Bích Thu, đã trực tiếp chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn: Tiến sỹ khoa học Trần Văn Thanh, Dược sỹ

Lê Đình Bích, các thầy cô bộ môn Dược liệu, Thực vật trường Đại học Dược

Hà Nội đã giúp đỡ tôi về mặt chuyên môn trong quá trình thực hiện khoá luận

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc cùng tập thể khoa PT -

TC Viện Dược liệu; Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khoá luận này

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, khích lệ tôi rất nhiều để tôi có thêm sự nhiệt tình và say mê trong nghiên cứu khoa học

Hà Nội, tháng 05 năm 2007

Sinh viên

Phùng Thị Thu Hà

M ự c LỤC

ĐẶT VẤN Đ Ể 1

PHẦN 1; TỔNG QUAN 3

1.1 Về thực v ậ t 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái họ cúc 3

1.1.2 Phân loại họ cúc 4

1.1.3 Cây cúc tím 5

1.2 Thành phần hóa học 6

1.3 Tác dụng và công dụng 7

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 8

2.1 Nguyên liệu, phương tiện và phương pháp nghiên cứu 8

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứ u 8

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 8

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 9

2.2 Thực nghiệm và kết quả , 9

2.2.1 Kết quả nghiên cứu về đặc điểm thực vật 9

2.2.2 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học J4 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 36

3.1 Kết luận 36

3.2 Đề xuất 37

ĐẶT VẤN ĐỂ

Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đói gió mùa, nóng

ẩm, mưa nhiều thích hợp cho sự phát triển cây cỏ tạo ra hệ thực vật rất phong phú và đa dạng Đây là điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu và phát triển tài nguyên cây thuốc

Theo những công bố gần đây, ở nước ta đã biết tới 3.800 loài cây được

sử dụng làm thuốc Tuy vậy, mới có khoảng 300 loài cây con và vị thuốc được

sử dụng ở mức độ tưcmg đối phổ biến theo kinh nghiệm dân gian hoặc theo y

học cổ truyền mà chưa được nghiên cứu kỹ và đầy đủ

Cúc tím {Centratherum intermedium L.) là cây sinh trưởng và phát triển

tốt ở Thái Nguyên, được đồng bào các dân tộc Tày, Nùng ở Thái Nguyên dùng khá phổ biến để làm thuốc chữa cảm cúm, vàng da, đun nước tắm cho phụ nữ sau khi sinh

ở Việt Nam, thành phần hoá học của cây cho đến nay hầu như chưa được nghiên cứu và ứng dụng Nếu được nghiên cứu một cách có hệ thống và toàn diện, cúc tím có thể trở thành nguồn nguyên liệu thiên nhiên quý để tạo

ra các sản phẩm có ích

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài " Nghiên cứu đặc

điểm thực vật và thành phần hoá học cây cúc tím thu hái tại Thái Nguyên**,

vói nội dung:

- Nghiên cứu về mặt thực vật cây cúc tím: Mô tả hình thái, thẩm định lại tên khoa học, đặc điểm vi phẫu thân, cuống lá, phiến lá

- Nghiên cứu thành phần hoá học cây cúc tím: Sơ bộ định tính các nhóm chất trong cây, định lượng cắn trong phân đoạn ethyl acetat, định lượng tinh dầu và đi sâu nghiên cứu các thành phần của tinh dầu, so sánh hàm lượng

và thành phần tinh dầu cây cúc tím giữa 2 mùa: Mùa xuân và mùa hạ

Chúng tôi hy vọng rằng các kết quả thu được sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về hoá học và ứng dụng của cây cúc tím trong y học và đòi sống.

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 VỂ THỰC VẬT

1.1.1 Đặc điểm hình thái họ cúc (Asteraceae) [4], [6]

Cây thảo, cây leo hay cây bụi ít khi là cây gỗ, hiếm khi là cây nhỡ hay cây to Lá đơn, ít khi lá kép lông chim hoặc tiêu giảm, mọc so le không có lá kèm Rễ có thể phồng to và chứa chất dự trữ tan trong nước gọi là inulin

Cụm hoa gồm các hoa mọc tập trung thành đầu, nằm trong tổng bao lá bắc chung Lá bắc của hoa không có hoặc giảm thành vảy hoặc lông tơ Các đầu tập trung thành chùm đầu, ngù đầu, chùy đầu Mỗi đầu có một đế cụm hoa chung phẳng, lồi hoặc lõm thành hình chén

Đầu có ba loại:

- Đầu gồm tất cả các hoa hình ống

- Đầu gồm tất cả các hoa hình lưỡi nhỏ

- Đầu có cả hoa hình lưỡi nhỏ ở xung quanh và thường là hoa cái, hoa

Bộ nhị gồm 4 - 5 nhị dính liền nhau bỏi bao phấn thành một ống bao quanh vòi, chỉ nhị rời và dính vào ống tràng, bao phấn dính lại với nhau thành một ống, đính gốc, mở đầu bằng khe nứt dọc vào phía trong, trung đới kéo dài

ở đỉnh, ô phấn thường có phần phụ ở gốc tạo thành tai nhỏ, hạt phấn thường hình cầu, có gai

Bộ nhụy gồm có hai lá noãn luôn luôn dính lại vái nhau thành bầu dưới một ô, chứa một noãn Gốc vòi nhụy có tuyến mật Núm nhụy luôn chia thành hai nhánh, ban đầu ép lại với nhau, mặt trong của núm nhụy là nơi tiếp nhận hạt phấn, mặt ngoài có lông để quét hạt phấn khi vòi nhụy đi qua ống bao phấn Những hạt phấn này được sâu bọ mang đi thụ phấn cho hoa khác khi các nhánh của núm nhụy đã tách nhau ra.

Quả bế một hạt, có khi trần Để giúp sự phát tán mỗi quả có thể có một chùm lông (phát tán nhờ gió), có gai nhọn, có móc nhỏ hoặc lông dính (phát tán nhờ động vật)

Hạt có phôi lớn, không có nội nhũ Lá mầm to, nhiều khi chứa đầy dầu

1.1.2 Phân loại họ cúc [6],[9]

Đây là họ lớn nhất của thực vật có hoa, được phân bố khắp thế giới, ở Việt Nam có khoảng 125 chi trên 350 loài [9]

Theo Vũ Văn Chuyên họ cúc được chia thành hai phân họ [6]:

- Phân họ hoa ống (Tubuliflorea = Asteroideae): Trên cụm hoa chỉ có hoa hình ống, hoặc hoa hình ống ở giữa, hoa hình lưỡi nhỏ ò xung quanh đầu

Cây không có nhựa mủ

- Phân họ hoa lưỡi nhỏ (Liguliflorae = Cichorioideae): Trên cụm hoa

chỉ có hoa hình lưỡi nhỏ Cây có nhựa mủ

Có tài liệu lại chia họ cúc thành ba phân họ :

- Phân họ hoa lưỡi nhỏ: Đầu đồng giao, cấu tạo bởi toàn hoa hình lưỡi nhỏ, lưỡng tmh, không đều

- Phân họ hoa ống; Đầu đồng giao, cấu tạo bỏi toàn hoa hình ống, lưỡng tính, đều

- Phân họ hoa tỏa tròn (Radiatae): Đầu dị giao, cấu tạo bỏfi hoa hình

ống đều, lưỡng tính ở giữa và hoa hình lưỡi nhỏ không đều, bất thụ hoặc đực ở xung quanh Đầu thường tụ họp thành ngù

1.1.3 Cây cúc tím

a VỊ trí phân loại của chi Centratherum [10]

Chi Centratherum nằm trong phân họ hoa ống (Tubuli/ỉorae), họ cúc

(Asteraceae), bộ cúc {Asterales), phân lớp cúc(Asteridae), lớp ngọc lan (Magnoliopsida ), ngành ngọc lan {Magnoliophytà).

Vị trí của chi Centratherum trong hệ thống phân loại thực vật được tóm

b Đặc điểm thực vật loài Centratherum intermedium L [5], [8]

Tên Việt Nam: Tâm nhầy

Còn gọi là: cúc tím, cúc sợi tím

Cây thảo, sống nhiều năm, cao 45 - 60 cm , mọc thành bụi Thân mọc nằm đối xứng, màu xanh nhạt có lông trắng Lá có phiến hình trái xoan, dài 4

- 8 cm, gốc từ từ hẹp trên cuống, mép có răng kép, nhọn, không đều, gân bẽn

7 đôi Cụm hoa đầu ở ngọn các nhánh không cuống, tổng bao to 1 - 1,5 cm do những lá bắc xanh, đầu nhọn Hoa hình ống dài, màu lam tím đẹp, bao phấn trắng

c Sinh thái và phân bố

Cây ưa sáng, thòi kỳ ra hoa giữa đến cuối hạ, lá thcím Loài này thu hút ong bướm [1 1]

Cây cúc tím có nguồn gốc ở Nam Mỹ: Brazil, Nigeria Cây được nhập trồng để làm cảnh, dễ trồng [5], [8]

Hiện nay cây được tìm thấy nhiều ncd ở nước ta: Thành phố Hồ Chí

Minh [5], Hồ núi Cốc, vườn Quốc gia Bạch Mã [11], Nghệ An

Cúc tím là một loài xâm lấn cùng một số loài cây: Cuphea hookeriana,

Mimosa pigra, M invisa, Centratherum intermedium, Waltheria americana, Syndonella nudifolia, Dichrocephala intergrifolia, Pỉlea microphylla, Lantana camara, Taraxacum officinalis, Stachytarpheta jamaicensis và Stachytarpheta sp [11].

Các nghiên cứu cũng cho thấy có sự biến đổi thành phần tinh dầu ỏ một

số loài của những mẫu từ Brazil Bằng sắc ký khí khối phổ cho thấy có mặt 49 thành phần, 42 chất trong đó được nhận ra và xác định Tinh dầu gồm chủ yếu là: sesquiterpen (83,9%) trong đó dẫn xuất hydrocarbon chiếm nhiều nhất (62,7%) p-Caryophyllen (16.6%) và germacren D (6.4%) được xác định là thành phần quan trọng nhất trong thành phần tinh dầu [16]

Dẫn xuất oxy sesquiterpen gồm chủ yếu globulol (5.7%), caryophyllen oxide (3.7%), P-eudesmol (3.6%), elemol (3.0%) và spathulenol (2.2%)

Nhóm monoterpen có tỷ lệ khá thấp (9,7%) và hợp chất cao nhất trong đó là 1,8-cineol (4,1%)

Năm 1983 Mancini và cộng sự nghiên cứu thành phần hoá học của

Centratherum intermedium, và thông báo sự phong phú của ị3-caryophyllen

(17,6%), trong khi hợp chất sesquiterpenoid có rất nhiều thành phần như: a- copaen, a-humulen, y-cadinen, ỗ-cadinen, germacren D .[16]

Theo những tài liệu khác một vài thành phần đã và đang được xác định lần đầu như thành phần tinh dầu lá, trong đó thành phần chính là: globulol, sesquisabinen, 1,8-cineol, ß-selinen, caryophyllen oxid, ß-eudesmol, bicyclogermacren and elemol.

Percy S.M và cs đã tách và xác định cấu trúc của isocentratherin từ Cúc tím bằng phương pháp u v , IR, NMR, MS và SKLM [15]

Năm 1986, Banerjees và cs đã phân lập và xác định cấu trúc của một số sesquiterpen lacton từ cúc tím [12]

Tác giả Valve DA (1998) đã tách và xác định cấu trúc của 2 flavonoid trong cúc tím thu tại Arghentina là goyazensolid và isogoyazensolid [13]

1.3 Tác dụng và công dụng

Dịch chiết cây cúc tím có tác dụng kháng khuẩn Hoạt tính sinh học của loài này chủ yếu dựa trên sự có mặt của các sesquiterpen lacton và isocentratherin [14]

Cây cúc tím ít được nghiên cứu, chưa được ứng dụng trong y học Cây

mới chỉ được đồng bào dân tộc Tày, Nùng ờ Thái Nguyên dùng làm thuốc

chữa cảm cúm, vàng da, đun nước tắm cho phụ nữ sau khi sinh con

Cách dùng: Lấy cúc tím về rửa sạch đun lấy nước xông và tắm ngày một lần, khoảng 2-3 lần

PH Ầ N n THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Nguyên liệu là phần trên mặt đất của cây cúc tím {Centratherum

intermedium L.) thu hái vào tháng 2 và tháng 5 tại Thái Nguyên.

Sau khi thu hái dùng cành tưoi mang hoa, ép để lưu mẫu cây, nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc điểm giải phẫu và cất tinh dầu Một phần sấy khô

ở nhiệt độ 4 5° c - 60° c, tán nhỏ bằng thuyền tán, đựng trong lọ kín để làm thực nghiệm

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

Thuốc thử, dung môi, hóa chất

- Các thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn

phân tích đã ghi trong dược điển Việt Nam in

Phương tiện và máy móc

- Máy xác định độ ẩm SATORIUS

-TủsấySHELLAB

- Cân phân tích PRECISA

- Cân kỹ thuật Sartorius

- Kính hiển vi chụp ảnh Leica wetzlaz GmbH

- Bộ dụng cụ cất tinh dầu

- Bình soxhlet, sinh hàn hồi lưu

- Đèn tử ngoại

- Máy sắc ký khí khối phổ Shimadzu QP 2010 (Nhật Bản)

- Bản mỏng tráng sẵn Silica gel Gp254 của hãng MERCK ( Đức)

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

- Quan sát, mô tả hình thái thực vật của cây tại thực địa, thu mẫu làm tiêu bản

khô, dựa theo khoá phân loại để xác định tên khoa học theo tài liệu [8]

- Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu: cắt vi phẫu sau đó tẩy, nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép theo tài liệu [2] quan sát và chụp ảnh vi phẫu bằng kính hiển

vi chụp ảnh Leica

Nghiên cứu về hoá học

- Định tính các nhóm chất tự nhiên ừong cây cúc tím bằng các phản ứng định tính theo tài liệu [1], [3]

- Định tính saponin, cắn trong phân đoạn ethyl acetat bằng SKLM

- Định lượng cắn ừong phân đoạn ethyl acetat bằng phương pháp cân

- Định lượng, phân tích thành phần tinh dầu của cây cúc tím bằng sắc ký khí kết hợp với khối phổ (GC - MS)

2.2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.2.1 Kết quả nghiên cứu về đặc điểm thực vật

2.2.1.1 Đặc điểm hình thái

Hình 2.1 Cành mang hoa

Mô tả cây: Cây thảo, sống dai Thân và cành có nhiều lông mịn Lá mọc đối, hình trứng, dài 4-8 cm, rộng 2-3 cm, mép lá răng cưa, ngọn lá nhọn, gốc

lá men xuống theo cuống lá làm cho lá hầu như không có cuống, phiến lá nhẵn có mầu xanh thẫm, có 5-7 đôi gân phụ (hình 2.1, tiêu bản số

HNIP/15307/07 được lưu ở phòng tiêu bản bộ môn Thực vật Trường Đại học

Hoa có 3 lá đài rời, hình vẩy dài 2 mm, màu xanh xám, tràng hình ống cong, dài Icm, phía trên chia làm 5 thùy, thùy dài 3 mm, mầu tím Nhị 5, chỉ nhị ròd đính trên tràng, bao phấn 2 ô 2 mm trung đới kéo dài thành mũi nhọn dài 0,5 mm Lá noãn 2, bầu dưới 1 ô đính noãn bên Quả bế

2.2.I.2 Tên khoa học

Sau khi phân tích đặc điểm hình thái và đối chiếu với các tài liệu [5],[8],[17], được sự giúp đỡ của Dược sỹ Lê Đình Bích chúng tôi xác định tên

khoa học của cây cúc tím là Centratherum intermedium L.

Tên đồng nghĩa: Centratherum punctatum Cass [17]

2.2.I.3 Đặc điểm giải phẫu

a Thân cây

Cắt ngang thân cây, tẩy nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép rồi quan sát dưới kính hiển vi, ta thấy từ ngoài vào trong gồm các lớp sau:

- Lông che chở đa bào một dãy

- Tế bào biểu bì gồm một lớp tế bào đều nhau nhỏ hơn tế bào mô dày

Hình 2.3 Cấu tạo thân

1 Lông che chở; 2 Biểu bì; 3 Mô dày; 4 Mô mềm; 5 Mô cứng; 6 Li be cấp

hai; 7 Tượng tâng; 8 Gỗ cấp ỉtai; 9 Mô mềm ruột; 10 Tia ruột

- Mô mềm vỏ gồm 8-10 lóp tế bào hình đa giác, vách tế bào bằng cellulose bắt màu đỏ trong phương pháp nhuộm kép, các tế bào sắp xếp lộn xộn và to nhỏ không đều nhau, thường nhữĩig tế bào ở ngoài nhỏ hơn

11

- Nội bì, trụ bì, li be cấp một, bị biến dạng không nhận rõ.

- Mô cứng gồm những đắm nhỏ bao bên ngoài bó li be gỗ cấp hai

- Các bó li be gỗ cấp hai thường liền nhau thành vòng liên tục, tuy nhiên có thể gặp những bó đứng riêng lẻ, có độ lớn to hơn các bó khác Các bó

li be cấp hai tạo thành vòng liên tục, gồm các tế bào mô mềm, li be và các mạch rây có kích thước nhỏ, không phân biệt được vói tế bào li be Các bó gỗ cấp hai cũng tạo vòng liên tục thường có độ lớn gấp đôi bó li be, gồm các mạch gỗ xếp thành dãy dọc

- Gỗ cấp một nằm ngay dưới gỗ cấp hai

- Tượng tầng là một lớp tế bào mỏng nằm giữa li be cấp 2 và gỗ cấp 2

- Ruột chiếm phần lớn vùng trung tâm của thân gồm các tế bào đa giác,

những tế bào nhỏ ờ vùng ngoại vi và những tế bào lớn dần về phía trung tâm.

- Tia ruột khá nhỏ giữa các bó li be gỗ

b Cấu tạo của cuống lá

3-Hình 2.4 Cấu tạo cuống lá

/ Lông che chở; 2 Biểu bì; 3 Mô dày; 4 Mô mềm; 5 Li be; 6 Gổ;

cắt, tẩy, nhuộm kép rồi quan sát tìr ngoài vào trong cuống lá gồm các lớp sau:

- Lông che chở như ở thân.

- Tế bào biểu bì, gồm một lớp tế bào nhỏ đều

- Mô dày gồm 2-3 lớp tế bào có vách dày nằm sát tế bào biểu bì

- Mô mềm là các tế bào hình đa giác có khoảng gian bào, những tế bào

ở trung tâm lớn hơn tế bào vùng ngoại vi

- Bó li be gỗ gồm 5-7 bó chồng kép, lớn nhỏ không đều nhau, xếp thành hình vòng cung Li be ở hai đầu bó gỗ Bó gỗ gồm nhiều mạch gỗ xếp thành dãy

- Mô cứng

c Cấu tạo phiến lá

B

Hình 2.5 Cấu tạo phiến lá

l Lông che chở; 2 Biểu bì; 3 Mô giậu; 4 Mô khuyết; 5 Libe; 6 Gỗ; 7 Mô

mềm; 8 Mô dày; 9 Mô cứng

13

cắt, tẩy, nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép rồi quan sát dưới kính hiển

vi từ ngoài vào trong gồm những lớp sau:

ở gân giữa

- Biểu bì trên và dưới có lông che chở đa bào

- Mô dày trên và dưới gồm 2-3 lớp tế bào nhỏ vách dày bắt màu đỏ đậm

- Mô mềm gồm những tế bào hình đa giác

- Li be bao quanh bó gỗ

- Gỗ tạo thành hình vòng cung ở chính giữa

- Mô cứng,

ở phiến lá

- Biểu bì trên và dưới có lông che chở đa bào

- Mô giậu trên gồm 2 lớp tế bào hình chữ nhật dựng đứng như bức giậu

- Mô khuyết

Nhận xét: Cúc tím là loài mới du nhập vì vậy chưa được mô tả trong thực vật chí Việt Nam Nó là cây cảnh cho hoa đẹp, nhưng cũng là cây xâm lấn [11], làm ảnh hưởng đến cây bản địa như ỏ Vườn quốc gia Bạch mã

2.2.2 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học

2.2.2.1.Định tính sơ bộ các nhóm chất thường có trong dược liệu

- Với dung dịch NaOH; Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài

giọt NaOH 10%, thấy có tủa đục Phản ứng dương tính

- Hơi NH3 : Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên miếng giấy lọc, hơ khô, quan sát thấy có vết màu vàng, Hơ miếng giấy trên miệng lọ amoniac đậm đặc đã mở nút Quan sát thấy màu vàng của vết đậm hơn => Phản ứng dương tính

Sơ bộ kết luận có flavonoid trong mẫu thử

•Định tính alcaloid

Cho khoảng 3g bột dược liệu đã làm nhỏ vào bình nón dung tích lOOml, thêm 30ml dung dịch acid sulfuric 3%, đun sôi cách thuỷ trong 20 phút Để nguội, lọc lấy dịch chiết nước acid để làm các phản ứng định tính với các thuốc thử alcaloid

+ Phản ứng vói thuốc thử Mayer

ƠIO Iml dịch chiết vào ống nghiệm, nhỏ thêm 2 -3 giọt thuốc thử

Mayer Không thấy xuất hiện tủa ở mẫu thử Phản ứng âm tính

+ Phản ứng với thuốc thử Bouchardat

Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, không thấy có tủa nâu ở mẫu thử => Phản ứng âm tmh

+ Phản ứng với thuốc thử Dragendorff

Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt thuốc thử không thấy

kết tủa vàng cam hay đỏ ở mẫu thử => Phản ứng âm tính.

Sơ bộ kết luận không có alcaloid trong mẫu thử

15

• Định tính glycosid tìm

Lấy 5g dược liệu đã làm nhỏ, cho vào bình nón dung tích lOOml, thêm 50ml cồn 25°, ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24h Gạn dịch vào cốc có mỏ, loại tạp bằng lượng thừa dung dịch chì acetat 30%, lọc loại tủa, loại chì acetat dư bằng dung dịch natri Sulfat 30%, để lắng, lọc Dịch lọc chuyển vào bình gạn

và lắc kỹ với cloroform (lOml - 5ml - 5ml), gạn lấy lớp cloroform, loại nước bằng Na2S0 4 khan lọc Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi trên nồi cách thủy cho đến khô

Cắn còn lại hòa tan trong 4ml cồn 90° để làm các phản ứng định tính sau:

+ Phản ứng Lỉberman - Burchardt

Lấy Iml dịch chiết cồn ở trên, thêm 0,5ml anhydrid acetic Lắc đều, đặt nghiêng ống nghiệm 1 góc 45°, sau đó thêm đồng lượng H2 SO4 đặc theo thành ống nghiêm, ở mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng tím

đỏ => Phản ứng dương tính

+Phản ứng Baijet

Lấy 1 ml dịch chiết ở trên, thêm 0,5ml thuốc thử Baijet vừa mới pha gồm 9,5 ml acid picric và 0,5 ml dung dịch NaOH 10% không thấy xuất hiện màu da cam ở mẫu thử => Phản ứng âm tính

Lấy Ig dược liệu đã tán nhỏ, cho vào ống nghiêm to, thêm dung dịch

H2SO4 10% tói ngập dược liệu rồi đun cách thủy trong 15 phút Lọc, để nguội, lắc vói ether ethylic trong 2 phút, để yên cho phân lớp gạn lấy lớp ether

ethylic và thêm vào đó 8ml dung dịch NaOH 10%, lớp kiềm không có màu

+ Phản ứng vói dung dịch PeCỈỊ 5%

Lấy Iml dung dịch thử cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch PeClg 5% thấy xuất hiện màu xanh đen ở mẫu thử => Phản ứng dưofng tính

+ Phản ứng vói gelatìn 1%

Lấy Iml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt gelatin 1% thấy

xuất hiện tủa ở mẫu thử => Phản ứng dương tính.

+ Phản ứng với dung dịch chì acetat 10%

Cho Iml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài giọt chì acetat 10%, thấy xuất hiện tủa => Phản ứng dương tính

+ Quan sát hiện tượng tạo bọt

Cho vào ống nghiệm Ig dược liệu cùng 5ml nước, đun sôi nhẹ, lọcnóng Dịch lọc thu được hòa loãng vói lOml nước, lắc mạnh trong 1 phút, rồi

để yên trong 15 phút Quan sát thấy cột bọt bền vững => Phản ứng dương tính

17

+ Phản ứng phân biệt saponin steroid và saponin triterpenoid

Lấy khoảng Ig dược liệu, chiết bằng cồn 90*^ trên nồi cách thủy trong

10 phút, lọc nóng, được dịch chiết cồn Cho dịch chiết cồn vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 5 giọt Sau đó:

Ống 1: Thêm 5ml NaOH 0,1N

Óng 2: Thêm 5ml HCl 0,1N

Lắc mạnh đồng thời 2 ống trong vòng 5 phút Quan sát thấy cột bọt trong ống 2 cao hơn trong ống 1 Kết luận saponin trong cây cúc tím là loại triterpenoid

+ Quan sát hiện tượng phá huyết

Cho Ig bột dược liệu vào lOml dung dịch NaQ 0,9% đun sôi cách thủy trong vòng 30 phút, lọc nóng, lấy dịch lọc để làm thí nghiệm sau;

Nhỏ 1 giọt máu thỏ 2% đã loại fibrin lên lam kính, đậy lamen Quan sát hồng cầu dưới kính hiển vi Nhỏ 1 giọt dịch lọc ở trên vào một cạnh lamen Quan sát dưới kúứi hiển vi, thấy hồng cầu bị vỡ ra khi dịch chiết thấm vào => Phản ứng dương tính

Sơ bộ kết luận có saponin triterpenoid trong mẫu thử

• Định tính Coumarìn

Lấy lOg bột dược liệu cho và bình nón có dung tích lOOml, thêm 50ml cồn 90*^, đun cách thủy sôi 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc Dịch chiết thu được đem làm các phản ứng sau:

+ Phản ứng mở đóng vồng lacton

Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống Iml dịch chiết, óng 1: Thêm0,5ml dung dịch NaOH 10% , ống 2: để nguyên Đun cả 2 ống nghiêm trên nồi cách thủy đến sôi Quan sát thấy:

Ống 1: Dịch chiết có tủa đục

Ống 2: Dịch chiết vẫn trong

Thêm vào cả hai ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất, lắc đều rồi quan sát thấy:

+ Phản ứng vi thăng hoa

Qio Img bột dược liệu vào 1 nắp chai bằng nhôm Hơ trên đèn cồn đến khi bay hết hơi nước trong dược liệu Đặt lên trên miệng nắp nhôm một lam kính trên đó có để một miếng bông ướt Đặt nắp nhôm trực tiếp trên nguồn nhiệt Sau 5 phút lấy lam kính ra để nguội, soi dưới kính hiển vi, không thấy

có tinh thể hình kim nào xuất hiện => Phản ứng âm tính

+ Quan sát huỳnh quang

Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp lên đó 1 giọt NaOH 5% sấy nhẹ Qie 1/2 vết bằng đồng xu rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút sau đó cất đồng xu đi, nửa hình tròn không che và nửa hình tròn có che sáng như nhau => Phản ứng âm tính

Sơ bộ kết luận không có coumarin trong mẫu thử

• Định tính chất béo, caroten, sterol

Ngâm lOg bột dược liệu trong bình nón bằng ether dầu hỏa, để qua đêm Lọc lấy dịch đem làm phản ứng:

+ Định tính chất béo

Nhỏ 1 giọt dịch chiết ở trên lên 1 miếng giấy lọc để khô rồi quan sát; Không thấy có vết đục mờ trên miếng giấy lọc => Phản ứng âm tính

19