Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây buởi bung

Vì vậy, việc nghiên cứu cơ bản các cây thuốc để có cơ sở khoa học cho việc hướng dẫn sử dụng thuốc cổ truyền một cách hçfp lý an toàn là điều hết sức cần thiết.Theo một số tài liệu [11],

B ộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

NGUYỄN THANH TÚ

THÀNH PHẦN HÓA HOC CÂY BƯỞI BUNG

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỌC SỸ 2002 - 2

Giáo viên hướng dẫn :TS Nguyễn Duy Thuần Nơi thực hiện

Thời gian thực hiện

TS Nguyễn Thị Bích Thu : Bộ mồn Dược liệu • • •

Trường Đại học DưỢc Hà Nội

: 01/2007 - 05/2007

b i

HÀ NỘI, 05/2007

m

€ỊuA trình ttạhiên eứu tĩă tắtựe hiền đê tà i nàự,y tỗi đjỄi nhận đkỂỢe. r â ỉ tihiỀu iự gẦúp, Ể& eêưt ihầụ eỗ- oò bạn, bề.

(ĩ)ởi lòng, kắnh, ỉrúttạ, txà biâ ờtt ỉấU iẨe, tồi neứL qjửi lồi eảnt ổti ehân

thành iM Qắạuụễtt n)uụ Q’huati oà địS- QVỊjuụễjtt ^ hi (Bắeh đîhu là

những, ngttòi tkầụ đã dàềth nhiềtc ihèi giojTL, eồnạ iứe iận tình hưẩttạ dỗMty giứp^ ựtõ tỗi hfắim thành ựtề tà i nừắị^

đîôi ăin bàụ lỗ- lồtvạ b iâ ổti lồ i ^S- Qắạuụễtt (ĩ)lâ ^kăn ễỉL nạưài

luồn hèắ iònắị ehi luìú, taở ntoi itỉỉắi lắiên fjlúfắ its tô i trứnạ Hắêt q^iiắắ trình họe iậ ft Oil nghiền eứắi.

đjêi eũnạ ăin ehâti thùnh eửm ổtt: đJhS (Bìti fĩ)ăữt đîhanft tà nqxtòi

đã giúp, đẵ tồ i trtỉnạ ữiệắi 'deắe định tên khóa họe e/ui Cắắa tnẫu nạkìên cứu

@ ố ẳ tắtầụ, eỗ OỈI liĩị ắhuắĩt ữiĩn hồ mền (Dưổe liỀii đã tịiúfL ĩtẵ, tạo- đĩều lùên eho tò i Itoùn thành, khóa, luận iốt ttgJiiêfb ttàụ.,

^tÂjếi eùnạ.^ lôi xin ehâtt thành ạửi ỉề i eảnt ổtt tồi gia đìnhf itạẮtòi thăn oil bạtt bè (tã itộnắỊ oẤètt, ạiúệt đtắ tồ i hởàti thành luận aản tốt

nạhiêệt.

'Jôà Qtệif thảnụ 5 nănt 2007

Simh oiỀn

Q ắạ Ấ iụ ễ ế t Q ^ h a n fi đ îù

MỤC LỤC

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN Đ Ể 1

PH ẦNl: TỔNG QUAN 3

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 3

1.1.1 Vị trí phân loại họ Rutaceae 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Cam {Rutaceae) 3

1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Acronychia 3

1.1.4 Đặc điểm thực vật loài Acronychia pedunculata (L.) Miq 4

1.1.5 Đặc điểm thực vật chi Glycosmis 5

1.1.6 Đặc điểm thực vật loài Glycosmis pentaphylla ( Retz.) DC 7

1.2 NHữSÍG NGHIÊN c ứ u VỀ THÀNH PHẦN HOÁ h ọ c 7

1.2.1 Nghiên cứu thành phần hoá học loài Acronychia pedunculata (L.) Miq 7

1.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học loài Glycosmis pentaphylla ( Retz.) DC 8

1.3 TÁC DỤNG VÀ CÔNG DỤNG CỦA CÂY BUỞI BUNG 9

1.3.1 Tác dụng, công dụng của loài Acronychia pedunculata (L.) Miq 9

1.3.2 Tác dụng, công dụng của loài Glycosmispentaphylla (Retz.) DC 9

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 11

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHUƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 11

2.1.1 Nguyên liệu 11

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 11

2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 15

2.2.1 Đặc điểm thực vật và xác định tên khoa học 15

2.2.2 Hàm lượng và thành phần hoá học của tinh dầu 22

2.2.3 Xác định sơ bộ thành phần hoá học trong rễ Bưởi bung A p 25

2.3 BÀN LUẬN 42

2.3.1 Về thực vật 42

2.3.2 Về hoá học 43

PHẦN 3: KẾT LUẬN 44

3.1 VỀ THỰC VẬT 44

3.2 VỀ HOÁ HỌC 44

PHỤ LỤC

TÀI LIỆU THAM KHẢO

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

STT Ký hiệu Nội dung Trang

1 Bảng 1.1 Danh mục một số loài trong chi Glycosmis có ở

Việt Nam

6

6 Bảng 2.5 Kết quả phun hiện màu alcaloid bằng thuốc thử

Dragendoff

31

8 Bảng 2.7 Kết quả hiện màu các chất trong ethyl acetat bằng

amoniac

34

9 Bảng 2.8 Tóm tắt môt số đăc điểm thưc vât khác nhau của 2 • • • •

loài nghiên cứu

42

STT Ký hiệu Nội dung Trang

5 Hình 2.5 Ảnh một phần vi phẫu rễ Bưởi bung Glycosmis

11 Hình 2.11 Ảnh sắc ký đồ dịch chiết Alcaloid sau khi phun

thuốc thử Dragendorff

31

13 Hình 2.13 Kết quả sắc ký dịch chiết Bbl quan sát ở bước sóng

15 Hình 2.15 Kết quả sắc ký dịch chiết Bbl quan sát ở ánh sáng

thường sau khi phun thuốc thử

18 Hình 2.18 Kết quả sắc ký dịch chiết Bb2 quan sát ở ánh sáng

thường sau khi phun thuốc thử

39

19 Hình 2.19 Kết quả sắc ký dịch chiết Bb3 quan sát ở bước sóng

366 nm

40

xu hướng sử dụng các thuốc có nguồn gốc thảo dược cũng ngày càng tăng Hầu như tất cả những cây cỏ xung quanh ta đều có tác dụng chữa bệnh Số cây thuốc được phát hiện ngày càng nhiều nhưng phần lớn lại được sử dụng dựa vào kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ Vì vậy, việc nghiên cứu cơ bản các cây thuốc để có cơ sở khoa học cho việc hướng dẫn sử dụng thuốc cổ truyền một cách hçfp lý an toàn là điều hết sức cần thiết.

Theo một số tài liệu [11], [12], [14], Bưỏd bung là tên gọi chung thường

để chỉ 2 loài thuộc 2 chi Acronychia và Glycosmis, đều thuộc họ Cam

(Rutaceae) Cây Bưcd bung trong chi Acronychia còn có tên gọi là bái bài, cát

bối Cây Bưỏi bung trong chi Glycosmis còn có tên gọi là cơm rượu, co dọng

dạnh Trong dân gian, Bưỏri bung thường được dùng để chữa một số bệnh như phong thấp, đau nhức mình mẩy, ho, cảm sốt, phụ nữ kém ăn, vàng da sau khi sinh, mụn nhọt, chốc lở Do có công dụng gần giống nhau nên 2 loài này dễ

bị nhầm lẫn trong quá trình sử dụng

Vì vậy, để góp phần nghiên cứu tạo cơ sở khoa học cho việc nâng cao giá trị

sử dụng cây thuốc, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hoá học cây Bưỏi bung.

Đề tài nhằm mục tiêu tìm hiểu sâu hơn về đặc điểm hình thái và thành phần hoá học chính của cây thuốc, qua đó có thể so sánh một số đặc điểm khác nhau giữa các cây Bưỏi bung

Để đạt được các mục tiêu của đề tài, chúng tôi thực hiện một số nội dung nghiên cứu sau:

• Về thực vật:

+ Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật và xác định tên khoa học của

2 loài Bưỏd bung

+ Nghiên cứu đặc điểm vi học rễ, lá 2 loài nghiên cứu

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

1.1.1 VỊ trí phân loại họ Rutaceae

Theo hệ thống phân loại Takhtajan 1987, họ Cam {Rutaceae) thuộc bộ Cam (Rutales), phân lớp Hoa hồng iRosidaè), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [5].

Trên thế giói họ Cam có khoảng 155 chi với 1600 loài, phân bố chủ yếu

ở vùng ôn đói, nhiệt đói và cận nhiệt đổi

ở Việt Nam họ Cam có khoảng 30 chi với 110 loài Một số chi thường

dùng làm thuốc của họ này là: Acronychia, Atalantia, Citrus, Clausena,

Euodia, Murraya, Phelỉodendron, Zanthoxylum, [2], [5].

1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Cam (Rutaceae)

Cây gỗ, bụi, ít khi là cây cỏ Lá, vỏ cành, vỏ quả thường có tinh dầu thơm, soi phiến lá lên thấy có nhiều chấm trong mờ, vò thấy mùi thơm Các tuyến chứa tinh dầu thơm có thể nhìn thấy trên bề mặt lá, cành non, cụm hoa, các phần của hoa, quả hay lá mầm trong hạt Lá đơn hoặc kép lông chim, mọc

so le, mọc đối hay mọc vòng Không có lá kèm (đôi khi lá kèm biến đổi thành các ụ lồi)

Cụm hoa là xim hay chùm Hoa đều, lưỡng tứứi, mẫu 4-5, bao hoa rời Nhị có vòng ngoài thường đối diện với cánh hoa Bộ nhuỵ thường 4-5 lá noãn hàn liền thành bầu trên, đôi khi có nhiều lá noãn (15-20), số ô của bầu tương ứng số lá noãn, mỗi ô có 1-2 hay nhiều noãn Noãn đứứi trung trụ Đĩa mật ở trong vòng nhị Quả nang hay mọng loại cam, có khi là quả tụ gồm nhiều đại Hạt nhiều, thường không có nội nhũ [2], [5], [9]

1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Acronychm

Cây gỗ nhỏ hay cây bụi, thường xanh Nhánh non mọc đối Lá mọc đối,

Lá đofn hay lá kép có 1-3 lá chét, có tuyến trong mờ

Cụm hoa ở ngọn hay ở nách phía ngọn các nhánh, nụ hình cầu hay hình

trụ Hoa lưỡng tính hay đa tính, màu trắng, có mùi thơm Lá đài 4, rất ngắn,

rời hoặc hợp Cánh hoa 4, hình dải hay tam giác có lông ờ mặt trong Nhị 8, chỉ nhị ròi, đối diện vói lá đài và cánh hoa Chỉ nhị hình sợi hoặc hơi phình ở gốc, nhẵn hay có lông; bao phấn hướng trong, có 2 ô Đĩa mật tạo thành cuống nhuỵ Bầu hình trứng hay có thuỳ, có lông hay nhẵn, vòi hình trụ; 4 ô, mỗi ô chứa 2 noãn Quả hình cầu hơi nạc không mở, chứa một hạch vói 4 ô, trong mỗi ô có 1-2 hạt dài [8], [14]

Chi Acronychia có 44 loài phân bố ở Nam Á, Đông Nam Á, châu ú c và

các đảo Tây Nam Thái Bình Dương [8]

ở nước ta theo các tài liệu, Thực vật chí Đông Dưoỉng [31], Từ điển thực vật thông dụng [8] chỉ đề cập đến một loài thường gặp là Acronychia

pedunculata (L.) Miq {Acronychia laurifolia Blume).

1.1.4 Đặc điểm thực vật loài Acronychia pedunculata (L.) Miq.

- Tên đồng nghĩa: Acronychia laurifolia Blume, thuộc họ Cam

Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành ngù có chiều dài bằng lá, 2 -

25 cm Lá bắc và lá bắc con là những vảy rất nhỏ Hoa trắng, thơm, lưỡng tính, mẫu 4, có 4 lá đài 0,6 -1,5 mm, 4 cánh hoa 4 - 1 2 mm, nhị 8, 4 cái nằm trên cánh hoa, bầu hình trứng có nhiều lông Quả hạch hình cầu nạc, khía múi,

có lông, khi chín có màu vàng nhạt hay trắng hồng, ngọt, thơm, ăn được, hạt dài cứng đen 3 - 7 mm.

Mùa hoa: tháng 4 - 8 , mùa quả: tháng 8 -12, [8], [11], [14], [30]

1.1.5 Đặc điểm thực vật chi Glycosmis

Cây bụi hay cây thân gỗ nhỏ Qiồi được che phủ bcd lớp lông tơ ngắn

có màu gỉ sét (đôi khi màu trắng) Lá mọc so le, ít khi mọc đối Lá đơn hoặc

lá kép lông chim, có 1 - 7 lá chét

Cụm hoa mọc ở ngọn hay nách lá, có hình chuỳ hay giảm 1 hoặc vài bông Hoa nhỏ, lưỡng tứứi, nụ hình cầu hay elip 4 - 5 lá đài, đài họfp, 4 - 5 cánh hoa, nhị ròi, 8 hoặc 10, chỉ nhị thẳng, dài không đều nhau được xếp luân phiên Bầu hình khuyên, hình gối, hình trụ, hình nón hay hình chuông Bầu 2-

5 ô, có vách ngăn, mỗi ô 1-2 noãn Vòi nhụy và bầu nhụy tồn tại cùng vói quả Quả mọng có màu vàng, hồng, đỏ hay da cam [11], [12], [31]

Trên thế giói, chi Glycosmis có khoảng 50 loài phân bố ở Đông Á, Nam

Á, Đông Nam Á và châu úc, ở Trung Quốc chi này có 11 loài

Theo tài liệu, Thực vật chí Đông Dương [31], nhà thực vật học Lecomte

đã mô tả thống kê 6 loài thuộc chi Glycosmis có ở Việt Nam, còn ữong Cây cỏ

Việt Nam [11], giáo sư Phạm Hoàng Hộ đã mô tả thống kê có 21 loài, Tuy nhiên giữa 2 tài liệu này có một số loài trùng nhau đã được thống kê ở bảng 1.1

(•

S'1’1' Theo Phạm Hoàng Hộ (1999) Theo Lecomte

1 G bonii Guill Glycosmis bonii

Guill

2 G citrifolia ( WiUd.) Lindl. Cơm rượu lá chanh

4 G crassifolia Ridl. Cơm rượu lá mập

5 G cyanocarpa (Bl.) spr var

6 G gracilis Tanaka ex C.B Stone Cơm rượu mảnh

7 G lanceolata ( Bl.) Spr. Cơm rượu thon

9 G ovoidea Pieưe Glycosmis

ovoidea Heưe Cơm rượu xoan

10 G parviflora ( Sims ) Little. Cơm rượu hoa nhỏ

12 G pentaphylla ( Retz.) DC. Cơm rượu, Bưởi bung

14 G puberula Lindl Ex Oliv var

eberhardtii ( Tan.) c B Stone Giành trang

15 G rupestris Ridl. Cơm nguội đá

16 G sapindoides Lindl ex Oliv.

Glycosmis sapindoides

Lindl

Cofm rượu dạng bồ hòn

17 G sinensis Huang Cơm rượu Trung

Quốc18

G singuliflora Kurz. Cưiii rượu một hoa

19 G stenocarpa (Drake.) Tan. Cơm rượu trái hẹp

20 G cymosa ( Pierre.) Stone. Cơm rượu bắc bộ

21 G trỉcanthera Guill. Cơm rượu mao hùng

montana Pieưe

23

Glycosmis cochinchinensis

(L.) Pieưe

dinhensis Pieưe

Như vậy, theo các tài liệu đã công bố cho đến hiện nay, ở Việt Nam chi

Glycosmis có khoảng 24 loài theo bảng 1.1.

1.1.6 Đặc điểm thực vật loài Glycosmis pentaphylla ( Retz.) DC.

- Tên Việt Nam: Cơm rượu, bưởi bung, co dọng dạnh (Thái)

Cầy nhỏ hay cây nhỡ, mọc thành bụi, cao 3-5m Cành màu lục pha tím

đỏ Lá kép dài tói 30cm, có 1-5 lá chét mọc so le, ít khi mọc đối, hình mác thuôn, mép nguyên hoặc có răng cưa không rõ, gốc tròn, đầu nhọn, mặt trên bóng nhẵn, mặt dưới vàng nhạt

Cụm hoa mọc thành chùm tán ờ đầu cành, ngắn hơn lá, hoa nhỏ màu

trắng, trắng đục hay lục, nhẵn, lá đài 5, rất ngắn, hình tròn, cánh hoa thuôn nhẵn; nhị 10, có 5 cái dài gần bằng cánh hoa; bầu nhẵn có 5 ô

Quả mọng, hình cầu, khi chín màu hồng rồi tím đậm xếp trên những cụm quả dài tới 25 cm, hạt 1-3, nâu bóng Quả ăn được [7], [14]

1.2 NHŨNG NGHIÊN c ứ u VỂ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC.

1.2.1 Nghiên cứu thành phần hoá học loài Ảcronychia pedunculata (L.)

Miq.

Bưỏd bung Acronychia pedunculata (L.) Miq là một cây thuộc họ Cam

(Rutaceae), vỏ thân, lá, quả đều cổ chứa tinh dầu Lá vò nát có mùi xoài, vỏ

thân có triterpenoid bauerenol [14], [30] ở châu úc, hàm lượng tinh dầu lá

của 19 loài thuộc chi Acronychia khoảng 0,1- 0,5% Thành phần tinh dầu

chmh của các loài thuộc chi này là dẫn chất monoterpen (a-pinen, ß - pinen,

bicyclogermacren, aromadendren, ) [16]

Ngoài tinh dầu, alcaloid là thành phần được quan tâm nhiều nhất ở chi

này Các nghiên cứu về loài Acronychia pedunculata (L.) Miq đã tìm ra nhiều

alcaloid ở các bộ phận khác nhau như: alcaloid 2,3- methylenedioxy-4,7- dimethoxyquinolin trong dịch chiết vỏ rễ, evolitrin, fagarin, kokusaginin,

maculosidin, skimmianin trong dịch chiết rễ [26], acronycin, bavarenol, nitroacronicin trong lá [11], [14].

Trong rễ cũng chứa saponin triterpenoid là một chất độc đối vói cá [30].Thân và vỏ rễ chứa 5 dẫn xuất mói của acetophenon là acronyculatin A,

B, c, D, E có tác dụng chống oxy hoá [17]

Ngoài ra, các nghiên cứu cũng tìm thấy một số chất như seselin, norbraylin, p- sitosterol trong lá [14]

12.2 Nghiên cứu thành phần hoá học loài Glycosmis pentaphylỉa ( Retz.) DC.

Các nghiên cứu về loài này tập trung chủ yếu vào alcaloid ở các bộ phận khác nhau của cây như vỏ rễ, vỏ thân và lá, đã tìm ra rất nhiều loại alcaloid:

Nhóm quinolon có: glycolon (4,8-dimethoxy-3-(3-methyl but-2-enyl)- 2-quinolon) ở lá [27]

Ngoài ra, từ vỏ thân cũng tìm ra một số hợp chất như: ester hydroquinon diglycosid acyl (glypentosides, seguinoside) [23], isoflavono diglycosid [2 2]

Từ lá cũng đã tách được 2 triterpen trung tính là: arborinol A và B, arbinol và isoarbinol, 2 triterpen alcohol đồng phân cùng vói beta-sitosterol, stigmatosterol và myricyl alcohol [7]

1.3 TÁC DỤNG VÀ CÔNG DỤNG CỦA CÂY BƯỞI BUNG.

1.3.1 Tác dụng, công dụng của loài Acronychỉa pedunculata (L.) Miq.

Bưởi bung Acronychia pedunculata (L.) Miq có vị ngọt, thofm, hcd cay,

túửi bình Vỏ đắng và chát Cây thuốc được dùng trong các bài thuốc cổ truyền các trường hợp sau:

- Rễ chữa phong thấp, đau lưng mỏi gối, vết ứiương phần mềm

- Lá chữa cảm sốt, ho, đau bụng, mụn nhọt

- Quả chữa tiêu hoá kém v ỏ thân chữa chốc lở ghẻ

Nhân dân ta thưcmg dùng lá sắc uống chữa đau dạ dày và các chứng sưng đau Còn dùng lá sao vàng, nấu nước cho sản phụ uống giúp ăn ngon và thông huyết ứ [8], [11], [12], [14]

ở Indonexia, vỏ thân được dùng trị lỵ và lọd tiểu [11]

Các nghiên cứu cũng đã tìm ra các tác dụng khác của loài này như:

- Dịch chiết methanol có tác dụng invitro đối vói kí sinh trùng sốt rét

Plasmodium falciparum [19].

- Evolitrin, kokusaginin, maculosidin, skimmianin trong dịch chiết rễ

có tác dụng như một chất độc tế bào yếu đối vói các tế bào ung thư [2 0]

- Acronycin có tác dụng chữa nhiều loại ung thư [11]

- Thân và lá chứa tinh dầu có thể sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nước hoa [30]

1.3.2 Tác dụng, công dụng của loài Glycosmis pentaphylla (Retz.) DC.

Rễ bưctì bung Glycosmis pentaphylla ( Retz.) DC có vị đắng cay, túứi

ấm, chữa phong thấp, chân tay nhức mỏi, mụn nhọt, chốc lở, rắn cắn Liều dùng 8 -2 0 g sắc uống

Lá sao vàng giúp phụ nữ sau khi sinh kích thích tiêu hoá, ăn ngon miệng Liều dùng 12-24 g sắc uống hoặc sao qua sắc uống Nước ép lá có vị đắng, dùng chữa sốt, bệnh về gan và trị giun [14] Lá lẫn vói gừng làm thuốc nhuyễn đắp trị eczema và các bệnh ngoài da [7]

ở Ẩi Độ, cây này được dùng trị ho, thấp khớp, thiếu máu, tiêu chảy, vàng da Những cành nhỏ có sợi có tác dụng làm săn và được dùng ở một số vùng ở Äi Độ để chải răng [11].

Một số tác dụng mới của loài này:

- Alcaloid Glycozölidol (6-hydroxy-2-methoxy-3-methylcarbazol) tò rễ

Glycosmis pentaphylla đã được chứng minh có tác dụng đối vód một số vi

khuẩn gram(-) và gram(+) [26]

- Alcaloid Arborinin có tác dụng ức chế các tế bào ung thư đang phát triển

do Agrobacterium tumefaciens sinh ra trong một thử nghiệm invitro [24].

- Lá của một số loài thuộc chi Glycosmis như G crassifolia Ridl., G

cyanocarpa Bl., G mauritỉana có chứa một số amit và imit là dẫn xuất chứa

lưu huỳnh của phenethyl và styrylamin hay ritigalin có tác dụng chống nấm Nhưng chưa có nghiên cứu nào chỉ ra rằng có hợp chất amid hay sulfur trong

tinh dầu lá Glycosmispentaphylla ( Retz.) DC [21].

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu là lá và rễ của những cây được gọi là Bưỏi bung thu hái ồ

huyện Nghi Xuân, tỉnh Hà Tĩnh tháng 1/2007

• Mẫu sau khi thu hái được làm tiêu bản khô và lưu tại bộ môn Dược liệu, trường ĐH Dược Hà Nội

• Lá, rễ tưcd được ngâm trong cồn; nước (1: 1) để cắt tiêu bản nghiên cứu về đặc điểm vi phẫu

• Lá tưoi được cắt nhỏ để cất tinh dầu

• Rễ được sấy khô, nghiền bột để nghiên cứu về đặc điểm vi học và thành phần hóa học

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

2.1.2.1 Nghiên cứu về thực vật

- Quan sát, mô tả hình thái thực vật cây tại thực địa, thu mẫu làm tiêu

bản khô, dựa theo các khoá phân loại [31] để xác định tên khoa học

- Tiến hành làm vi phẫu rễ và lá theo các tài liệu: Thực tập dược liệu phần vi học [4], Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi [13] gồm các bước: cắt, tẩy, nhuộm, cố định, chụp ảnh và mô tả đặc điểm vi phẫu

- Rễ dược liệu được tán thành bột, rây mịn và soi dưói kính hiển vi để quan sát các đặc điểm Chụp ảnh các đặc điểm bột bằng máy ảnh kỹ thuật số, hiệu chỉnh bằng phần mềm CorelDRAW 12 và in [13]

2.1.2.2 Nghiên cứu về tình dầu

> Xác định hàm lượng tinh dầu

• Lá tưcd sau khi thu hái được làm nhỏ rồi cất tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước vói bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến của Bộ môn Dược liệu - Trường ĐH Dược Hà Nội [3], [4]

• Thời gian cất: 5h

• Hàm lượng tinh dầu tính trên dược liệu khô tuyệt đối theo công thức

x% = a/b X 100

X; Hàm lượng phần trăm tinh dầu(tt/kl)

a: Thể tích tinh dầu đọc được sau khi cất (tính theo mililit)

b: Khối lượng dược liệu đã trừ độ ẩm ( tửứi theo gram )

> Phân tích định túửi, định lượng thành phần tinh dầu trong lá bằng phương pháp sắc ký khí - khối phổ GC/MS

Nhiệt độ buồng tiêm : 250°c

Nhiệt độ Detector : 280°c (detector MS: 5989 B)

Chương trình nhiệt độ; 60 - 260°c

Tốc độ dòng: Iml/phút

Tổng thời gian chạy: 56 phút

2.1.2.3 Nghiên cứu về hoá học

a) Định tính sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ trong lá, rễ bằng phản ứng

hoá học theo các tài liệu: Thực tập dược liệu phần hoá học [4], Phương pháp

nghiên cứu hoá học cây thuốc [10], Bài giảng dược liệu tập 1 và 2 [3]

b) ơiiết tách các nhóm chất hữu cơ trong rễ thành các phân đoạn dựa vào

độ phân cực tăng dần của dung môi bằng dụng cụ Sohxlet sử dụng hệ tìiống

HPTLC xây dựng “dấu vân tay” hóa học với các dịch chiết từng phân đoạn

Dược liệu rễ được chiết lần lượt với các dung môi; n- hexan, cloroform,

cồn 96° thành 3 phân đoạn

Về nguyên tắc:

HPTLC giống sắc ký lớp mỏng thông thường nhưng được tiến hành

trong điều kiện chuẩn nhất định vói sự hỗ trợ của máy móc và các phần mềm

vi tính chuyên dụng:

• Chất hấp phụ là bản mỏng silica gel GF254 tráng sắn của Merk được

hoạt hoá ở 1 10°c trong 1 giờ

• Quá trình chấm sắc ký:

- Bản mỏng sau khi hoạt hoá được kẹp vào đúng vị trí máy chấm

- Lấy vào xilanh chuẩn một thể tích mẫu chấm thích hợp

- Điều khiển máy chấm tự động Camag limonat 5 bằng máy vi tmh

- Số lượng vết, độ rộng vết, khoảng cách vết, thể tích mẫu chấm, chế độ

và tốc độ phun khí nén được điều khiển tự động với phần mềm Wincats

• Triển khai sắc ký:

- Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để các chất tách được tốt nhất

- Quá trình này được tiến hành trong bình sắc ký tiêu chuẩn đã được

bão hoà dung môi

- Đặt bản mỏng vào bình sắc ký, đậy kín bình đến khi quá trình khai

triển kết thúc thì lấy bản mỏng ra để khô

• Quan sát và chụp ảnh: Tiến hành trong buồng quan sát của hệ thống

Camag Reprostar 3 với sự hỗ trợ của phần mềm Wincats ở ánh sáng thường,

ánh sáng tử ngoại - khả kiến 254nm, 365nm và sau khi phun thuốc thử hiện

màu vanilin/ cồn /H2SO4 đặc

• Xử lý kết quả thành bảng và biểu đồ dựa vào phần mềm

Videoscanxó các giá trị Rf, Spic ở điểm bắt đầu, kết thúc và cực đại

c) Định lượng alcaloid và chất tan trong ethyl acetat ở rễ bằng phương pháp cân theo các tài liệu: Bài giảng dược liệu 1, 2 [3], Thực tập dược liệu

phần hoá học [4], Dược điển Việt Nam 3 [6], Phân tích sàng lọc hóa thực vật

[ 1 ].

Hàm lượng alcaloid toàn phần và hàm lượng cắn ethyl acetat tính trên dược liệu khô tuyệt đối theo công thức:

x% = a/b X 100

Trong đó: a: khối lượng cắn (g)

b: khối lượng dược liệu đã trừ độ ẩm(g) x%: Hàm lượng (kl/kl)

• Đặc điểm hình thái thực vật các cây nhóm 1

Cầy nhỏ mọc thành bụi, cao 1-3 m Lá kép dài, có 3-7 lá chét, mọc so le, cuống lá nhỏ, dài 2-lOmm Hiiến lá hình mác thuôn dài, dài 5-15 cm, rộng 3-

8 cm, mép nguyên, gốc nhọn, đầu lá nhọn, phình to ở giữa (hình 2.1)

Cụm hoa kiểu chùm tán mọc ở đầu cành hay kẽ lá, chiều dài ngắn hơn lá, mang nhiều hoa nhỏ màu trắng hay trắng đục Lá đài 5, rất ngắn, hình tròn Cánh hoa thuôn nhẵn, màu trắng hay vàng nhạt Nhị 10, chỉ nhị rời, có 5 cái dài gần bằng cánh hoa Bâu hình cầu hay hình trứng, nhẵn, có 5 ô, vòi nhuỵ ngắn, núm nhuỵ hé mở Quả mọng, hình cầu, khi chín màu hồng, ăn được Mùa ra hoa: tháng 7-10, mùa quả: tháng 1-3

Ọ

Hình 2.1 Anh cây Bưởi bung (nhóm 1) mang quả

• Đặc điểm hình thái thực vật các cây nhóm 2

Cây bụi hay cây nhỡ, cao thường tìr 2-6 m Lá mọc đối, mặt ừên xanh đậm, mặt dưới xanh nhạt, phiến lá hình ttái xoan, thuôn dài, dài 4-14 cm, rộng 2-6 cm, mép nguyên, đầu lá tù hay hơi nhọn, cuống lá dài 2-3 cm Lá vò có mùi thơm hắc (hình 2.2)

Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành ngù, có chiều dài 2-6 cm

Hoa ưắng, thơm, lưỡng tính, mẫu 4, có 4 lá đài, 4 cánh hoa Cánh hoa màu

trắng, vàng nhạt hay hồng nhạt Nhị 8, chỉ nhị rời, có lông, 4 cái nằm trên cánh hoa Bầu hình trứng có nhiều lông, vòi nhuỵ nhẵn hay có lông ở gốc Quả hạch, hình cầu nạc, khía múi, khi chÍQ có màu vàng nhạt, mùi thơm, ăn được (hình 2.3, hình 2.4) Mùa hoa: tháng 4-8, mùa quả: tháng 8-12

Hinh 2.3 Ảnh hoa Bưởi bung (nhóml)

Hình 2.2 Ảnh cây Bưởi bung (nhóm 2) mang hoa Hình 2.4 Ảnh quả Bưởi

bung (nhóml).

2.2.1.2 Xác định tên khoa học

Từ các đặc điểm hình tìiái thực vật đã được mô tả ở trên, tham khảo• • • • 7

khoá phân loại họ Rutaceae, chi Acronychỉa và Glycosmis của Thực vật chí

Đông Dương [31] và với sự giúp đỡ của ThS Bùi Văn Thanh (phòng dân tộc học, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật), tên khoa học của các mẫu cây nghiên cứu thuộc 2 nhốm ttên đã được xác đinh, kết quả cụ thể như sau:

Nhóm cây 1 có tên khoa học là:

Glycosmis pentaphylla (Retz.) DC., Rutaceae (Gp).

Tên Việt Nam là: Bưởi bung, cơm rượu, w

Nhóm cây 2 có tên khoa học là:

Acronychỉa pedunculata (L.) Miq., Rutaceae (Ap).

Tên Việt Nam là: Bưởi bung, bái bài, co dọng dạnh, w

cấu tạo bởi các tế bào thành mỏng,

hình nhiều caiứi hơi dM, xếp sít

nhau (2) Các tế bào libe nhỏ xếp

> Đặc điểm vi phẫu lá

Phần gân lá: Gân lá lồi cả ữên và dưới.

Biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo bởi một hàng tế bào tròn, nhỏ xếp đều đặn (1) Mô mềm gồm nhũng tế bào ttòn, thàiứi mỏng, kích thước không đều,

có các túi tiết tinh dầu hình tròn khá lớn (2) Các tế bào mô cứng tạo thành

vòng liên tục xung quanh bó libe - gỗ (3) Bó libe-gỗ hình cung nằm giữa gân

lá, libe xếp liên tục thành vòng bao quanh gỗ, phần gỗ gồm các mạch gỗ xếp liên tục nhau tạo thành từng

dãy (4) Trong cùng là mô

mềm gồm các tế bào tròn,

thành mỏng (5)

Phần phiến lá: Biểu bì

trên và biểu bì dưói giống

phần gân lá Mô giậu gồm

mô mềm (7) (hình 2.7)

Hình 2.7 Ảnh một số đặc điểm bột rễ Bưởi bung

Glycosmis pentaphylla (Retz.).

Hình 2.10 Ảnh một số đặc điểm bột rễ Bưởi bung Ap.

2.2.I.4 Đặc điểm vi học loài Ap

> Đặc điểm vi phẫu rễ

Mặt cắt hình tròn Từ ngoài vào trong có:

Lớp bần gồm nhiều lớp tế bào hoá gỗ xếp thành

vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm, có nhiều chỗ

rách (1) Mô mềm vỏ cấu tạo bởi các tế bào

thành mỏng sắp xếp lộn xộn, cạnh nhau, trong

đó rải rác có các đám tế bào cứng (2) Các tế

bào libe nhỏ xếp sít nhau thành bó (3) Tầng

phát sinh libe - gỗ gồm nhiều hàng tế bào kết

hợp thành vòng (4) Phần gỗ, cấu tạo bởi các

mạch gỗ lớn xếp liên tục thành dãy hướng tâm,

nằm rải rác trong nhu mô gỗ (5) (hình 2.8)

> Đặc điểm vi phẫu lá

Phần gân lá: Gân lá trên và dưới đều lồi

Biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo bỏi một

hàng tế bào tròn, nhỏ, xếp đều đặn (1) Mô dày

xếp sát biểu bì trên và dưới, gồm nhiều lớp tế

bào hình tròn, kích thước lớn hơn tế bào biểu bì

(2) Mô mềm cấu tạo từ những tế bào thành

mỏng, hơi tròn, kích thước không đều, rải rác

có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai và các

túi chứa tinh dầu (3) Bó libe-gỗ gồm một cung

gỗ lớn nằm giữa gân lá, có hai gân phụ nằm

phía trên hai đầu cung (4) Các tế bào mô cứng

tạo thành hình cung bao quanh bó libe-gỗ gân

giữa Cung mô cứng phía trên liên tục, cung phía

ầ p m i i e à

Hình 2.8: Ảnh một phần vi phẫu

rễ Bưởi bung (Acronychia pedunculata (L.) Miq.)

dưới chia thành nhiều bó nhỏ Cung libe xếp liên tục thành vòng Gỗ gồm các mạch gỗ xếp liên tục nhau tạo thành dãy Trong cùng là mô mềm gồm các tế bào hình trứng và rải rác các tinh thể calci oxalat hình cầu gai (5).

Phần phiến lá: Biểu bì trên và dưới giống phần gân lá Dưới biểu bì trên

có hạ bì cấu tạo từ 2 lóp tế bào kích thước tương đối lứn và đều nhau (6) Mô giậu nằm dưói hạ bì cấu tạo bcd 2-3 hàng tế bào hình chữ nhật vuông góc vói hạ

bì (7) Mô khuyết gồm các tế bào hình tròn sắp xếp lộn xộn (8) Cả phiến lá và gân lá đều có các túi tiết tinh dầu và tinh thể calci oxalat nằm rải rác (hình 2.9)

Hình 2.9 Ảnh vỉ phẫu lá Bưởi bung Acronychia pedunculata (L.) Miq.

Bột màu nâu nhạt, mùi thơm Quan sát dưới kính hiển vi thấy: Mảnh bần gồm các tế bào thành dày (1), mảnh mạch điểm (2), bó sợi (3) có thể mang tinh thể calci oxalat hình khối kích thước khoảng 0.025- 0.04 mm (3), các hạt tinh bột hình tròn, đơn hoặc kép đôi đường kính khoảng 0.01- 0.025

mm (4), các tinh thể calci oxalat (5), các tế bào cứng thành dày kích thướckhoảng 0.035 - 0.065 mm (6) (hình 2.10).

Nhận xét: Sau khi nghiên cứu đặc điểm vi học 2 loài, chúng tôi sơ bộ

rút ra một số kết luận như sau:

• Đặc điểm vi phẫu rễ của 2 loài Bưỏi bung tưofng đối giống nhau nhưng ở mẫu Gp các đám tế bào mô cứng nằm ữong libe còn trong mẫu Ap các đám tế bào mô cứng nằm rải rác trong mô mềm vỏ

• Đặc điểm vi phẫu lá của 2 loài Bưỏi bung cũng phần lớn là giống

nhau nhưng ờ mẫu Ap: có 2 gân phụ nằm phía trên 2 đầu cung libe - gỗ và

cung mô cứng phía trên liên tục, cung mô cứng phía dưói chia thành nhiều bó nhỏ, còn ở mẫu Gp các tế bào mô cứng tạo thành vòng liên tục xung quanh bó libe - gỗ

• Đặc điểm vi học bột rễ ở cả 2 loài đều có: mảnh bần, mảnh mạch điểm, sọi, bó sợi, tinh thể calci oxalat hình khối Nhưng ở mẫu Ap còn có tinh bột và tế bào cứng mà mẫu Gp không có

2.2.2 Hàm lượng và thành phần hoá học của tinh dầu

2.2.2.I Xác định hàm lượng tình dầu

Tiến hành cất tinh dầu từ lá của 2 loài nghiên cứu bằng phương pháp cất kéo hoà nước vói 3 lần lặp lại cho kết quả hàm lượng tinh dầu trong lá (túih theo tỷ lệ % thể tích trên khối lượng dược liệu khô tuyệt đối) được trình bày ở bảng sau:

Bảng 2.1: Kết quả hàm lượng tinh dầu trong lá

Nhận xét:

- Tinh dầu thu được trong lá của 2 loài nghiên cứu đều là chất lỏng,

màu vàng nhạt, mùi thơm hắc, có tỷ trọng nhỏ hơn nước

- Hàm lượng tinh dầu ttong lá loài Ap (0.77%), ừong lá loài Gp (0.51 %)

2.2.22 Phân tích thành phần hoá học của tình dầu

Bằng phương pháp sắc ký khí - khối phổ (GC/MS) đã xác định và tính

tỉ lệ % các chất trong tinh dầu lá bưcd bung

Kết quả phân tích thành phần hoá học tinh dầu lá được ưình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2 : Thành phần hóa học trong tinh dầu lá Bưỏi bung

khác biệt về hàm lượng, cụ thể như sau:

Tinh dầu loài Ap phát hiện được 16 hợp chất, có thành phần chính là: a- Pinen (20,61%), Caryophyllen oxid (18,9 %), Verbenon (2,77 %), P-Selinen (2,6 %)

Tinh dầu loài Gp phát hiện được 18 hợp chất, có thành phần chính là: 1- Limonen (35,03%), p-Pinen (17,17%), a- Pinen (2,81%), trans- Caryophyllen (5,46 %), trans - Ocimen (3,86 %), bicyclogeraiacren (3,41 %)

Kết quả này cho thấy tinh dầu 2 loài đều có các thành phần chính giống nhau là monoterpen, trong đó tinh dầu loài Ap giàu a- Pinen phù hợp với các nghiên cứu về chi này (theo [16]), còn tinh dầu loài Gp giàu Limonen

2.2.3 Xác định sơ bộ thành phần hoá học trong rễ Bưởi bung Ap

2.23.1 Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất trong rễ bằng phản ứng hoá học

a Định tính alcaloid

Cân 20 g bột dược liệu cho vào bình nón khô, có nút mài, dung tích 100

ml Kiềm hoá bằng dung dịch amoniac 25 % cho đến khi dược liệu được thấm vừa ẩm Chiết alcaloid base bằng cloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 10 ml) Gộp các dịch chiết cloroform, cô tói cắn, hoà tan bằng 5 ml H2SO4 Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 ml Nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:

Ống 1: Thuốc thử Mayer, có kết tủa trắng

Ông 2: Thuốc thử Dragendorff, có kết tủa đỏ cam

Ống 3: Thuốc thử Bouchardat, có kết tủa nâu

Kết quả: Phản ứng dương tính, như vậy có thể kết luận sơ bộ dược liệu

có alcaloid

b Định tính Flavonoid

Cân lOg bột dược liệu cho vào một ống nghiệm lớn Thêm 50ml cồn 90° Đun cách thuỷ sôi trong vài phút Lọc nóng, cô Dịch lọc được tiến hành làm các phản ứng sau:

❖ Phản ứng Cyanidin

Cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết Thêm một ít bột Mg kim loại Giỏ từng giọt HQ đậm đặc, để yên vài phút, màu dung dịch sẽ chuyển từ màu vàng sang đỏ sim

Kết quả: Phản ứng dương tính, như vậy có thể kết luận sơ bộ dược liệu

có Aavonoid

c Định tính Coumarin

Cần khoảng lOg bột dược liệu cho vào một ống nghiệm lớn Thêm 50

ml cồn 90° Đun cách thuỷ sôi trong vài phút Lọc nóng, cô Dịch lọc được tiến hành làm các phản ứng sau:

❖ Phản ứng mở đóng vòng lacton

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết: ống 1 thêm 0.5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội, ống 1 có màu vàng, ống 2 trong

Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều Quan sát thấy cả 2 ống đều trong suốt

❖ Phản ứng diazo hoá

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm 2 ml dung dịch NaOH

10 %, đun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội Nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo, dung dịch có màu hồng nhạt

Kết quả: Phản ứng âm tính, có thể kết luận dược liệu không có coumarin

d Định tính Anthranoid

❖ Phản ứng Bomtraeger

Cân khoảng lOg bột dược liệu cho vào một bình nón Thêm 100 ml dung dịch H2SO410%, đun cách thuỷ 15 phút, lọc, để nguội Lắc nhẹ dịch lọc vói cloroíorm (lắc 3 lần, mỗi lần 10 ml) Lấy dịch cloroíorm cô đến khoảng 5ml dịch chiết

- Lấy 2 ml dịch chiết, thêm khoảng Iml dung dịch N H 4O H 10%, lắc nhẹ Lớp nước có màu vàng, lớp cloroíorm mất màu

- Lấy 2 ml dịch chiết, thêm khoảng Iml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Lớp nước có màu vàng

Kết quả: Phản ứng âm tính, có thể kết luận dược liệu không có anthranoid.

e Định tính Saponin

❖ Hiện tượng tạo bọt:

Cho vào ống nghiệm lớn 1 g bột dược liệu, thêm 5ml nước Lắc mạnh trong 5 phút Để yên và quan sát thấy bọt bền vững sau 15 phút

❖ Sơ bộ phân biệt saponin sterolic và saponin triterpenic

ƠIO vào ống nghiệm lớn Ig bột dược liệu, thêm 5ml alcol, đun sôi, lọc

Bố trí 2 ống nghiệm như sau:

- ống 1: 5 giọt dịch chiết và 5ml NaOH 0,1 N

- ống 2: 5 giọt dịch chiết và 5ml HQ 0,1 N

Lắc mạnh 2 ống trong vòng 1 phút, thấy cột bọt ở 2 ống cao bằng nhau.Kết quả: Phản ứng dương tính, có thể kết luận sơ bộ dược liệu có chứa saponin triterpenic

Trong rễ mẫu Bưỏd bung {Ạcronychia pedunculata (L.) Miq.), kết quả

định túủi sơ bộ cho thấy có các nhóm chất; alcaloid, flavonoid, saponin Kết quả định từứi này được trình bày tóm tắt trong bảng 2.3

Lá của loài này sau khi cất tinh dầu, được chuyển dạng thành cao lỏng , tién hành định tính cũng xác định được 3 nhóm chất như trên Như vậy, trong

lá và rễ cùng có các nhóm chất hữu cơ giống nhau

KhôngcóChú thích: +++: Phản ứng dương tính rất rõ

++: Phản ứng dương tính rõ + : Phản ứng dương tính _ : Phản ứng âm tính

2.2.3.2 Định lượng alcaloid toàn phần và phân tích bằng SKLM

> Dựa vào kết quả định tính có nhóm alcaloid trong rễ, chúng tôi tiến hành định lượng alcaloid theo quy trình sau:

Sơ đồ quy trình định lượng Alcaloid

Bột dược liệu (200g)

H2SO4 3%

Dịch chiết/H2S0 4

Kiềm hóa bằng NH4OH (pH = 10 -11),lắc với CHQ,

Dịch chiết/CHa3

CôCắn alcaloid toàn phần

(base)

Sau khi tiến hành định lượng alcaloid theo quy trình trên vói 3 lần lặp

lại, kết quả hàm lượng alcaloid toàn phần trong rễ Acronychia pedunculata

(L.) Miq được trình bày ở bảng 2.4