Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây lá ngón

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI VŨ HUYỀN TÌNH NGHIÊN CỨU ĐẶC • ĐIEM THựC • v ậ• t v à THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÂY LÁ NGÓN 0GELSEMIUM ELEGANS B E N T H LOGANIACEAE) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1998 - 2003 Giáo viên hướng dẫn: Noi thực hiện: Thòi gian thực hiện: GS.TS. Phạm Thanh Kỳ TS. Nguyễn Tiến Vững Bộ môn Dược liệu Trường ĐH Dược Hà Nội Từ 02-0512003 Hà Nội - 5/2003 U ẩ £ i ■LL M ài o ă m ổn. &ỖỈ jeitt iừiụ, tẩ lòng, ỉùèt tín lâu. iắd tới: GS. TS. Pham Thanh Kỳ. TS. Nguyễn Tiến Vững,. (lf)ă hxiốnẨỊ. ilẫn tôi lĩũìitL thành luân, ứúềt tốt ntjititffi, nxuẬ,. ^ầitạ. thời tồi eũtu/ x.itL trân, trfrtuj. eảm Ổ4Laáa thầy, eô- ạ.iÓLơ-f ỂấỂ ểẩ li-ặ. tíurật aiètt trartạ bậ rnâtL ^Oưđa Liêu, a à aáe p,hÒ4tạ, b a n etiứe. n ă n g , trtìtu / ti.li.cL teư èiuỊ ttã, ta.fr ĩtỉễ u Ííìèn th u ậ n . L&i íifi& t â i tr a n ụ LíLốt tfià l ạ.LCLn tlviiti Itìèn ĩtề tà i tốt tLtj,fiiêp_ này,. Hà Nội, tháng 05 nám 2003 Sinh viên Vũ Huyền Tình 1 MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN Đ Ể ............................................................................................ 3 PHẦN 1 TỔNG Q UAN............................................................................ 4 1.1 Đặc điểm thực v ậ t.................................................................... 4 1.2 Thành phần hóa học................................................................ 4 1.3 Độc tính và tác dụng................................................................ 6 PHẦN 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u .. 9 2.1 Nguyên liệu............................................................................... 9 2.2 Phương pháp nghiên cứu......................................................... 9 PHẦN 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ........................................ 10 3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật............................................... 10 3.1.1 Đặc điểm hình thái cây lá ngón............................................. 10 3.1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu của rễ, thân, l á ...........................1 0 3.1.3 Đặc điểm bột rễ, thân, lá của cây Lá ngón.............................12 3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học............................................ 13 3.2.1 Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học................. 13 3.2.2 Định tính alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng.............................. 20 3.2.3 Định lượng alcaloid toàn phần................................................ 2 1 3.2.4 Chiết xuất và phân lập alcaloid............................................... 22 3.2.5 Nhận dạng chất TV2............................................................... 24 PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ.................................................... 26 PHỤ LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO. 2 ĐẶT VẤN ĐỂ Cây lá ngón (Gelsemium elegans Benth.) là một loài cây độc mọc hoang ở nhiều vùng núi Việt Nam. Lá, thân, rễ đều có chất độc có thể gây chết người. Gần đây có nhiều trường hợp tử vong do sử dụng nhầm các bộ phận của cây lá ngón [1 0 ]. Để góp phần kiểm định dược liệu và tiến tới giám định các vụ ngộ độc do cây lá ngón, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hoá học của cây lá ngón Gelsemium elegans Benth., Loganiaceae ” với các nội dung sau: Về mặt thực vật: - Mô tả đặc điểm thực vật, định tên khoa học mẫu nghiên cứu. - Xác định đặc điểm vi phẫu: rễ, thân, lá. - Xác định đặc điểm bột rễ, bột thân, bột lá. Về thành phần hoá học - Định tính các nhóm chất hữu cơ trong rễ, thân, lá. Định tính alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng. Định lượng alcaloid toàn phần trong rễ, thân, lá. Chiết xuất và phân lập alcaloid chính. Nhận dạng alcaloid phân lập được. 3 PHẦN I TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT Cây lá ngón có tên khoa học là: Gelsemium elegans (Benth.), họ Mã tiền (Loganiaceae). ở một số vùng của Việt Nam nó còn có tên là Co ngón (Lạng Sơn), thuốc dút ruột, Hồ mạn đằng, Câu vẫn, Đoạn trường thảo [12]. Cây lá ngón là một loại cây mọc leo, thân và cành không có lông, gỗ có màu vàng. Thân cây có khía dọc, lá mọc đối hình trứng thân dài hay hơi hình mác, đầu nhọn, phía cuối nhọn hay hơi tù, mép nguyên, bóng, nhẵn, dài 7 12cm, rộng 2,5 - 5,5 cm. Hoa mọc thành xim ở đầu cành hay ở kẽ lá. Cánh hoa mầu vàng, đài 5, lá đài rời. Tràng gồm 5 cánh hoa nhẩn, dính thành ống hình phễu, nhị 5 đính ở phía dưới ống tràng, bầu chẩn, vòi dạng sợi. Đầu nhụy 4 thùy hình sợi. Quả nang có vỏ cứng dai, mầu nâu hình thon dài lcm rộng 0,5cm hạt nhỏ, quanh mép có rìa mỏng màu nâu nhạt, hình thận [1], [3], [5], [9], [12]. Cây lá ngón phân bố khá phổ biến ở nhiều miền rừng núi Việt Nam. Từ Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Lào Cai, Lạng Sơn, Bắc Giang, Quảng Ninh, Hoà Bình, đến các tỉnh Tây Nguyên. Ngoài ra, cây lá ngón còn mọc ở một số nước nhiệt đới. ở Trung Quốc, lá ngón có ở các tỉnh Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây. Ở Bắc Châu Mỹ có loài Gelsemium sempervirens. Art [4][9][12]. 1.2. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC Theo các tài liệu của Đỗ Tất Lợi [12],Võ Văn Chi [4], Vũ Văn Chuyên [5], Trần Công Khánh [9], thì cây lá ngón có chứa nhiều alcaloid khác nhau, 4 cụ thể là: Từ loài cây ngón mọc ở Bắc châu Mỹ, G. sempervirens đã chiết ra được nhiều alcaloid như: gelsemin (QoH^OjINy, gelmixin (C19H 2 4 0 3N7) chất sempervirin và sempervin... tất cả đều có độc tính rất mạnh. ở Trung Quốc năm 1931 [12] người ta đã nghiên cứu rễ, thân, cành của cây lá ngón Trung Quốc (Gelsemium elegans) đã chiết xuất được 4 alcaloid đặt tên là: + Kumin (CjqH^ON j ): dễ tan trong cồn, khó tan trong ether, không tan trong nước. Tan trong nước acid. Đây là thành phần chủ yếu của cây chất này không độc lắm. + Kuminin là chất vô định hình, không màu, dễ tan trong ether và nhiều dung môi hữu cơ, khó tan trong nước, tan trong nước acid. + Kuminixin: là chất vô định hình. + Kuminidin: có tinh thể hình trụ, không màu, tan nhiều trong các dung môi hữu cơ và nước. Hàm lượng cả 4 loại alcaloid ở trong cây là 0,3%. Vào năm 1936 F.Guichard nghiên cứu cây lá ngón mọc ở Việt Nam đã chiết từ lá, vỏ thân và rễ được những chất giống như lá ngón Trung Quốc. Tác giả đã thấy chất kumin có cả trong quả và hạt, ngoài ra còn tìm thấy một chất có huỳnh quang dưới đèn tử ngoại, không tan trong acid và ghi là chất thuộc nhóm esculetin [1 2 ]. Năm 1953 M.M Janot xác định lá ngón Việt Nam có chứa gelsemin ở lá, kumin ở thân, rễ và sempervirin ở các bộ phận của cây. Năm 1971 Phan Quốc Kinh, Phạm Gia Khôi và Lương Văn Thịnh chiết được kumin từ rễ cây lá ngón mọc ở Hoà Bình Hoàng Như Tố đã phân tích bằng sắc ký lớp mỏng thấy có 15 vết Alcaloid ở cây lá ngón trong đó đã tách được gelsemin và kumin [1]. 5 N H OMe Gelsenicin ( Gelsemin 1.3. ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HOC Cây lá ngón là một loại cây rất độc, không được nhân dân ta dùng làm thuốc mà chỉ dùng với mục đích tự tử hay đầu độc. Nhưng ở Trung Quốc người dân lại hay dùng làm thuốc chữa hủi hay chữa bệnh nấm tóc [1 2 ]. Theo Võ Văn Chi, [4], thì cây lá ngón có thể dùng làm thuốc, bộ phận dùng là rễ, thân, lá. Nó có vị cay, đắng, tính nóng, rất độc* có tác dụng thanh nhiệt, tiêu thũng, giảm đau, sát trùng, chống ngứa. Có công dụng là: điều trị eczema, nấm ở chân, ở thân, đòn ngã tổn thương, đụng giập, tri, tràng nhạc, đinh nhọt và viêm mủ da, điều trị phong hủi. Giã cây tươi đắp ngoài hoặc nấu nước rửa ngoài mà không được dùng uống trong [4]. Trong cây lá ngón mọc ở Bắc Mỹ: thành phần chủ yếu là chất gelmixin, có độc tính rất mạnh. Với liều thấp trên động vật có vú, trước khi thấy hiện tượng ức chế hô hấp thường thấy một thời kỳ hưng phấn ngắn [1 2 ]. Trong cây lá ngón của ta và Trung Quốc có thành phần khác nhưng so với tác dụng của những alcaloid trong cây lá ngón Bắc Mỹ thì nhiều phần giống nhau. Chất kumin và kuminin ít độc hơn, gần giống tác dụng của gelsemin. Chất kuminixin rất độc, nhưng chất gelsemixin lại độc hơn nữa. Nhỏ dung dịch gelsemin và gelsemixin lên mắt thì thấy hiện tượng giãn đồng tử còn kumin và kuminin không làm giãn đồng tử [1 2 ]. 6 Ngoài thành phần hoá học, Hoàng Như Tố [14] còn kiểm tra truyền thuyết dân gian nói: “chỉ ăn 3 lá là đủ chết người" đồng thời tìm cơ chế tác dụng của lá ngón để tìm cách chống độc có hiệu quả đã đi tới một số kết luận sau: - Liều độc: LD50 đối với chuột nhắt trắng của rễ là 102mg/kg thể trọng (chiết bằng cồn 90°), của lá là 600mg/kg (dược liệu tươi chiết bằng nước), 200mg/kg (lá khô chiết bằng nước), 150mg/kg (lá khô chiết bằng cồn 70°), 89mg/kg (lá khô chiết bằng cồn 90°), của alcaloid toàn phần chiết từ lá khô là 200mg/kg, trong khi đó của gelsemin là 140mg/kg và kumin thì không độc. Như vậy, lá ngón có độc nhưng không đến mức 3 lá đủ chết người như dân gian thường nói. Tác dụng độc của lá ngón không đặc hiệu trên hệ thống thần kinh, gây nên co giật và chết do ngừng hô hấp trong một trạng thái thiếu oxy rõ rệt. - Nghiêu cứu về mặt chống độc, cho phép kết luận cơ chế tác dụng của các hoạt chất cây lá ngón chủ yếu đánh vào các men hô hấp, gây sự rối loạn trong tế bào dẫn tới sự thiếu oxy nghiêm trọng gây nên tình trạng co giật cơ và liệt cơ. Phương hướng dùng các thuốc ngăn cản sự ức chế men và bảo trợ men đã dẫn tác giả tìm ra được tính chống độc của ATP. Khi dùng ATP để ngăn ngừa cũng như để điều trị ngộ độc bằng lá ngón đã giảm tỷ lê chết của chuột nhắt trắng từ 58% xuống còn 25%, đã cứu được tất cả các thỏ làm thí nghiệm khi đã bị ngộ độc bằng liều chết của lá ngón [ 1 2 ]. Dù đã nghiên cứu như vậy nhưng việc phát hiện các chất độc trong cơ thể khi bị ngộ độc lá ngón còn rất khó khăn, vì phản ứng được tiến hành trên những chất lấy được ở cơ thể người bị ngộ độc là một việc không phải dễ dàng [12]. 7 Chất độc chính trong cây lá ngón là các alcaloid như gelsemin, kumidin và kumin có trong toàn cây, độc nhất là ở rễ và lá non. Ngộ độc với triệu chứng như khát nước, sốt, đau rát họng, đau bụng, nôn mửa, hoa mắt răng cắn chặt, sùi bọt mép, hạ thân nhiệt, hạ huyết áp, hô hấp chậm rồi chết. Cách giải độc: Phải nhanh chóng loại chất độc ra khỏi cơ thể bằng cách gây nôn và rửa ruột (nôn ra sớm thì sống, chậm thì chết) [9]. Theo kinh nghiệm truyền thống thì cho uống thật nhiều nước sắc cam thảo. Tiêm truyền huyết thanh mặn hay ngọt, giữ cơ thể ấm. Nếu hạ huyết áp thì dùng ephedrine, khó thở thì dùng niketamid cho thở oxy hoặc hô hấp nhân tạo, đau bụng thì dùng thuốc giảm đau [9] 8 PHẦN II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU - Nguyên liệu là rễ, thân và lá của cây lá ngón có hoa thu hái tại xã An Châu, huyện Sơn Động, tỉnh Bắc Giang vào tháng 02/2003. - Nguyên liệu sau khi thu hái được thái nhỏ sấy khô ở nhiệt độ 40-50°C sau đó được bảo quản trong túi bóng lớn, kín. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u 2.2.1. Nghiên cứu về mặt thực vật học - Quan sát hình thái bên ngoài bằng cảm quan. - Cắt và quan sát vi phẫu: Rễ, thân, lá trên kính hiển vi quang học tại bộ môn dược liệu theo tài liệu “Thực tập dược liệu” [2] và “Thực tập giải phẫu và hình thái thực vật” [8 ]. - Soi bột và mô tả các đặc điểm của bột rễ, thân, lá theo tài liệu của Trần Công Khánh [8 ] và thực tập dược liệu [2]. 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học trong cây lá ngón - Định tính các nhóm chất trong rễ, thân và lá cây theo tài liệu “Bài giảng dược liệu” [1 ], thực tập dược liệu [2 ]. - Định lượng alcaloid trong cây theo phương pháp acid base [2 ]. - Xác định độ ẩm trên máy Sartorius ( Germany) tại bộ môn dược liệu. - Đo phổ u v trên máy UV-VIS Spectrophotometer cary (Australia) tại Viện kiểm nghiệm Bộ y tế. - Đo phổ IR trên máy FTTR tại Phòng Hoá, Viện khoa học hình sự. - Đo phổ khối trên máy 5989B MS tại Phòng cấu trúc Viện hoá học. - Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân trên máyAy.ĩùồ tại V)t*v.-kxi 'ộiq c - Đo độ chảy trên máy GALLENKAMP tại bộ môn hoá hữu cơ. 9 1 E PHẦN III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 3.1.1. Đặc điểm hình thái cây lá ngón (Xem phụ lục hình 3.1; 3.2; 3.3; 3.4) Cây bụi leo mọc ở ven rừng, thân nhỏ hoặc vừa không có lông, lá mọc đối, hình trứng thuôn dài hay hơi hình mác, đầu nhọn phía cuống lá nhọn, mép nguyên, bóng, nhẵn, dài 10cm, rộng 5cm, mặt trên của lá mầu sẫm, mặt dưới mầu nhạt hơn, gân lá hình lông chim, có từ 4-7 cặp gân phụ, cuống lá dài lcm. Hoa nhỏ mọc thành xim ở đầu cành hay ở kẽ lá, bao hoa mầu phớt tím, cánh hoa mầu vàng. Mẫu chúng tôi nghiên cứu đã được GS. Vũ Văn Chuyên định tên khoa học là: Gelsemỉum elegans (Benth.), Loganiaceae. 3.1.2. Đặc điểm cấu tạo giải phẫu của lá, thân và rễ * Cấu tạo giải phẫu lá (Xem phụ lục hình 3.5) Mặt cắt ngang có dạng đối xứng hai bên, lá được chia làm hai phần chính, phiến lá và gân lá. - Gân lá: Mặt dưới lồi, mặt trên phẳng hơi lõm. Biểu bì ( 1 ) trên gồm một lớp tế bào hình trứng kích thước tương đối lớn xếp đứng, biểu bì dưới ( 1 ) tế bào có dạng hình tròn và nhỏ hơn. Mô dày (2) gồm những lớp tế bào tròn, thành dày xếp sát biểu bì trên và biểu bì dưới. Mô mềm (3) cấu tạo từ những tế bào tròn mỏng xếp lộn xộn. Cung gỗ (5) ở giữa gân lá. Có libe (4) bao quanh cung gỗ. - Phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo bởi những tế bào tròn xếp đều đặn thành hàng, tế bào ở phía trên to hơn ở phần biểu bì dưới. Hầu như không quan sát thấy mô dậu. Ngay dưới lớp biểu bì là mô khuyết, các tế bào xếp lộn xộn có nhiều khuyết nhỏ. 10 * Cấu tạo giải phẫu thân (Xem phụ lục hình 3.6) Mặt cắt ngang thân hình tròn, từ ngoài vào trong có: -Biểu bì (1) Gồm một 'ị.% ạụ hàng tế bào hình chữ nhật xếp thành dãy. - Mô mềm vỏ (2) Gồm nhiều tế bào thành mỏng, phía ngoài dẹt, phía trong hình trứng. Trong mô mềm vỏ có các tế bào hoá gỗ (3) và các sợi gỗ xếp riêng lẻ, hoặc thành từng đám. - Libe (4) xếp thành từng bó, phía ngoài libe có các sợi thành dầy, xếp thành từng đám. - Gỗ (5)Mô gỗ khá dầy có các mạch gỗ lớn xếp trong mô gỗ, bị các tia ruột thành dầy hoá gỗ chia ra từng bó. Mô gỗ liên tục càng vào phía trong các mạch gỗ nhỏ dần, phần ngoài tia ruột có nhiều tinh thể canxi oxalat hình khối. - Libe quanh tuỷ (6 ) tạo thành một cung liên tục nằm ở giữa gỗ và mô mềm ruột. - Mô nểm ruột (7) Gồm các tế bào thành mỏng xếp lộn xộn tạo nhiều chỗ khuyết. * Cấu tạo giải phẫu rễ (Xem phụ lục hình 3.8) Mặt cắt rễ tròn từ ngoài vào trong có: - Lớp bần (1) Gồm ba đến bốn hàng tế bào xếp thành dẫy đồng tâm và xuyên tâm, có nhiều chỗ đã bị bong ra. - Mô mềm vỏ (2) được cấu tạo bởi những tế bào có thành mỏng. Không có các bó sợi và tế bào hoá gỗ trong mô mềm vỏ. - Libe (3) Xếp thành từng bó, bên ngoài libe không có các sợi thành dầy hoá gỗ như ở phần thân cây. - Gỗ (4) Có các mạch gỗ lớn, xếp trong mô gỗ bị các tia một thành dầy hoá gỗ chia ra từng bó vào gần đến tâm. Mô gỗ phía trong liên tục và không có mô mềm ruột. 11 3.1.3. Mô tả đặc điểm bột rễ, thân, lá của cây lá ngón (Xem phụ lục hình 3.7) * Bột lá: mầu xanh lục, mùi hắc. Soi kính hiển vi nhận thấy có các đặc điểm sau: - Các mảnh mô mềm (2) - Các mạch xoắn (1) - Các mảnh biểu bì có lỗ khí (5) - Tinh thể Canxi Oxalat hình khối (7) * Bột thân cây: mầu vàng nhạt, có mùi hắc. Soi kính hiển vi nhận thấy có các đặc điểm sau: - Có rất nhiều các mảng mạch điểm (3) - Các tế bào màng hoá gỗ (4) - Các sợi gỗ (6 ) - Các mảnh mô mềm (2) * Bột rễ cây: mầu vàng đậm có mùi hắc. Soi dưới kính hiển vi có các đặc điểm sau: - Tế bào màng hoá gỗ (4) - Có nhiều các mảng mạch điểm (3) - Các bó sợi và sợi gỗ (6 ) - Có rất nhiều các hạt tinh bột đứng riêng lẻ hay thành từng đám hai đến ba hạt (8 ) - Có các mảnh mô mềm (2) - Các mảnh bần (9) Nhận xét: Các bộ phận của cây lá ngón có một số đặc điểm vi học đặc trưng - Giải phẫu lá: lớp tế bào biểu bì ở phần gân trên của lá có hình trứng, xếp đứng, kích thước lớn hơn các tế bào biểu bì phiến lá, libe bao quanh bó gỗ. 12 - Bột lá có các mạch xoắn, các tế bào ở phần phiến lá có chất tế bào tạo thành khối giống tình thể canxi oxalat. - Giải phẫu thân và rễ: Mô mềm vỏ của thân có nhiều sợi gỗ thành đầy, khoang hẹp, còn ở rễ thì hầu như không có sợi gỗ ở mô mềm vỏ. Các tia ruột màng hoá gỗ chia gỗ ra từng bó ở phía ngoài, mô gỗ ở phía trong liên tục, tinh thể canxi oxalat hình khối phân bố nhiều ở phần tia ruột cạnh libe của thân. - Bột thân và rễ có nhiều tế bào màng hoá gỗ kích thước lớn và các sợi gỗ. 3.2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 3.2.1. Định tính các nhóm chất trong rễ, thân và lá của cây lá ngón - Định tính alcaloỉd: Cân khoảng 10 gam bột dược liệu đã được sấy khô cho vào bình nón dung tích 250ml. Thấm ẩm đều bằng dung dịch NH4OH 10%. Để yên 60 phút. Thêm vào 50ml CHƠ 3 , lắc 5 —> 10 phút rồi để yên qua đêm, lọc. Lấy 30ml dịch lọc cho vào bình gạn, thêm 10ml HC1 5%, lắc 2 —» 3 phút, gạn lấy phần acid để làm phản ứng. Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch chiết, ống 1 : Thêm 2 —» 3 giọt TT Mayer -» Có tủa trắng, ống 2 : Thêm 2 -» 3 giọt TT Dragendorff —» Có tủa đỏ gạch, ống 3: Thêm 2 —> 3 giọt TT Bouchardat —>Có tủa đỏ nâu. Nhận xét: Qua kết quả định tính trên ta có thể sơ bộ kết luận trong rễ, thân, lá của cây lá ngón đều có alcaloid. - Định tính flavonoid: Lấy khoảng 10 gam dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml thêm 50ml ethanol 90° đun cách thuỷ cho sôi vài phút, lọc nóng. Dịch lọc dùng vào các phản ứng sau: ế 13 + Phản ứng cyanidin: Cho 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm thêm một ít bột Mg kim loại sau đó cho từng giọt HC1 đặc (3 -» 5 giọt), để yên một vài phút không thấy dung dịch chuyển màu. Phản ứng âm tính. + Phản ứng với kiềm: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã mở nút, màu vàng của dịch chiết không tăng lên. Phản ứng âm tính. + Phẩn ứng với dung dịch AlCl33%: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết thêm 3 giọt dung dịch A1C13 3% có hiện tượng tạo tủa. Phản ứng dương tính. Nhận xét: Trong rễ, thân, lá của cây lá ngón không có Flavonoid. - Định tính coumarin: Cho 5 gam bột dược liệu vào cốc, thêm 50ml cồn 90°, đun cách thuỷ cho sôi vài phút, lọc qua giấy lọc. Dịch chiết thu được tiến hành làm các phản ứng sau: + Phản ứng mở- đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống lml dịch chiết. - ống 1 : Thêm lml dung dịch NaOH 10%. ống 2 : để nguyên. Đun cả 2 ống nghiêm đến sôi rồi để nguội. Quan sát: - ống 1: Có mầu vàng - ống 2: Vẫn trong Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều Quan sát: - ống 1 : đục hơn ống số 2 - ống 2 : vẫn trong suốt Acid hoá ống 1 bằng vài giọt HC1 đặc thì thấy ống 1 vẫn đục như ban đầu. Phản ứng âm tính. 14 /Ọ + Phản ứng diazo hoá: Cho vào ống nghiệm nhỏ lml dịch chiết, kiềm hoá bằng NaOH 1 0 %, đun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vài giọt TT Diazo mới pha. Dung dịch trong ống nghiệm không chuyển sang màu hồng hay tím đỏ. Phản ứng âm tính. + Vi thãng hoa: Cho một ít bột dược liệu vào nắp chai bằng kim loại, đậy lên trên một phiến kính nhỏ có bông tẩm nước lạnh ở trên. Đốt nóng bằng đèn cồn trong 15 -» 20 phút. Lấy phiến kính ra để nguội, nhỏ 1 -> 2 giọt dung dịch KI. Soi trên kính hiển vi không thấy tinh thể nâu sẫm hay tím. Phản ứng âm tính. Nhận xét trong rễ, thân, lá của cây lá ngón không có coumarin. - Định tính tanin: Lấy 3 gam bột dược liệu, cho vào cốc. Thêm 20ml nước cất, đun sôi vài phút rồi lọc. Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau: + Phản ứng với FeCl35%: Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm 1 ->2 giọt FeCl3 5%, thấy xuất hiện tủa xanh đen. Phản ứng dương tính. + Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm vào vài giọt dung dịch gelatin 1 % thấy xuất hiện tủa bông. Phản ứng dương tính. Nhận xét: Trong rễ, thăn, lá của cây có chứa tanin. - Định tính acid hữu cơ: Cho vào ống nghiêm lml dịch chiết nước vài tinh thể Na2 C03, thấy có bọt khí nổi lên rất rõ. Nhận xét: trong rễ, thân, lá của cây có acid hữu cơ 15 - Định tính antranoid: + Phản ứng Borntraeger: Cho 3 gam bột dược liệu vào bình nón có dung tích 100ml, thêm 15ml H2 S0 4 10%. Đun cách thuỷ 15 phút, lọc, chuyển dịch lọc vào bình gạn, lắc với ether etylic trong 1 —» 2 phút, để yên cho tách thành 2 lớp. Loại phần nước, cho vào phần ether 5ml dung dịch NaOH 10%. Lắc thấy lớp ether có mầu vàng nhạt. Thêm vào đó dung dịch H2 0 2. Lắc đều, đun cách thuỷ vài phút dung dịch trở nên không mầu. Phản ứng âm tính. Nhận xét: trong rễ, thân, lá của cây lá ngón không có antranoid. - Định tính saponin: + Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho 5 giọt dịch chiết cồn vào ống nghiệm có 5ml nước, lắc mạnh trong 5 phút. Thấy có nhiều bọt xuất hiện và bền vững sau 15 phút (phản ứng dương tính) Nhận xét: trong rễ, thân, lá của cây lá ngón có saponin. - Định tính đường khử: Lấy 2 gam bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10ml cồn, đun cách thuỷ 10 phút, lọc, cho lmd dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ thêm 3 giọt TT Feling A và 3 giọt TT Feling B. Đun cách thuỷ 10 phút thấy có tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính) Nhận xét: Có đường khử tự do trong rễ, thân, lá. - Định tính chất béo: Nhỏ dịch chiết cloroform lên giấy lọc, hơ khô. Không để lại vết mờ trên giấy lọc. Phản ứng âm tính. Nhận xét: Không có chất béo trong rễ, thân, lá. 16 - Định tính sterol: Lấy khoảng 5 g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 40ml cồn 25°. Ngâm 24 giờ, gạn dịch chiết, loại tạp bằng chì acetat 30% đến dư, lọc bỏ tủa, lắc dịch lọc với cloroform 2 lần (mỗi lần 10 ml trong một hình gạn). Gạn lớp cloroform làm phản ứng: + Phản ứng Salkopski:Trong ống nghiệm nhỏ cho khoảng 2ml cloroform. Thêm từ từ 1ml H2 S0 4 đặc (nghiêng ống nghiệm 45°) cho chảy từ từ dọc theo thành ống nghiệm để có phân lớp.Thấy có xuất hiện vòng đỏ thắm trên bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng. Phản ứng dương tính. + Phản ứng Liebermann: Trong ống nghiệm nhỏ, cho 2ml dịch chiết cloroform. Bốc hơi cách thuỷ đến khô. Hoà cắn bằng lml anhydrid acetic, lắc đều, thêm từ từ 1ml H2 S0 4 đặc cho chảy dọc theo thành ống nghiệm để có phân lớp.Thấy có xuất hiện vòng đỏ thắm trên bề mặt phân cách giữa hai lớp chấrtỏng. Phản ứng dương tính. Nhận xét: Có sterol trong rễ, thán, lá . - Định tính gly cosỉd tim : Cho 10 g dược liệu vào bình nón dung tích 250ml, thêm 80ml cồn 25° ngâm 24 giờ, gạn lấy dịch chiết, loại tạp bằng dung dịch chì acetat 30% dư, lọc bỏ tủa, dịch lọc cho vào bình gạn và lắc kỹ 2 0 2 lần với clorofrom (mỗi lần ml), gạn dịch cloroform vào cốc thuỷ tinh khô bốc hơi cách thuỷ đến khô. Cắn được hoà tan trong cồn 90°, dịch chiết cồn để làm các phản ứng định tính glycosid tim. + Phản ứng Legal: Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm Nitroprusiat 1 % và 2 2 giọt dung dịch Natri giọt dung dịch NaOH 10% ,không thấy xuất hiện mầu hồng. Phản ứng âm tính. + Phản ứng Baljet: Chuẩn bị thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to lml acid picric 1 % và 9ml dung dịch NaOH 10% lắc đều. Làm phản ứng: m Cho lml dịch chiết trong cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ, nhỏ từng giọt thuốc thử baljet vừa mới pha vào ống nghiệm. Không thấy xuất hiện màu. Phản ứng âm tính. + Phản ứng Liebermann: Trong 1 ống nghiệm nhỏ, cho 2ml dịch chiết trong cồn 90°. Cô cạn cồn, rồi hoà tan cắn bằng 2 ml anhydrid acetic, lắc đều, đặt ống nghiệm nghiêng 45°, thêm từ từ H2 S0 4 theo thành ống nghiêm để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành 2 lớp, ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng có xuất hiện vòng tím đỏ. Phản ứng dương tính. +Phản ứng Keller- Kiliani: Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, cho vào đó lml FeCl3 5% trong acid acetic, lắc đều, nghiêng ống nghiệm, cho đồng lượng acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm. Không thấy xuất hiện vòng tím đỏ giữa 2 lớp phân cách. Phản ứng âm tính. Nhận xét Không có glycosrd tìm trong rễ, thân, lá của cây lá ngón. - Định tính acid amin: Trong một ống nghiệm nhỏ cho 2ml dịch chiết nước, thêm vào 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3% trong ethanol. Đun cách thuỷ 5-10 phút, không thấy xuất hiện màu xanh tím. Phản ứng âm tính. Nhận xét: Không có acid amin trong rễ, thân, lá. 18 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong cây lá ngón. TT 1 2 3 4 5 Nhóm chất Flavonoid Glycosid Đường khử Alcaloid Coumarin Phản ứng định tính Phản ứng Cyanidin Phản ứng với kiềm Thuốc thử A1C1, 3%/cồn ' Phản ứng Liebermann Phản ứng Bal jet Phản ứng Legal Phản ứng Keller-Kiliani Kết quả Rễ Thân Lá - - - - - - + + - - - - - - - - - - - Không có Không có + + Có +++ Thuốc thử Dragendorff +++ Thuốc thử Mayer Thuốc thử Bouchardat +++ Thuốc thử Diazo Phản ứng mở đóng vòng Lacton Vi thăng hoa Thuốc thử Gelatin 1% + ++ ++ ++ + + + Có + + Thuốc thử FeCl3 5% + + + Phản ứng tạo bọt ++ ++ + Có saponin + + + Có Thuốc thử Fehling A+B 6 Tanin 7 Saponin 8 Acid hữu Thuốc thử Na2 C0 3 cơ 9 Antranoid Phản ứng Bomtraeger 10 Sterol Phản ứng Liebermann Phản ứng Salkopski 11 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc 12 Acid amin Thuốc thử Ninhydrin 3% + Kết luân - - - - - - - - - - + + - + + - + + - - - - - - Không có Có Không có Có Không có Không có Nhận xét: Qua các phản ứng định tinh sơ bộ thấy trong rễ, thân, lá đều có các nhóm chất sau: alcaloỉd, saponin, tanin, acid hữu cơ, sterol, đường khử 19 3.2.2. Định tính alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng Làm định tính alcaloid trên 3 bộ phận: rễ, thân, lá của cây lá ngón bằng sắc ký lớp mỏng. 3.2.2.1. Chuẩn bị bản mỏng Dùng bản mỏng Silicagel 60 F2 54 (Merck), hoạt hoá trong tủ sấy ở 105°c trong 1 giờ. 3.2.2.2. Chuẩn bị dịch chấm sắc ký Cân lOg bột dược liệu làm ẩm bằng NH4OH 10% trong lh cho vào bình nón dung tích 250 ml, cho 50 ml CHCI3 , ngâm qua đêm, lọc, lấy dịch lọc cô còn khoảng 5 ml đem chấm sắc ký. 3.2.23. Tiến hành Chấm lên các bản mỏng đã chuẩn bị sẵn cùng lượng dịch chiết rồi khai triển bằng 2 hệ dung môi sau: Hệ I - CHCI3 : CH3 OH: NH4OH đặc [50 : 9 : 1] Hệ II- Toluen: aceton : C2 H5OH : NH4OH đặc [ 45: 45:7:3] Sau đó phun hiện mầu bằng thuốc thử Dragendorff. Trên bản sắc ký xuất hiện các vết có mầu từ vàng nhạt đến vàng đậm. So sánh thấy hệ II tách tốt vì số lượng các vết xuất hiện nhiều và khoảng cách các vết ở xa nhau hơn. Kết quả sắc ký khai triển với hệ dung môi II được trình bày ở hình 3.9 và ở bảng 3 .2 . Bảng 3.2 STT Kết quả định tính alcaloid bằng SKLM Màu VI V2 V3 V4 V5 V6 Vàng nhạt Vàng đậm Vàng Vàng nhạt Vàng Vàng V7 Vàng đậm V8 Vàng Lá Thân Rễ Màu Rf 0,045 Vàng nhạt 0,270 Vàng đậm 0,315 Vàng nhạt Rf 0,044 0,270 0,315 0,342 0,387 Vàng 0,423 Vàng 0,384 Màu Rf Vàng Vàng 0,270 0,458 Vàng nhạt 0,457 0,514 Vàng nhạt 0,513 0,314 0,423 0,459 Vàng nhạt 0,514 Vàng 20 Nhận xét: - Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy ở rễ cho 8 vết, ở thân cho 7 vết và ở lá cho 4 vết hiện màu với thuốc thử Dragendoff - Các vết của ba bộ phận rễ, thân, lá có Rf gần trùng nhau là các vết V2, V3, V7, V 8 . Trong đó V2 là vế to nhất, đậm nhất. 3.2.3. Định lượng alcaloid toàn phần 3.2.3.1. Định lượng alcaloid toàn phần trong rễ, thản, lá của cây lá ngón bằng phương pháp acid base. Bột dược liệu dùng để định lượng đem xác định độ ẩm trên máy xác định độ ẩm tại bộ môn dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội. Cân chính xác khoảng lOg dược liệu (đã xác định độ ẩm) thấm ẩm bằng NH4OH đặc (để yên 12 giờ), cho bột dược liệu vào túi lọc rồi đặt vào bình soxhlet. Chiết với dung môi là CHC13 đến kiệt alcaloid (kiểm tra bằng TT Dragendorff). Cất thu hồi dung môi rồi hoà tan cắn trong HC1 5%, rửa dịch acid bằng ether (rửa 3 lần, mỗi lần 10ml). Kiềm hoá bằng NH4 OH đặc đến pH 10 - > 1 1 rồi chiết bằng CHCI3 (chiết 5 lần, mỗi lần lOml) để lấy hết alcaloid. Tập trung dịch chiết rồi rửa bằng nước cất đến pH 7, để bốc hơi tự nhiên đến khô. Hoà tan cắn bằng một lượng chính xác 10ml HC1 0,1 N thêm nước cất đun sôi để nguội và 3 giọt dung dịch đỏ metyl. Định lượng acid thừa bằng dung dịch NaOH 0,1N. Gọi V là số ml dung dịch NaOH 0,1 N đã định lượng. (10 - v) sẽ là số ml dung dịch acid đã tham gia bão hòa alcaloid, lml dung dịch HC1 0,1N tương ứng với 0,0306g alcaloid toàn phần, tính theo Kumin. Hàm lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu tính theo Kumin. 21 (10 - V) X 0,0306 X 100 x% = -------------- -----------p X: Hàm lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu khô tuyệt đối. V: Thể tích NaOH 0,1 N dùng để trung hoà HC1 dư P: Khối lượng bột dược liệu đã trừ độ ẩm Tiến hành làm mỗi bộ phận 5 mẫu, kết quả định lượng được ghi ở bảng 3.3 Bảng 3.3: Kết quả định lượng aỉcaloid toàn phần trong rễ, thân, lá TT Hàm lượng alcaloid toàn phần (%) Rễ Thân Lá 1 0.67 0.34 0.16 2 0.66 0.34 0.19 3 0 .6 8 0.32 0.18 4 0.65 0.32 0.16 5 0.66 0.33 0.15 Trung bình 0.664 0.332 0.169 3.2.4. Chiết xuất và phân lập alcaloid 3.2.4.1. Chiết xuất alcaloid toàn phần Chiết xuất alcaloid bằng dung dịch acid HC1 1 % qui trình chiết xuất được tóm tắt ở hình 3.11. 22 Hình 3.11 Sơ đồ chiết xuất alcaloid toàn phần: 23 3.2.4.2. Phân lập alcaloid bằng sắc ký cột: Căn cứ vào kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng chúng tôi nhận thấy, trong các vết alcaloid của rễ cây lá ngón có V2 to nhất (hàm lượng cao nhất). Vậy có thể sử dụng phương pháp sắc ký cột để phân lập alcaloid V2. * Dùng silicagel 60 cỡ hạt 0,036 đến 0,2mm của hãng Merck, thực hiện phương pháp nhồi cột ướt. Hoạt hoá silicagel ở 105°c trong 1 giờ, sau đó lấy silicagel hoà trong một lượng cloroform rồi đem nhồi cột. Để yên cột trong 8 giờ. Cắn alcaloid toàn phần hoà tan bằng một ít cloroform rồi cho thêm 2g silicagel vào trộn đều. Sấy nhẹ cho cloroform bay hơi rồi đổ lên cột dàn thành lớp. * Rửa giải cột: Dùng hệ dung môi rửa giải là CHC13: CH3 OH (9:1) hứng mỗi ống khoảng 2 ml. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Chọn riêng những ống chỉ cho một vết trên bản mỏng gộp lại rồi cho bốc hoi cloroform, để kết tinh tự nhiên trong ống nghiệm. Cạo lấy phần tính thể đem kết tinh lại nhiều lần thu được alcaloid v 2. Kiểm tra độ tinh khiết của V2 bằng sắc ký lớp mỏng: Tinh thể alcaloid V2 được hoà tan trong một lượng vừa đủ methanol, rồi chấm lên ba bản mỏng và được khai triển bằng ba hệ dung môi khác nhau: Hệ I- Cloroform : Methanol: Amoniac [50:9:1]. Hệ II- Toluen : Aceton : Ethanol: Amoniac [45:45:7:3]. Hệ III- Ether Ethylic : Methanol: Amoniac [50:9:1]. Kết quả cho thấy alcaloid V2 chạy trên ba hệ dung môi khác nhau luôn cho một vết. Điều đó chứng tỏ V2 là đơn chất. 3.2.5 Nhận dạng chất TV2 - TV2 là dạng tinh thể hình kim, không màu - Tan tốt trong cloroform , methanol, ethanol - Không tan trong nước. 24 - Độ chảy 170°c. - Phổ tử ngoại (UV) đo trong MeOH cho Ằ,max: 264 nm. - Phổ hồng ngoại (IR) đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở: 3447,23; 2929,28; 2864,88; 1724,85; 1628,49; 1584,87; 1446,69; 1331,09; 1214,75; 1080,55; 926,02; 776,12; 758,65 em '. - Phổ khối (MS) cho gốc [ M]+= 306 nm tương ứng với công thức C20 H2 2 ON2 và các pic mảnh: 291 nm= M+ - 15 (CH3); 263 nm= 291- 28 (CO); 251 nm= 279- 28 (CH2 =CH2); 234 nm= 251- 17 (OH); 267 nm (C12H9 N). - Phổ NMR: + Phổ 'H - NMR cho biết trong cấu trúc của TV2 có 22 H + Phổ l3C - NMR cho biết trong cấu trúc của TV2 có 20C trong đó có 5 cacbon bậc 4 - Phổ DEPT: Cho biết trong cấu trúc TV2 có 1 nhóm CH3, 5 nhóm CH2 , 9 nhóm CH. Căn cứ vào phổ u v , IR, MS, NMR, DEPT chúng tôi nhận dạng chất TV2 là Kumin có công thức phân tử là sau: Kumin 25 và công thức cấu tạo như PHẦN IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN Sau một thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp, chúng tôi đã thu được kết quả sau: * Về đặc điểm thực vật: Đã lấy mẫu, quan sát đặc điểm thực vật của cây nghiên cứu và Giáo sư Vũ Văn Chuyên đã định tên khoa học mẫu chúng tôi nghiên cứu là: Gelsemium elegans (Benth.), Loganiaceae. Đã xác định đặc điểm vi phẫu rễ, thân, lá và đặc điểm bột rễ, thân, lá của cây lá ngón nghiên cứu góp phần nhận biết dược liệu. * Về thành phần hoá học: • Bằng các phản ứng hoá học đã xác định trong ba bộ phận rễ, thân, lá của cây lá ngón có alcaloid, saponin, tanin, acid hữu cơ, đường khử, sterol. • Bằng sắc kí lớp mỏng và sử dụng hệ dung môi thích hợp đã phát hiện được 8 vết alcaloid trong rễ, 7 vết alcaloid trong thân và 4 vết alcaloid trong lá. • Đã định lượng alcaloid toàn phần trong rễ, thân, lá bằng phương pháp acid-base. Kết quả cho thấy trong rễ có 0,664%, trong thân có 0,332%, trong lá có 0,169% alcaloid toàn phần. • Đã phân lập được 1 alcaloid tinh khiết trong rễ cây lá ngón. Căn cứ vào phổ u v , phổ IR, phổ khối (MS), phổ NMR ('H-NMR, l3C-NMR), phổ DEPT. Chúng tôi nhận dạng v 2là kumin. 26 4.2. ĐỂ NGHỊ Trên đây là những kết quả nghiên cứu bước đầu.công trình nghiên cứu này cần được nghiên cứu sâu hơn về thành phần hoá học đặc biệt là chiết xuất, phân lập các alcaloid, thử độc tính và tác dụng sinh học. 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Bộ môn dược liệu (1998), Bài giảng dược liệu (tập1, tập 2). 2. Bộ môn dược liệu (1998), Thực tập dược liệu 3. Võ Văn Chi, Lê Khả Kế, Vũ Văn Chuyên (1971), Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam, Nhà xuất bản KHKT, tr 288-289. 4. Võ Văn Chi,( 1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr 644 -645. 5. Vũ Văn Chuyên, Tóm tắt họ thực vật, Nhà xuất bản Y học. 6 . Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu,(1985) Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr 376 —398. 7. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam tập 2, Nhà xuất bán Y học, tr 288289. 8 . Trần Công Khánh,(1981) Thực tập giải phẫu và hình thái thực vật, Nhà xuất bản KHKT. 9. Trần Công Khánh (1992), Cây độc, Nhà xuất bản Y học, tr 146 -148. 10. Khoa chống độc - Bệnh viện Bạch Mai (2000), Tài liệu đào tạo kiến thức về độc chất, Bệnh viện Bạch Mai, tr 260-262. 11. Phạm Thanh Kỳ, Chuyên đề dược liệu 1.. 12. Đỗ Tất Lợi,( 1998), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản KHKT, tr 318 -321. tỷ_Ị3. Nguyễn Viết Thân, Bành Như Cương (1998), Hội nghị khoa học công nghệ dược, Cấu tạo giải phẫu một số bộ phận của cây Lá ngón, trường đại học Dược Hà Nội, tr 331-335. 14. Hoàng Như Tố,( 1970), Độc chất học, Nhà xuất bản Y học và thể dục thể thao, tr 136 -137. 28 Tài liệu tiếng Anh 15. Thompson u (2002), Multiple animal intoxications associated with Carolina jessamine, PubMed - indexed for Medline, p. 272-273. 16. Wang Y, Fang Y...(2 0 0 1 ), Inhibitory effect o f gelsemium alkaloids extract on hepatic carcinoma HepG2 cells in vitro, PubMed - indexed for Medline, p.579-581. 17. Bousta D, Soulimani R...(2 0 0 1 ), Neutropic, immunological and gastric effects o f low doses Atropa belladonna L., Gelsemium sempervirens L. and Poumon histamine in stressed mice, PubMed - indexed for Medline, p.205215. 18. Sakai s (1995), Chemical studies of indole alkaloids, PubMed - indexed for Medline, p.351-369. 19. Luo SR, Li T, Yang JS (1993), Determination of gelsemium alkaloids by RP-HPLC, PubMed - indexed for Medline, p. 695-698. 20. Lin LZ, Cordell GA...(1989), New humantenine-type alkaloids from gelsemium elegans, PubMed - indexed for Medline, p.588-594. 2 1 . Schun Y, Cordell GA (1987), Cytotoxic steroids of Gelsemium sempervirens, PubMed - indexed for Medline, p. 195-198. 22. Schun Y, Cordell GA (1986), Rankinidine, a new indole alkaloid from Gelsemium rankinii, PubMed - indexed for Medline, p.806-808. 29 PHỤ LỤC 1. Biên bản định tên cây lá ngón 2 . Ảnh cây lá ngón Hình 3.1: Mẫu cây tươi có hoa Hình 3.2: Mẫu cây tươi có hoa Hình 3.3: Ảnh thân cây Hình 3.4: Ảnh rễ cây 3. Ảnh vi phẫu lá, thân và bột rễ, thân, lá Hình 3.5: Ảnh vi phẫu lá Hình 3.6: Ảnh vi phẫu thân Hình 3.7: Ảnh bột rễ, thân, lá 4. Ảnh vi phẫu rễ, sắc ký đồ và tinh thể V2 Hình 3.8: Ảnh vi phẫu rễ Hình 3.9: Ảnh sắc ký đồ của rễ, thân, lá Hình 3.10: Ảnh tinh thể V2 5. Phổ : Phổ tử ngoại (UV) Phổ hồng ngoại (IR) Phổ khối (MS) Phổ NMR ('H-NMR, l3 C-NMR) Phổ DEPT. ŨPAGE Ũ37D BIÊN BẲN ĐỊNH TÊN CÂY LÁ "GỐM Tên np^ừơi đưa raSù : vũ Huyền T ìn h 3ị a c h ỉ :LỚp Ầ2 K ”53 Trừdng Đạri họ* Dựơc Hà HỘi Số lư ơ n g mẫu : 1 m u câ y ép khô__có hoa Nơi th u m u : xã An Châu, Sdn ĐÔng, Bấc G ian ẹ ĩỉgày th u mẫu: 0 8 /0 2 / 2 0 0 3 Npràỵ đưa TT.au: 2/2003 I . MÔ T i sri BÔ MẪU : Thân d à i khoảng 18 era, đừơng k ín h 2 ram .BÓng d à i 7 cm Lá : P h iế n d à i 10 nguyên era rộn g 5 cn rr.ăt tr ê n s a n , reft dứ ơi nhạt hơn ,mép , có mủi ahon .Gần l á lô n g ch im . Mọc đ ố i Cuống lá d à i 1 em. Hoa nhỏ , có 2 c ành Rian^ hoa. 1 . TẰĨ LIÊU THAM KHẲ.O : 1 Phạm Hoàng HÔ câ y cỏ V iệ t Nr.m Quyển I I iĩhà x u ấ t bản t r ẻ 2000trancỂốỌ số 6 6 7 0 - G elsen iu m eleprans (G ardn. e t Champ. ) 3e n t h . Lá ncrón, Thuấyc rú t ru ô t - Y e llo w je s s a m in e 2 . Võ Văn C h i T ư đ i é n c ã y t h u 3 c V ỉệ t ẳan Ahv xuHt b »n ỵ h ọ c l 9 g 7 t r a n g sô y h ỉn h I2Ó9 - l á ngón, ngón vàng ih u ỏ c r ú t ru ộ t j>. Đỏ l á t Lđi ứhừng c r y th u óc và v ị thuoc i í ẹ t ao.m aXB ỵ học 1999 tr a n g J>18 h ỉn h 'dhồí' 4 . A lfr e d P é t e l o t l e s p la n t e s r a é đ ic in a le s 1v5j> t r a n g ló>rion màu v à n g (Phạn hoàn g đu vaiHbodge, du MaOS e t duV ie t ẳọ g h i ĩ hoa màu t r ắ n g ) 2 . iu đ ỉe n Bach khoa dựđc học AXÉ5 xừ đ ie n Bách khoa l ý 99 tr a n g 0 . Lể 'rran sứ c 4 ẩ y th u o c v i ệ t Maall .>49 1 nam íXis nỏng n g h iẹp l y y Ỹ t r a n g 1^4-0 I I I . KỂx- quẲ ĐỊỉíii rEn MAƯ 0 Ă 1 LÁ íỉữón Mặc dù Phạra â o a n g ăó cho là hoa cay l á ngón «6 MAU xkẮíiG, m u v ạ t đưa đen van đúng ĩ à c ã y l á n gọn, họ LOửÁ/rlAoEa E i e n tchoa học ĩ ư elseniura e l e g a n s ( ữ a r đ n e r và ^harap. )isenth . x én Anh : l e l l q v ie ss a m in e h aà ftọi Id dỳ/d/đOQi n gừ đ ỉ đ ịn h te n vũ văn ^ u ỵ ê n Sò dY,pho ííhà ưhung ẳoàn Kiẻ íià i-iọi Đ.x. Odữữdỹo HÌNH 3.1: MẪU CÂY TƯƠI CÓ HOA HÌNH 3.3: THÂN CÂY HÌNH 3.2: MAU c â y khô có hoa HÌNH 3.4: RẺ CÂY HÌNH 3.5: VIPHÂU LÁ NGÓN HĨNH 3.6: VIPHÂU THÂN NGÓN HÌNH 3.7:BỘT RỄ, THÂN, LÁ HÌNH 3.8: VI PHAU r ễ V2 1 ngón 12 3 HÌNH 3.9: ẢNH SẮC KÝ Đ ồ CỦA RỄ(1) THÂN (2) LÁ (3) VÀV2 HÌNH 3.10: ẢNH TINH THE V2 Spectrum /Peak Report Method file Information Data File : : : Date 5/15/2003 Time 23:25:18 Mau G Overlaid Spectra: # Name 1 Thu 1 ]_ Report g e n e r a t e d by Peaks(nm) 264.0 *** *** Abs(AU) Valleys(nm) Abs(AU) 0.76718 0.66778 *** *** 247.0 *** *** : Vung * *★ *** Signature: *** End Spe ctrum/Peak Report *** Page 1 of 1 Phong Hoa - Vien KHHS 4000 ______ 3000 1000 Collection time: Thu May 29 10:15:58 2003 2000 Wavenumbers (cm-1)_______ s W H > 0 H- p) 2 o 'd H- N 1 1 V M o o o o o to o o o o u> o o o o o o o o Ư1 o o o o a\ Qi o o o o o CD o U1 o Ư1 Ch •• Ư1 to o < o V 3 UJ VD o .Jocri CTi o o to tsj (jj K) UJ to o tSJ Ư1 to tSJ ơ\ G\ o U) to 00 o to V£> UJ o o tSJ 00 Ch ft hr 0 a ► 7»1 ■*— 1 u o i> H- s (D 1 £ Ờ M c HJ u CO 0 U) J H- 0) tN UJ b • i5 rr 0 Ơ > o o kQ s (D to o o NJ o 1—1 tò Ul CD U) 0) h-1 (D p) ft 0 H ica n 63 (4 . u / 2 m iru : Ivi - U i r j z j . u TV2 m/ z abund. m /z abund. 50.15 2687 61.15 566 51.15 1407 62 . 15 286 52.15 727 63 . 15 966 53.15 2331 64 . 15 335 54.25 1383 65 . 15 2078 55.15 8374 66 . 15 583 56.25 2817 67 . 15 2462 57.25 9063 68 . 15 1822 - 58.25 1023 69.20 4231 70 . 10 19536 59.. 15 484 71 . 10 10904 60.15 1439 S c a n 63 ( 4 . 0 7 2 m i n ) : M- D I P 3 2 3 . D TV2 m/ z 72 . 10 73 . 10 74 . 10 75 . 10 76 . 10 77 . 10 78 . 10 7 9 . 10 80 . 10 81 . 10 82 . 10 abund. 1107 2274 716 1260 2676 4676 1090 2077 904 2922 5719 m /z 83 . 00 84 . 10 85 . 00 86 . 00 87 . 00 88 . 10 8 9 . 10 90 . 10 91 . 10 92 . 10 93 . 10 abund. 67616 5201 45360 1193 7894 699 1609 489 2273 801 1872 m/ z abund. m/ z abund. 1993 105.00 94.10 2328 681 95.10 1741 106.10 107.10 1438 96.10 2033 1918 • 97.10 2410 108.10 1395 98.10 1386 109.10 110.00 99.10 1093 959 1822 1 1 1 .10 100.00 408 112.10 2286 101.10 1803 102.10 2081 113.10 3591 1018 103.00 1374 114.00 3477 115.10 104.00 3141 S c a n 63 ( 4 . 0 7 2 m i n ) : M- D I P 3 2 3 . D TV2 m/ z 1 1 6 . 00 1 1 7 . 00 118.00 1 1 9 . 00 120.10 121.00 122.00 123.10 124.10 1 2 5 . 10 126.00 abund. 1611 2330 2249 1366 9742 3130 2114 1137 795 1026 1119 m/ z 127.00 1 2 8 . 00 129.10 1 3 0 . 00 1 3 1 . 00 1 3 2 . 00 133.10 134.10 135.10 136.10 137.10 abund. 2883 2875 4376 2391 1173 2105 1135 1661 987 586 819 m/ z abund. m/z abund. 4588 1 5 0 . 00 138.10 736 2412 151.00 139.00 1977 4 158 152.00 140.00 1911 2153 153.00 141.10 1396 2784 154.00 142.00 912 1691 143.00 1840 155.00 1180 156.00 144.10 1365 1154 157.10 145.10 688 650 146.10 845 1 5 8 . 10 484 1 5 9 . 00 147.10 800 281 1 6 0 . 10 149.00 31824 S c a n 63 ( 4 . 0 7 2 m i n ) : M- D I P 3 2 3 . D TV2 m/ z 1 6 1 . 00 162.00 162.95 163.95 164.95 165.95 166.95 167.95 1 6 9 . 05 169.95 171.05 abund. 372 847 1083 1178 2713 2900 18408 5013 1572 940 900 m /z 172.05 172.95 174.05 174.95 175.95 176.95 177.95 178.95 179.95 180.95 '181 . 95 abund. 477 246 259 443 1406 1515 4066 2574 7193 3944 3172 abund. m /z m/z abund. 7002 183.05 1655 193.95 3526 184.05 853 195.05 3410 196.05 185.05 1286 1655 197.05 185.95 472 198.05 575 187.05 360 791 199.05 187.95 180 243 200.15 189.05 651 383 201.05 189.95 1614 202.05 655 190.95 4171 1 0 57 2 0 2 . 9 5 192.05 4395 5 8 1 2 2 0 3 . 9 5 192.95 3870 S c a n 63 ( 4 . 0 7 2 m i n ) : M - D I P 3 2 3 . D TV2 m/ z 205.05 205.95 2 0 7 . 05 208.05 209.05 210.05 211.05 212.05 213.05 214.05 215.05 abund. 3291 6131 3335 2819 2786 1250 606 324 1068 287 522 m/ z 2 1 6 . 05 217.05 218.05 219.05 2 2 0 . 05 2 2 1 . 05 2 2 2 . 05 2 2 3 . 05 2 2 4 . 05 2 2 5 . 05 2 2 6 . 05 abund. 1265 4163 5745 4314 4672 5046 2082 8431 2573 1200 214 m/z abund. m/ z abund. 227.15 436 2 3 8 . 05 600 2 2 8 . 15 633 239.15 387 229.15 632 2 4 0 . 15 113 2 3 0 . 05 1754 241.15 497 2 3 1 . 05 242.15 1266 495 452 232.05 3717 2 4 3 . 15 1088 2 4 4 . 05 3336 2 3 3 . 05 3744 2 4 5 . 05 845 2 3 4 . 05 3512 2 4 6 . 05 981 2 3 5 . 05 1117 2 4 7 . 05 1790 2 3 6 . 05 1179 2 4 8 . 05 1990 ; 237.05 S c a n 63 (4 . 0 7 2 m i n ) : M- D I P 3 2 3 . D TV2 m/z 273.10 274.10 275.10 276.10 2 7 7 . 10 278.10 2 7 9 . 10 280.10 281.20 284 .20 285.20 abund. , 315 300 1305 736 3168 2227 7969 1291 361 290 101 . m/ z 287.30 289.10 290.30 2 9 1 . 10 292.10 293.10 295.00 296.20 301 .20 3 0 5 . 10 3 0 6 . 10 abund. 121 314 174 1815 453 . 197 243 142 229 5690 33480 m/ z 2 4 9 . 05 250.05 251.05 252.15 253.15 254.05 255.15 256.15 257.20 257.90 259.10 abund. 2133 1698 4645 904 216 114 329 1562 568 193 598 m /z 260.10 261.00 262.00 2 6 3 . 10 264.00 265.10 266.10 267.00 269.10 2 7 1 . 10 272.20 abund. 537 1897 1809 6279 1420 577 128 126 149 170 102 m/ z 307.10 308.10 309.10 311.10 321.10 3 2 2 . 10 323 . 20 3 2 6 . 10 342 . 20 3 5 2 . 15 353 . 25 abund. 7303 1072 341 128 655 223 138 140 111 373 287 m /z 368.25 386.35 abund. 191 299 t , ■ĩTíP"— ■)/ ,— LP on . 1 . c| 5 7 27c Õ T 0. 98 8“ . ? 79“ i . t 04 3* 628 3. 604 3.184 3.161 u> . 0 45 Ln on^z ° 4.598 \ I—1 -------cn 3.069 h-4 1 b /3 . 653 4.2/0 4 .261 4 . 246 4 .237 4 .221 4 .217 3. 94 8 . 750^ ° o cn o o V. B t-1cn s to in DOơ) D ’-q M t\3 03 ă 1 TJ n o o CD CO w cn Ho 3 o vQ h-* T5 CJ 0) o OJ 11 o o M Qj o 3 U) n o CPi N cn T5 'TDz I r G I I— * o I o1— 1 1— ‘I II II li II n Ơ5 Ơ D H a D 50 > *Ms 1-* w Mẵ a lO 1 COƯ) D Du po PI tn X > Ư1 z o 2 o cn t-* l-» GJ t-h 1 o U) VD o II o •o li o o II o II h-1 u> o o CD o C UD (_n P>H-*V o D o u> ƯI U) U) K) VO-J o o cn -*o MC O o o Chh 1o o o o CD-J (— — 1OJ UDCTi o o o o o ► w c c Ư) ECDC CD ỮỈ ƯÌ n> N N n CD(V o o o w H D *1 G JO z H- tu K) tH o w 3 rt no 03 H (DfD 1 50 5c po 1 o o G > cn 2 o Ù3 c (_n Hw 3 H§ rr Ho K ) D c I-1 o rt o TJ 1U) Qj o Ch H- Qj I— D cn M 3 < -J o ^ cn • cn 0j o cn^Q c WH ww o1—• o cn OJ 3 ro LJ o o o fl) rt CD M o a t" < pi z H U) T3 p] z o ?)X > C O D SH o ZMM 2 0 fl> D o rt D ữi rt 0J 3.105 3.082 2.817 2.793 2.627 2. 610 2.598 2.591 2.583 2.419 2.390 2.377 2.370 2.348 2.324 1,8 94 1 .865 1.735 1 .697 1. 685 1. 673 1.320 1.306 1.292 1.255 0.936 0. 921 0. 906 0.896 1-3 < ro I Ó u 0 t5 10 1 M a DJ l-i 0) 3 rr H CD < M H w (/) / ij ■ 130 128 128 1 ọ cJ iZ 123 121 j_10 z u 888 821 197 9 95 028 123 879 77.279 77.025 56.904 45.281 42.635 30.385 20« 28 .547 25.261 23.773 22.993 14.054 10.972 10 * 0 0.000 ' r ơ i s ư ) ơì 'V CD CO o TI M tõ 03 1 DDIĨÌ CO TJ TJ TI t - ìr* tr* o a —* M o o H-* 1 M U) M Õ M T3 H-* ro ƯI tn CJ n 1—* o o TJ -J t\> CỰ 00 "J 3 o cn cr> n> 3 1- 00 r f X N 3 5: N W D II II II >v ii ỳó II ơ) T> 2 r t—> a Ó (—* o h-* K* CD II ii II ó o fD CĂ w HD i£l o ưi o o 1 a ẵ CO D po > o o M S CO D a: 1 —1 -9 0 CO H 2 H- ÍD 00 o ã ã o co 3 rr tr* tu fD ã) < X põ 1 o D a2 -3 o rì bi o c_n X > X > 2 2 3 3 (—> N) cn M t-* tr* £ D> Hi K> 1 —» 1 00 K) K) ơ) CJ 00 rt N II (—» II o l-» o o o h-1o o bc cr> II II £ a a a c II X 00 w á) II N a> II o ii ro a a D H a —» t— 1 PĨ n —» k> 1 o pi H-* co M o o o cn II ii II II II II II II -J I—* 1 1 —* II II o o o M o o o o t\> o o o o U) o o o o o o o o o o o o o o U) w co ư) (D (D Cữ o o o s c 1—’ o o 11 1— t— U) Ư1 M cr. o o Ch K) o o 0) o o co K DC (D N N o M cnưa C-nT3 cnv£ì U) CO ơ\ o »^ 1 > o ►Q "ơ P 3 2 o rỏ X > c o TJ 2 n n 2 m 1-5 Z o o c D Hw Hrt Ho Ũ) rt DJ 13 0» 1\ ) 3 o rr o T) H- 0j 1 —* OJ 0J < 00 o cn Qj c un o o o U) 3 t—1o o o rt (T) (D D ft &» 3 ro rt H (D (—1 K) k 3 (/> < I ò D 0 Co 1 o n3 LO o S U [...]... 25 và công thức cấu tạo như PHẦN IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Sau một thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp, chúng tôi đã thu được kết quả sau: * Về đặc điểm thực vật: Đã lấy mẫu, quan sát đặc điểm thực vật của cây nghiên cứu và Giáo sư Vũ Văn Chuyên đã định tên khoa học mẫu chúng tôi nghiên cứu là: Gelsemium elegans (Benth.), Loganiaceae Đã xác định đặc điểm vi phẫu rễ, thân, lá và đặc điểm. ..PHẦN III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 3.1.1 Đặc điểm hình thái cây lá ngón (Xem phụ lục hình 3.1; 3.2; 3.3; 3.4) Cây bụi leo mọc ở ven rừng, thân nhỏ hoặc vừa không có lông, lá mọc đối, hình trứng thuôn dài hay hơi hình mác, đầu nhọn phía cuống lá nhọn, mép nguyên, bóng, nhẵn, dài 10cm, rộng 5cm, mặt trên của lá mầu sẫm, mặt dưới mầu nhạt hơn, gân lá hình lông... bột rễ, thân, lá của cây lá ngón nghiên cứu góp phần nhận biết dược liệu * Về thành phần hoá học: • Bằng các phản ứng hoá học đã xác định trong ba bộ phận rễ, thân, lá của cây lá ngón có alcaloid, saponin, tanin, acid hữu cơ, đường khử, sterol • Bằng sắc kí lớp mỏng và sử dụng hệ dung môi thích hợp đã phát hiện được 8 vết alcaloid trong rễ, 7 vết alcaloid trong thân và 4 vết alcaloid trong lá • Đã định... cuống lá dài lcm Hoa nhỏ mọc thành xim ở đầu cành hay ở kẽ lá, bao hoa mầu phớt tím, cánh hoa mầu vàng Mẫu chúng tôi nghiên cứu đã được GS Vũ Văn Chuyên định tên khoa học là: Gelsemỉum elegans (Benth.), Loganiaceae 3.1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu của lá, thân và rễ * Cấu tạo giải phẫu lá (Xem phụ lục hình 3.5) Mặt cắt ngang có dạng đối xứng hai bên, lá được chia làm hai phần chính, phiến lá và gân lá. .. Biên bản định tên cây lá ngón 2 Ảnh cây lá ngón Hình 3.1: Mẫu cây tươi có hoa Hình 3.2: Mẫu cây tươi có hoa Hình 3.3: Ảnh thân cây Hình 3.4: Ảnh rễ cây 3 Ảnh vi phẫu lá, thân và bột rễ, thân, lá Hình 3.5: Ảnh vi phẫu lá Hình 3.6: Ảnh vi phẫu thân Hình 3.7: Ảnh bột rễ, thân, lá 4 Ảnh vi phẫu rễ, sắc ký đồ và tinh thể V2 Hình 3.8: Ảnh vi phẫu rễ Hình 3.9: Ảnh sắc ký đồ của rễ, thân, lá Hình 3.10: Ảnh... riêng lẻ hay thành từng đám hai đến ba hạt (8 ) - Có các mảnh mô mềm (2) - Các mảnh bần (9) Nhận xét: Các bộ phận của cây lá ngón có một số đặc điểm vi học đặc trưng - Giải phẫu lá: lớp tế bào biểu bì ở phần gân trên của lá có hình trứng, xếp đứng, kích thước lớn hơn các tế bào biểu bì phiến lá, libe bao quanh bó gỗ 12 - Bột lá có các mạch xoắn, các tế bào ở phần phiến lá có chất tế bào tạo thành khối... Chi,( 1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr 644 -645 5 Vũ Văn Chuyên, Tóm tắt họ thực vật, Nhà xuất bản Y học 6 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu,(1985) Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr 376 —398 7 Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam tập 2, Nhà xuất bán Y học, tr 288289 8 Trần Công Khánh,(1981) Thực tập giải phẫu và hình thái thực vật, Nhà xuất bản KHKT... Xếp thành từng bó, bên ngoài libe không có các sợi thành dầy hoá gỗ như ở phần thân cây - Gỗ (4) Có các mạch gỗ lớn, xếp trong mô gỗ bị các tia một thành dầy hoá gỗ chia ra từng bó vào gần đến tâm Mô gỗ phía trong liên tục và không có mô mềm ruột 11 3.1.3 Mô tả đặc điểm bột rễ, thân, lá của cây lá ngón (Xem phụ lục hình 3.7) * Bột lá: mầu xanh lục, mùi hắc Soi kính hiển vi nhận thấy có các đặc điểm. .. mầu từ vàng nhạt đến vàng đậm So sánh thấy hệ II tách tốt vì số lượng các vết xuất hiện nhiều và khoảng cách các vết ở xa nhau hơn Kết quả sắc ký khai triển với hệ dung môi II được trình bày ở hình 3.9 và ở bảng 3 2 Bảng 3.2 STT Kết quả định tính alcaloid bằng SKLM Màu VI V2 V3 V4 V5 V6 Vàng nhạt Vàng đậm Vàng Vàng nhạt Vàng Vàng V7 Vàng đậm V8 Vàng Lá Thân Rễ Màu Rf 0,045 Vàng nhạt 0,270 Vàng đậm... 2 phút, để yên cho tách thành 2 lớp Loại phần nước, cho vào phần ether 5ml dung dịch NaOH 10% Lắc thấy lớp ether có mầu vàng nhạt Thêm vào đó dung dịch H2 0 2 Lắc đều, đun cách thuỷ vài phút dung dịch trở nên không mầu Phản ứng âm tính Nhận xét: trong rễ, thân, lá của cây lá ngón không có antranoid - Định tính saponin: + Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho 5 giọt dịch chiết cồn vào ống nghiệm có 5ml nước, ... Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hoá học ngón Gelsemium elegans Benth., Loganiaceae ” với nội dung sau: Về mặt thực vật: - Mô tả đặc điểm thực vật, định tên khoa học mẫu nghiên cứu - Xác... pháp nghiên cứu PHẦN THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 10 3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 10 3.1.1 Đặc điểm hình thái ngón 10 3.1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu rễ, thân, l 3.1.3 Đặc. .. Về đặc điểm thực vật: Đã lấy mẫu, quan sát đặc điểm thực vật nghiên cứu Giáo sư Vũ Văn Chuyên định tên khoa học mẫu nghiên cứu là: Gelsemium elegans (Benth.), Loganiaceae Đã xác định đặc điểm