Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận

Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BO Y TE TRUONG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYÊN THỊ THƯƠNG

GHIEN CUU DAC DIEM THUC VAT VA THANH PHAN HÓA HỌC AY DA TU BIEN (LIMNOCITRUS LITTORALIS (Migq.)Sw.), HO CA

(RUTACEAE) Ở NINH THUẬN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYÊN THỊ THƯƠNG

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS NGUYÊN VIET THAN va TSKH BANH NHU CUONG đã tận tình hướng dẫn, giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp

Luận văn này là kết quả của quá trình học tập gần 16 tháng liên tục Do đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể tất cả các thầy, cô trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã tham gia vào quá trình giảng dạy và trang bị cho tôi những kiến thức dé tơi có thể hồn thiện luận văn tốt nghiệp này

Tiếp đến tôi muốn gửi lời cảm ơn của mình tới các thầy cô, các em học sinh trường Cao đẳng kỹ thuật y tế II và các anh chị trong công ty dược phẩm Danapha đã tạo điều kiện, giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng

như làm luận văn

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới người thân,

bạn bè đặc biệt là chồng và con gái của tôi đã luôn động viên, giúp đỡ tôi

Tôi xin chân thành cảm ơn./

Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2012

Học viên

Trang 4

MỤC LỤC DAT VAN ;) 22 1 CHUONG 1: TONG QUAN sccssssssssstessssecsssseessneesnsceecaseesnneesennseesesesssees 3 I0) ca 3 1.1.1 (i0 0090/22, 10n6 3 1.1.2 Đặc điểm chung họ Cam (RutaCeaâ) ô<< 511111141 61161133 34 3 1.1.4 Đặc điểm thực vật chỉ LriOCÌfFIS so ccccccrerererersrereeerererrrsea 4

1.1.3 Dac diém thuc vat va phan bé cua loai Limnocitrus littoralis Miq 5 1.2 Thamh phan hoa hoe cecessececesesscscsescsesscscecssecscscsecececscsvevsecnencavers 6 I0 ái an 6 1.4 Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học TD họ Rutaceae 7

CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu - - - cĂc cSS S121 cv cv s2 12 2.2 Phương tiện nghiên CứỨU - - - - 2G 5 S2 1n 91 31 ve 12

2.2.1 Thuốc thử, dung mơi, hố chất 2 + + £keEE+zs+Evesrxererxerxre 12 ,„ŸÿyZ8 3t, 0š 0ia c0 0c 12 2.3 Phương pháp nghiên cứu - - 5-5 5 23s seeeersssesee 13 5 /n 1 13 2.3.2 0ó 1 14 2.3.2.1 Định tính các nhóm hoạt chất trong DL bằng phản ứng hóa học L4 "5 ⁄», ng ốốẦỐẦỐẦỐỒẶŠẶẶẠ 14

2.3.2.3 Dinh tinh can cdc PUAN HOQN riccccccccesseseccccesensnsecececsesesnuceceecesesssnneers 15

2.3.2.4 Phân lập và nhận dạng chất tỉnh khiế: -cccescsesskseeesrerees l6

2.3.2.5 Nghiên cứu về hóa học tỉnh dầu + sec ceESEeererereesrssrses 19

CHUONG 3: KẾT QUÁ THỰC NGHIỆM - 5-55 sccscececzxz 22

3.1 Nghiên cứu về thực vật -c-c cv sen 22

Trang 5

3.1.2 Cấu tạo giải phẫu của cành và lá .- - c5 se 23 3.1.2.1 Cấu tạo giải phẫu lá - - - Tc HH SE Sky cư 23 3.1.2.2 Cầu tạo giải phẫu CÀnh -c cv sen 24

3.1.3 Dac diém Vi hoc ccccccecceccuccecceccuceccuscaucaececeuseuseuseeeueces 26

SP NN 5 an nên 26

nh“ 7n ne eẽa 26

3.2 Nghiên cứu về hóa học - - - CC S212 1s sem 27 3.2.1 Nghiên cứu về tỉnh dầu - - - - c Ăc S1 S1 ve 27 3.2.1.1 Độ ẩm trong MỢC ÌÏỆM c cv 27 3.2.1.2 Chỉ số VẬT lÚ ẶQc TQ TH ng TH TK Sky ch ch nh chu nha 28 3.2.1.3 Hàm lượng tỉnh đU - SH HS Sn cv ry vva 28 3.2.1.4 Định tính, định lượng các thành phần có trong tỉnh dấu lá, vỏ quả 29

3.2.2 Xác định sơ bộ thành phần hóa học trong lá và thân 31

3.2.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ trong thân 31

3.2.2.2 Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ trong lá 37

3.2.2.3 Định lượng và định tính căn ở các phân ẩoqn 41

3.3 Phân lập và xác định câu trúc thành phần hóa học 48 3.3.1 Chiết, phân lập các chất trong thân c << <<< ccc<<<e 48

3.3.2 Kiểm tra độ tỉnh khiết của chất LLI ‹ + +5 +s+ss**‡+++ss2 51

3.3.3 Chiết, phân lập các chất trong lá - c1 cS << <<e 52

3.3.4 Xác định cầu trtic LL1 eeeeeecceececeeeeeeenneeeeeeeeeseneteeeeeeeean 52 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN - c CC 11s s1 sea 56

4.1 Về phương pháp - - - - ccc cS S121 c1 S1 vs 56

4.2 Vé thure Vat ee ce cecceeeceeccusceuscesceueccusceucecsceceuscescensens 57

Trang 7

ACN: BuOH: CHC]:: Dc: Dd: MeOH: EtOAc: ESI-MS: GC-MS: HPLC: ‘H-NMR: '3C-NMR: IUCN: IR: MS: SKLM: SKC: Tt/kl: TD: TT: TLC: DANH MUC CAC CHU VIET TAT Acetonitrile Butanol Cloroform Dich chiét Dung dich Methanol Ethylacetat

Electrospray Ionization Mass Spectrometry Gas Chromatography—Mass Spectrometry High Performance Liquid Chromatography

Trang 8

DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang

1 | Hình 2.1: Sơ đô chiết phân đoạn các nhóm chât 18 2 | Hình 3.2: Ảnh hình thái cây Đa tử biên 23 3 | Hinh 3.3: Anh chụp vi phâu lá cây Đa tử biên 25 4_ | Hình 3.4: Ảnh chụp vi phẫu cành cây Đa tử biên 25

5 | Hinh 3.5: Ảnh chụp các đặc điểm bột thân cây Đa tử biên dưới 26

kính hiển vi

6 |Hình3.6: Anh chụp các đặc điểm bột lá cây Đa tử biên dưới 27

kính hiển vi

7 | Hình 3.7: Sắc ký đô phân đoạn cao ethylacetat với hệ dung môi | 45

ethylacetat : acid acetic : acid formic : nudc (10: 1:1: 2)

8 | Hinh 3.8: Sac ky đô phân đoạn cao ethylacetat với hệ dung môi 46

toluen: ethylacetat: aceton: acid formic (10: 2: 2 : 1)

9| Hình 3.9: Sắc ký đô phân đoạn căn n — Butanol 41 10 | Hình 3.10: Ảnh chất phân lập từ thân cây Đa tử biến 49

Trang 9

DANH MỤC BẢNG BIÊU TT Tên bảng Trang 1 Bang 1.1: Thanh phan va ham luong tinh dau v6 qua gidng Citrus 8 ho Cam (Rutaceae)

2 Báng 3.2: Độ âm trong lá cây Đa tứ biến 27 3 Bảng 3.3: Độ âm trong vỏ quả cây Đa tử biến 28

4 | Bảng 3.4: Chỉ sô vật lý của tỉnh dầu vỏ quả và lá cây Đa tử biên 28

5 Bảng 3.5:Tỷ lệ % tinh dâu trong lá Đa tử biên 28 6 Báng 3.6: Tỷ lệ % tỉnh dâu trong vỏ quả cây Đa tử biên 29

7 Bảng 3.7: Kết quả định tính và định lượng (%) các thành phân 29

trong tinh dầu vỏ quả cây Đa tử biên

8 Bang 3.8: Két quả định tính và định lượng (%) các thành phân 30

trong tinh dầu lá cây Đa tử biên

9 Bảng 3.9: Kết quả định tính các nhóm chất chính trong trong thân 40

và lá cây Đa tử biển bằng các phản ứng hóa học

10 | Bảng 3.10: Hàm lượng cao trong từng phân đoạn chiết thân 42 11 | Bảng 3.11: Hàm lượng cao trong từng phân đoạn chiết lá 42 12_ | Bảng 3.12: Kết quả định tính cao các phân đoạn trong thân 43 13_ | Bảng 3.13: Kết quá định tính cao các phân đoạn trong lá 44 14 | Bảng 3.14: Chương trình dung môi rửa giải 51

15 | Bảng 3.15: Số liệu phô "H- va ‘C-NMR cua chat LL1 53

Trang 10

DAT VAN DE

Việt Nam, với vị trí tự nhiên hiễm có, một mặt gan lién voi luc dia, mat khác thông với đại dương, lại năm trong vành đai nhiệt đới gió mùa, khí hậu có nhiều nét độc đáo và đa dạng, thay đối từ điều kiện khí hậu nhiệt đới điển hình ở vùng núi thấp phía Nam, đến khí hậu mang tính chất á nhiệt đới vùng

núi cao các tỉnh phía Bắc thậm chí có những vùng nhỏ đậm sắc ôn đới như Đà

lạt, Sapa Điều kiện tự nhiên đó thực sự là sự ưu đãi cho đất nước và con

người Việt Nam một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, một tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc nói riêng và tài nguyên dược liệu nói chung Theo kết quả điều tra khảo sát của các nhà nghiên cứu khoa học đa ngành khác nhau

cho biết, Việt Nam có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao có mạch, đã xác định tên của 8.000 loài, 600 loài nắm, 800 loài rêu và hàng trăm các loài tảo lớn [51] Trong đó có tới gần 4.000 loài thực vật bậc cao và bậc thấp được

dùng làm thuốc, chúng được phân bố rộng khắp cả nước [51] Nguồn thực vật phong phú này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị, có hoạt tính sinh học cũng như ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác

nhau của cuộc sông, đặc biệt dùng làm thuốc chữa bệnh

Cây Đa tử biển thuộc họ Cam (Rutaceae), có ở một số nước Đông Nam Á Ở Việt Nam, cây mọc ở Trung bộ và Nam bộ đặc biệt là tỉnh Ninh Thuận [16], [20] Cây này còn được gọi là cây Cam đường, là dược liệu được sử

dụng tương đối phố biến trong y học cổ truyền dân tộc Chăm Nhưng do việc khai thác sử dụng không hợp lý nên nó đã được tô chức IUCN đưa vào sách

đỏ thực vật có nguy cơ đe dọa Mặt khác, hiện nay Đa tử biển đã có tên trong các tài liệu cây thuốc nhưng chưa được nghiên cứu đầy đủ về dược liệu học

Trang 11

1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Đa tử biến

2 Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá và thân mẫu nghiên cứu 3 Nghiên cứu tinh dầu có trong lá và vỏ quả mẫu nghiên cứu

Để thực hiện mục tiêu đề ra, dé tài được tiễn hành với các nội dung sau: I Đặc điểm thực vật: Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu lá,

thân, đặc điểm bột lá, bột thân Đa tử biển Kiểm định tên khoa học

2 Thành phần hóa học của lá và thân: Định tính các nhóm chất bằng

phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng đối với cao các phân đoạn của các mẫu

nghiên cứu Chiết xuất, phân lập và xác định câu trúc của chất tinh khiết

3 Nghiên cứu tỉnh dầu: Tiễn hành chiết xuất và định lượng tính dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước Định tính, định lượng các thành phần có trong tinh dau bang phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ Bên cạnh đó

xác định một số chỉ tiêu lý học (tỷ trọng, chỉ số khúc xạ) của tỉnh dầu

Trang 12

-11-CHUONG I: TONG QUAN

1.1 Thue vat:

Qua quan sát đặc điểm hình thái, Đa tử biển là một loài thuộc chi Limnocitrus Migq., ho Cam (Rutaceae)

1.1.1 Vi tri phan loai chi Limnocitrus

Theo khung phan loai thuc vat cua Takhtajan 1987, vi tri phần loại của chi Limnocitrus nhu sau [15], [20], [45]:

Gidi thuc vat: Plantae

Nganh Ngoc lan: Magnoliophyta Lop Ngoc lan: Magnoliopsida

Phân lớp Hoa hồng: Rosidae

Liên bộ Cam: Rutanae Bo Cam: Rutales

Ho Cam: Rutaceae

Chi Da tir bién: Limnocitrus 1.1.2 Dic diém chung họ Cam (Rutaceae)

s* Đặc điểm thực vật

Cây gỗ, bụi, cây cỏ có túi tiết tỉnh dầu, nhị ngoài dĩa mật, vòng ngoài

thường đối diện với cánh hoa Lá đơn hoặc lá kép, mọc so le hay mọc đối, không có lá kèm Cụm hoa là xim, hoa thường đều, lưỡng tính, mẫu 5, các

thành phần của bao hoa rời Nhị có vòng ngoài thường đối diện với cánh hoa

Bộ nhụy thường có 4-5 lá noãn dính liền thành bầu trên, có khi nhiều lá noãn (15-20), số ô của bầu bằng số lá nỗn, mỗi ơ có 1-2 hay nhiều noãn đính trung

trụ Quả nang hay mọng loại cam, có khi quả tụ gồm nhiều quả đại Hạt

Trang 13

Họ này còn có nhiều tên khoa học khác: Arnyridaceae Kunth (1824);

Aurantiaceae Durande; Boroniaceae J.Agardh; Cneoraceae Vest (1818); Correaceae J.Agardh; Cusparia ceae (DC) Tratt; Dictamnaceae Vest;

Diosmaceae R.Br; Diplolaenaceae J.Agardh; Flindersiaceae (Engl);

Fraxinellaceae Ness; Pilocarpaceae J.Agardh; Ptaeroxylaceae J-F.Leroy

(1960); Pteleaceae Kunth; Zanthoxylaceae Bercht va J.pest [11], [17]

“+ Phan loại

Họ này chia làm 4 phân họ:

+ Rufoideae: Có các lá nỗn hồn toàn tách biệt, nó chỉ liên kết với

nhau ở vòi và đầu nhụy, quả nạc, có các tông sau: Rưfeae, Zanthoxyleae,

Boronieae, Diosmeae, Cusparieae [50]

+ Toddaloideae: Các lá noãn dính, quả bao gồm 2-4 qua hach con [50] + Rhabdodendroideae: Các lá noãn hợp nhưng phân biệt bởi để phình to + Auranrioideae: Bầu nguyên và quả lớn [50]

Limnocitrus littoralis Miq thudc phan ho Aurantioideae [49] “* Da dang va su dụng

Ho Cam (Rutaceae) có 150/1600 phan bố rộng ở nhiệt đới, cận nhiệt

đới và ôn đới, nhất là Nam phi và Australia Ở Việt Nam có khoảng 110 loài,

thudc 30 chi [6], [17]: Acronychia, Aegle, Atalantia, Boenningghausenia,

Citrus, Clausena, Euodia, Feronicella, Fortunella, Glycosmis, Limnocitrus, Limonia, Luvunga, Maclurodendron, Micromelum, Murraya, Naringi, Paramignya, Phellodendron, Pleiospermium, Ruta, Severinia, Skimmia, Tetradium, Thoreldora, Tolddalia, Triphasia, Zanthoxylum

1.1.3 Dac diém thuc vét chi Limnocitrus

Cây bụi hoặc cẫy nhỡ, cành nhẫn, có gai mập mạp Lá đơn, mọc so le,

nhẫn, cứng, dai, phiến lá hình bầu dục hay hình trái xoan ngược mép khía

răng cưa, cuông lá ngăn Cụm hoa ngù mọc ở đâu cành Hoa trăng thơm, có 4-

Trang 14

-13-5 cánh không dính liền nhau, hình trứng Đài hình tam giác, có 4 13-5 lá đài dính

liền nhau Bộ nhị có 10 nhị rời nhau, chỉ nhị nhẵn, bao phấn thuôn dài, trên

bao phần có 15-20 rãnh dọc Bầu nhụy gần hình cầu, chia 4-5 ô, mỗi ô có 2 lá

noãn Quả hình cầu hoặc gan hình cầu, khá lớn đường kính 3,5-4cm, lúc non

có màu xanh khi chín chuyển thành màu da cam, vỏ quả mỏng có nhiều túi

tiết tinh dầu, thịt không nhiều, hóa nhây Hạt lớn, phẳng hình bầu dục, cứng,

có lớp màng màu trăng bao bọc phía ngoài và có lá mầm màu xanh [49]

Chi Limnocitrus chi cé 1 loài duy nhat: Limnocitrus littoralis Miq.[20],

[45]

1.1.4 Dac diém thwe vat va phan bé cia lodi Limnocitrus littoralis Miq Cây nhỡ cao 2m, cành thắng màu nâu xám, gai to dài I-2cm Lá đơn,

mọc so le, nhẫn, cứng và hơi dai, hình bầu dục hay trái xoan ngược, dài 5—

7,5cm, rộng 3-4cm, gân phụ 8-11 cap nghiêng một góc 40-60” so với gân chính, có rất nhiều túi tiết tinh dầu Hơi khía tai bèo ở mép lá, cuỗng lá hình trụ có kích thước 3,5-7 x1-l,5mmm Cụm hoa có kích thước 3-4 x 2,5-5cm, đầu trục cụm hoa phân thành các công hoa nhỏ dài 2,5-3,5mm có lông trăng mịn Dĩa mật hình chén cao 0,5-0,6mm, rộng 1,5-1,6mm Hoa trăng thơm, có 4-5

cánh rời nhau, nhẵn, hình trứng, dài 7,5—10mm Đài hình tam giác, dài 2-

3mm, nhan không có lông, có 4-5 lá đài màu xanh dính liền nhau Nhị có 8-10 nhị, chỉ nhị thuôn dài, bao phan đài và mảnh (4,5-Imm) Nhụy hoa dai 10- 11mm, bau nhuy gan hinh cau cao 4,5-5mm, rộng l,7-2rmmm, có lông tơ nhỏ

màu trắng ở phía dưới bầu phía trên hầu như không có, chia làm 5 ô, mỗi ô 2

lá noãn, đính noãn trung trụ; vòi nhụy dài 4mm, có các nốt màu nâu nhỏ li tỉ Quả hình cầu, đường kính 3-5cm, lúc non có màu xanh khi chín có màu vàng, vỏ mỏng chứa nhiều túi tiết tỉnh dâu, thịt không nhiều và hóa nhây, chia làm 3-5 ô, mỗi ô chứa 1-2 hạt Hạt hình cầu, có vỏ lụa màu trăng bao bọc ở phía

Trang 15

Phân bố: Cây ưa sống ở những vùng khô và nóng Phần lớn cây tập trung ở bờ nam của đảo Java thuộc Indonesia Ở Việt Nam cây mọc ở Trung bộ và Nam bộ đặc biệt là tỉnh Ninh Thuận [16], [20], [45]

1.2 Thành phần hóa học

Ở Việt Nam, cho đến nay, Đa tử biến là đối tượng hoàn toàn mới chưa có bất kỳ một tài liệu về cây thuốc nào công bố thành phân hóa học

1.3 Công dụng của Đa tử biến

Đa tử biến có tác dụng chữa ho, long đờm, hạ sốt, chống viêm và ngăn chặn sự lão hóa của tế bào da [9], [40] Dịch chiét Limnocitrus littoralis Mig

có mặt trong một số công thức mỹ phẩm như: kem làm mờ vết nhăn, kem chống nắng, kem lót, phan trang điểm, sữa dưỡng thê [40]

Y học dân gian tộc Chăm sử dụng dược liệu này số lượng lớn trong nhiều bài thuốc:

e_ Bài 1: Bài thuốc chữa viêm phế quản [9]

Đa tử biển 20g

Dây chiều vàng 20g

Chita tri: Ho, ho cé dom, dau cuống họng, sốt, nuốt nước miếng khó,

khò khè khó thở

Cách dùng: Sắc uống ngày một thang

© Bài 2: Bài thuốc chữa ho [9]

Đa tử biển 20g Vỏ sung 20g

Chữa trị: Ngứa cô, ho, ho khan, ho có đờm, nhiều lúc ho thở khò khè,

chảy nước mũi

Cách dùng: Ngày sắc 2 thang, mỗi thang sắc I lần Đồ 3 chén nước, sắc còn § phân uống (sắc lửa nhỏ)

Trang 16

-15-© Bài 3: Bài thuốc chữa đau thần kinh toa [9] Đa tử biển 20g Than lan dây 16g Co ching 16g Sung rimg lốp Ma dương 16g Chanh rừng 16g

Chữa trị: Đau ngang thắt lưng, đau lan xuống mông, xuống đùi, xuống

mặt sau căng chân, cúi ngửa không được, di lai han chế

Cách dùng: Sắc uống ngày một thang

e_ Bài 4: Bài thuốc chữa ho [9]

Đa tử biển 30g Hương nhu rừng 20g Bình vôi 20g Lá cam thảo dây 10g

Chữa trị: Đau đầu số mũi, ho khan, ho có đờm, ho đau tức ngực, đau rát

cuống họng không ngủ được

Cách dùng: Ngày uống 1 thang, 1 thang sắc 2 lần Đồ 3 chén nước, sắc còn 5 phân

1.4 Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học tỉnh dầu họ Cam

(Rutaceae)

Trên thế giới, thành phần hóa hoc tinh dau vo qua Citrus dA duoc

Trang 17

sesquiterpen, hợp chất chứa oxy Trong đó terpen hydrocarbon chiếm khoảng 95%, nhóm hợp chất chứa oxy chỉ có khoảng 5%

Ở Việt Nam, Phạm Minh Hoàng và Trịnh Hoàng Hiếu khảo sát tinh

dau vé qua giéng Citrus ho Rutaceae bang GC-MS két qua thu duoc trong

các mẫu tinh dau cua Budi (Citrus decumana), Cam (Citrus aurantium),

Chanh (Citrus medica), Quat (Citrus japonica) lan luot c6 23, 18, 37, 11

thanh phan [18], [19] Trong đó thành phan chính ở các mẫu nghiên cứu trên

chủ yếu là Limonen

Trịnh Hoàng Hiếu cũng đã tiến hành khảo sát thành phần hóa học tỉnh

dầu lá Quất bằng phương pháp GC-MS thấy có 6 thành phần gỗm: Elemol (18%); Ø-Eudesmol (16%); Epibiciclosesquiphelandren (16%); Limonen

(1,45%); Elemol (17,72%); Guaien (6,65%) [19]

Kỹ sư Nơng Ích Thượng nghiên cứu về thành phần hóa học của vỏ quả

và lá Mắc mật (Ciausena indica) thấy: hàm lượng tỉnh dầu trong vỏ quả là

5,55%, có 9 thành phân trong đó chủ yếu là Ø-Myrcen (70%); lá chứa 2,71%

tinh dau, gồm có 11 thành phân, trong đó Mỹyristicin (40,37-56,04%) và p- cymen-8-ol (18,58-22,45%) là hai thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất [29] Hàm

lượng tỉnh dầu trong lá Chanh Việt Nam chỉ ở mức 0,09-0,11%, có chứa

Citral a (24,7%); Citral b (6%); Borneol (5%); Linalylacetat (2,5%); Benzaldehyd (6%) [4] Bang 1.1 Thanh phan và hàm lượng tỉnh dầu vỏ quả giống Citrus họ Cam (Rutaceae)

TT Tên cau phan Ham luong (%)

Trang 18

TT Tên câu phân Hàm lượng (%)

Trang 19

TT Tên câu phân Hàm lượng (%)

Trang 20

TT Tên câu phân Hàm lượng (%)

Trang 21

CHUONG II: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Mẫu nghiên cứu được thu hái tháng 07/2011 tại Ninh Phước, Ninh Thuan gom:

- Cây tươi mang hoa để giám định tên khoa học và làm tiêu bản mẫu khô

- Cây tươi mang hoa, lá để làm tiêu bán vi học cầu tạo giải phẫu

- Lá, thân phơi khô, làm nhỏ, bảo quản trong túi milon kín, để nơi khơ ráo, thống mát làm mẫu nghiên cứu thành phần hóa học

Lá cắt nhỏ để cất tinh dầu thu hái tháng 10/2011 tại Ninh Phước, Ninh Thuận

Vỏ quả cắt nhỏ để cất tinh dầu thu hái tháng 05/2012 tại Ninh Phước,

Ninh Thuận

2.2 Phương tiện nghiên cứu:

2.2.1 Thuốc thử, dung mơi, hố chất:

Các thuốc thử, dung mơi, hố chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu

chuẩn theo Dược điển Việt Nam III, IV

- Các dung môi: Methanol, Ethanol, Cloroform, Ethylacetat, n-Hexan

- SKLM: Ding ban mong trang san Silicagel 60 Fos, (Merck)

- Sắc ký cột: Chất nhỏi cột là Silicagel pha thường, cỡ hạt 60-200um

(Merck)

- Các thuốc thử: Dragendorff, Bouchardat 2.2.2 Phương Hiện và máy móc:

- Kinh hién vi Leica Wetzlar GmbH - Kính soi nôi Krussoptroni

- Cân kỹ thuật Precisa

Trang 22

21 Tu say Shellab

- Máy xác định độ âm Satorius

- Máy cắt vi phẫu cầm tay

- Máy ảnh kỹ thuật số Cannon

- Máy sắc ký khí GC/MS-QP 2010 Shimadzu

- Bộ dụng cụ cất tỉnh dầu

- Máy chấm mẫu Linomat 5 của Camag (Thụy sỹ)

- Máy đốt bản mỏng (Camag-Thụy sỹ)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Máy: Shimadzu, Nhật) - SKLM: Ban mong trang san Silica gel GF254 cua hang MERCK (Dic) - Sac ky cét: chat hap phy 18 Silicagel GF.5, (MERCK)

- Nhiệt độ nóng chảy được đo trên máy đo nhiệt độ nóng chảy

Gallenkamp, Sanyo, Nhật Bản (tại Viện Dược liệu)

- Phố tử ngoại (UV) được đo trên máy đo quang phố UV-VIS 1800

Shimadu, Nhật Bản (tại Viện Dược liệu)

- Phố hồng ngoại (IR) được đo bằng máy do FT-IR Spectrophotometer

1650-Perkin Elmer (tại Viện hóa học, VASTT)

- Phố khối (ISI) được đo trên máy LC/MS/MS-Waters-API-ISI (Viện

Hóa học, VASTT)

- Phd cộng hưởng từ hạt nhân (H- và !C-NMR) được đo trên máy đo Bruker 500 MHz (Vién Hóa học, VAST)

Trang 23

® Nghiên cứu đặc điểm vi học theo các tài liệu [5], [6]

e Gidm định tên khoa học của mẫu nghiên cứu [5]

- Sử dụng khóa phân loại tới họ, chi và loài trong tài liệu

- Đối chiếu với mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật [5]

- So sánh đối chiếu với mẫu tiêu bản trong phòng tiêu bản HNIP (Bộ môn

Thực vật-Trường Đại học Dược Hà Nội), HNU (Khoa Sinh— Trường Đại học khoa học tự nhiên-Đại học Quốc gia Hà Nội) và HN (Viện Sinh thái và Tài

nguyên Sinh vật-Trung tâm khoa học Tài nguyên và công nghệ Quốc gia)

2.3.2 Về hóa học

2.3.2.1 Định tính các nhóm hoạt chất hữu cơ trong được liệu bằng phản ứng

hóa học

Lá và thân cây tươi tách riêng, sẵy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 60C

Đem tán nhỏ riêng lá, thân bằng thuyền tán thành bột thô, bảo quản trong túi

nilon kín, để ở chỗ thống mát, khơ ráo để làm các phản ứng hóa học định tính riêng đối với từng loại bột dược liệu theo tài liệu [1]

2.3.2.2 Chiết xuất

* Xác định độ âm của dược liệu:

Lay 5g bột được liệu để xác định độ âm Bật máy đo độ âm, điều chỉnh nhiệt độ 110°C Dé dược liệu lên đĩa cân và trải đều trên mặt đĩa, đậy đĩa cân

và cho máy tự hoạt động, sau khoảng 10 phút máy sẽ tự động hiện kết quả

Tiến hành 3 lần, lẫy kết quả trung bình * Định lượng các cao:

Cân chính xác khoảng 100g dược liệu cành và 100g dược liệu lá Đa tử biển đã xác định độ âm Ngâm lạnh bằng MeOH trong bình chiết Thu hồi

dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao MeOH toàn phần Hòa tan cao MeOH toan phần vào một lượng vừa đủ nước nóng, thu được dịch chiết nước Dem dich chiét nước lắc lân lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dân

Trang 24

-n-hexan, cloroform, ethylacetat, và n-butanol voi méi loai dung môi lắc kỹ

đến khi nào dung môi trong suốt thu được 4 phân đoạn dịch chiết Các dịch chiết được cất thu hồi dung môi ở 60°C, thu được các cao tương ứng Chiết theo sơ đồ hinh 2.1

Cao các phân đoạn thu được đem say ở nhiệt độ 40°C tới khối lượng không đổi Quá trình chiết xuất được lặp lại 3 lần Hàm lượng cao là kết quả trung bình của 3 lần thực nghiệm Xác định hàm lượng cao trong từng phân

đoạn bằng phương pháp cân Hàm lượng cao các phân đoạn được tính theo công thức _ a ~ Mx(1-x) x100 Trong đó: F: Hàm lượng chất (%) a: Khối lượng căn (g)

M: Khoi lượng dược liệu đã say kh6 (g) X: Độ âm của dược liệu

2.3.2.3 Định tính cắn các phân đoqn

* Định tính các cao bằng phản ứng hóa học:

Cao ở các phân đoạn lần lượt được tiễn hành định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học theo tài liệu [I1], [13]

* Định tính các cắn bằng SKLM:

- Tiến hành nghiên cứu sắc ký lớp mỏng đối với các cao của mẫu

nghiên cứu (lá và thân) theo tài liệu [1], [13]

- Pha tinh: Su dung ban mong Silicagel 60 F254 cua hang Merck Truc

khi cham, ban mỏng được hoạt hóa 110C trong Í giờ

- Pha động: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để các chất được tách tốt

Trang 25

- Dung mdi cham sac ky: MeOH

- Bình sắc ký rửa sạch, sấy khô, lót một lớp giấy lọc cao gần miệng và kín 3 mặt thành trong của bình

- Bão hòa dung môi: rót dung môi đã pha ở trên từ từ theo thành bình, để yên cho dung môi bão hòa

- Châm sắc ký:

+ Lay một lượng mẫu thích hợp vào xilanh, đưa xilanh vào hệ thống

bơm mẫu tự động Lập file cho mỗi mẫu phân tích Nhập các thông số cần

thiết: độ rộng vết, số lượng vết, thể tích mẫu cham

+ Song song với quá trình bơm mẫu là quá trình làm khô tự động dịch

chiết trên bản mỏng bằng khí nén

- Triển khai sắc ký:

+ Đặt thắng bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi, đậy kín,

để yên, quan sát quá trình tách đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng khoảng 2cm thì lẫy bán mỏng ra, đánh dấu đường dung môi và để khô tự nhiên trong tủ hốt

+ Quan sát và chụp ảnh bản mỏng sắc ký dưới ánh sáng trăng và ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254nm và 366nm và sau khi phun thuốc thử hiện màu

2.3.2.4 Phân lập và nhận dạng chất tỉnh khiết

Sử dụng phương pháp sắc ký cột thông dụng để phân lập các chất trong phân đoạn ethylacetat Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng

Sử dụng các phố IR, UV, NMR, MS để xác định cầu trúc chất tỉnh

khiết

Cột sắc ký được tiến hành trên cột SIlicagel pha thường, có kích thước

hạt 60-200um

Trang 26

-25-Tiến hành:

- Chuẩn bị cột: Cột rửa sạch, sẵy khô, lắp thắng đứng trên một giá cố định

- Ôn định cột:

Dùng đũa thủy tính dài để lót một lớp bông (loại bông thắm nước) lên trên ống thoát dịch của cột

Cân Silicagel một lượng vừa đủ vào cốc có mỏ Thêm dung môi rửa

giải vào, dùng đữa thủy tinh khuấy đều cho tới khi hết bọt khí Mở vòi, rót

hỗn dịch trên vào cột, cho dung môi chảy và để Silicagel lắng tự nhiên xuống đáy cột Khi dung môi chảy gần hết trong cột, tiếp tục rót hỗn dịch trên vào cột Chú ý không để khô dung môi ở cột Tiếp tục dùng dung môi hứng được rót lên cột và cho chảy liên tục 1 thời gian Ôn định cột trong 12 giờ

- Đưa mẫu vào cột: Trộn đều một lượng bột Silicagel với dung dịch cắn ethylacetat, để dung môi bay hơi rồi đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều

đặn trên mặt silicagel

- Rửa giải:

+ Sử dụng hệ dung môi thích hợp + Kiểm soát tốc độ dòng chảy

+ Hứng dịch rửa giải bào bình nón, ống nghiệm với thê tích thích hợp

+ Kiểm tra các phân đoạn thu được bằng SKM, các phân đoạn cho sắc

Trang 28

-27-2.3.2.5 Nghiên cứu về hóa học tỉnh dấu

e Xác định chỉ số vật lý của tinh dầu Tỷ trong:

- Tỷ trọng tính dầu mẫu nghiên cứu được xác định bằng tỷ trọng kế, cân

trên cân phân tích có độ chính xác tới 0,0001g Nhiệt kế chia vạch 0,2”C

- Tỉ trọng (d) của tinh dầu được xác định bằng tỉ số giữa khối lượng của

tinh dầu và khối lượng nước cất có cùng thể tích và nhiệt độ Tỉ trọng của tinh

dầu được xác định bằng công thức sau:

20 _ 1H; — Eụ

đạp ~ m, _ LỬA

m;: Khối lượng trung bình của tỉnh dầu và bình đo tỉ trọng mị: Khối lượng trung bình của nước cất và bình đo tỉ trọng mạ: Khối lượng trung bình của bình đo tỉ trọng

Nếu xác định ở nhiệt độ (t) khác 20°C, tỷ trong cua tinh dau phải được

hiệu chỉnh về địa

- Cách tiễn hành:

+ Rửa sạch tỷ trọng kế bằng aceton, để khô tự nhiên, đem cân, ghi nhận giá trỊ mạ

+ Cho nước cất vào, đậy nắp và gắn nhiệt kế vào Lau khô bình bằng khăn giấy Cân và ghi nhận giá trị mị

+ Đồ nước ra, rửa sạch tỷ trọng kế lần nữa bằng aceton, để khô tự nhiên

Cho tinh dầu vào, đậy nắp và găn nhiệt kế vào Lau khô bình Cân và ghi nhận kết quả m; và nhiệt độ trên nhiệt kế

Từ công thức, tính được tỷ trọng cua tinh dầu (có hiệu chỉnh nhiệt độ)

Chỉ số khúc xạ:

- Chỉ số khúc xạ của mẫu tinh dầu nghiên cứu được xác định trên máy

Trang 29

Shanghai Physico-Optical instrument factory tại công ty được phẩm Danapha

- Chỉ số khúc xạ được tính theo công thức:

ni, =n’, +0,0004(t' — 2)

Ny: Chi sé khtic xa do 6 nhiét độ quy định t (20°C)

nọ: Chỉ số khúc xạ đo ở nhiệt độ t

- Cách tiễn hành:

+ Rửa sạch nơi chứa mẫu bằng aceton

+ Sau đó cho vài giọt tinh dầu lên chỗ chứa mẫu + Bật đèn, và chỉnh đèn về gần phía chỗ chứa mẫu

+ Chỉnh nút để thấy rõ vùng sáng tối trong mẫu Ranh giới giữa hai vùng là điểm cắt ngang của đường chéo

+ Bam nit “read”, doi máy đọc kết quả, ghi nhận lại

+ Sau đó bấm nút “temp” dé xem nhiệt độ, chi nhận kết quả e Xác định hàm lượng tính dâu [10]

+ Phương pháp: Cất kéo hơi nước với bộ dụng cụ cất tinh dau cải tiễn

+ Xử lý mẫu: vỏ quả và lá được xay nhỏ

+ Thời gian cất: Vỏ quả: 2,5-3h, lá: 3-3,5h

+ Hàm lượng tinh dầu được tính trên dược liệu khô tuyệt đối theo công

thức:

a

X% = b x100%

X: Ham luong % tinh dau (tt/kl)

a: Thé tich tinh dau doc dugc sau khi cat (ml) b: Khối lượng được liệu đã trừ đi độ âm ( gam)

+ Độ âm: Xác định băng phương pháp dung môi

Trang 30

-YM)

m

Độ ẩm = 100x(

V1: Số ml nước cất được sau lần cất đầu V2: Số ml nước cất được sau lần cất sau mẻ Số gam dược liệu đã đem thử

" Định tính và định lượng các chất trong tinh dầu lá, vỏ quả và cành trên

máy sắc ký khí kết hợp khối phô GC/MS-QP 2010 Shimadzu tại Viện Kiém

nghiệm

- Chuẩn bị dung dịch thử: Hút 60ul mẫu thử hòa tan trong 2940ul n- hexan, lắc đều, lọc, qua Na;SO¿ khan rồi tiêm sắc ký

- Điều kiện chạy máy sắc ký khối phố: Cột sắc ký khí DB-5MS (30x0,25 mm ID), khí mang He, tỷ lệ m/z từ: 40-200, nhiệt độ buông tiêm: 150C, nhiệt độ detector: 200°C, chương trình nhiệt độ: nhiệt độ ban đầu: 50°C Tang từ 50-125°C, 15”C/phút, giữ tại 125C trong 5 phút Tăng từ

Trang 31

CHUONG III: KET QUA THUC NGHIEM

3.1 Nghiên cứu về thực vật 3.1.1 Đặc điễm thực vật

Cây nhỡ cao 2m, cành thang màu nâu xám, gai to dai 1-1,5cm La don, moc so le, nhan, cứng và hơi dai, hình bầu dục, dài 4-5cm, rộng 2-3,5cm, gân

phụ 9-11 cặp, gân nhỏ rõ, nghiêng một góc 40-60” so với gân chính, có rất

nhiều túi tiết tinh dầu Hơi khía tai bèo ở mép lá, cuống lá ngắn hình trụ dai 1- I1,2mm Cụm hoa dạng tấn xim hai ngã ở ngọn cành, đầu trục cụm hoa phân

thành các cống hoa nhỏ dài 2-3mm có lông trắng mịn Hoa trắng thơm, có 5

cánh rời nhau, nhẫn, hình trứng, dài 9-12mm, tiền khai hoa vặn Đài hình tam giác dài 2-3mm, nhẫn không có lông, 5 lá đài màu xanh dính liền nhau, tiền khai đài kiểu van Bộ nhị có 8 nhị rời nhau chia làm hai vòng mỗi vòng 4 nhị,

vòng nhị ngoài đối diện với vòng cánh hoa, chi nhi thang dai 10-11mm; bao phẫn đính lưng, dài 1mm, hướng trong, trên bao phấn có các rãnh dọc Nhụy hoa dai 11mm, bau nhụy gần hình cầu cao 4mm, rộng 2mm, có lông tơ nhỏ

màu trăng ở phía dưới bầu, chia làm 5 ô, mỗi ô 2 lá noãn, đính noãn trung trụ; vòi nhụy dài 4mm, có các nốt màu nâu nhỏ li tỉ, núm nhụy màu đen xẻ 5 núm Bầu trên Quả mọng loại cam, hình cầu, đường kính 3-4,5cm, lúc non có màu xanh khi chín có màu vàng, vỏ mỏng chứa nhiều túi tiết tỉnh dầu, thịt không

nhiều và hóa nhây, chia làm 3-5 ô, mỗi ô chứa 1 — 2 hạt Hạt hình cầu phẳng, cứng, có vỏ lụa màu trắng bao bọc ở phía ngoài

Đối chiếu với bản mô tả ghi trong các tài liệu phân loại thực vật [20], [45], cây Đa tử biển được sơ bộ xác định thuộc chi Limnocitrus Miq., ho Cam (Rutaceae) và được TS Trần Văn Ơn - Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội xác định tên khoa học là: Limnocitrus littoralis Mig., ho Cam (Rutaceae)

Ảnh mẫu nghiên cứu được trình bày ở hình 3.2

Trang 32

Hình 3.2 Ảnh hình thái cây Đa tử biển

1 Quả và lá; 2 Cành mang quả; 3 Hoa; 4 Núm nhụy; 5 Hoa bồ dọc; 6 Bầu cắt ngang: 7 Nhụy; 8 Nhị; 9 Quả bổ ngang

3.1.2 Cấu tạo giải phẫu của cành và lá 3.1.2.1 Cầu tạo giải phẫu lá

Trang 33

s$% Phần gân lá:

Gân lá lồi ở cả 2 phía Ngoài cùng là lớp biểu bì trên và biểu bì dưới được cầu tạo bởi một hàng tế bào nhỏ hình chữ nhật, xếp đều đặn, thành phía ngoài hóa cutin bắt màu xanh Sát với biểu bì là mô dày trên và mô dày dưới được

cầu tạo bởi 2-3 hàng tế bào hình trứng dày Tiếp đến là mô mềm gồm các tế

bào hình trứng, không đều nhau, kích thước lớn hơn tế bào mô dày, thành mỏng, xếp lộn xộn, rải rác các tinh thê calci oxalat hình khối Vòng trụ bì hóa

mô cứng gần như liên tục bao quanh bó libe-gỗ gân chính, thành tế bào mô

cứng dày, hóa gỗ, bắt màu xanh Chính giữa gân là hệ thống dẫn gồm bó gỗ ở

trên, bó libe ở dưới s$* Phần phiến lá:

Biểu bì trên và biểu bì dưới có các tế bào hình chữ nhật kích thước nhỏ,

thành ngồi hóa cutin Mơ dậu gồm 1 hàng tế bào hình chữ nhật đều đặn, xếp

đứng vuông góc với biểu bì trên Các mảnh mạch xoắn, đám sợi, mảnh mach mang, tinh thé calci oxalat nam rai rac trong phan thit lá Có rất nhiều túi tiết tinh dầu to, bao bọc xung quanh là các tế bào tiết Ảnh chụp vi phẫu lá cây Đa

tử biên được trình bày ở hình 3.3 3.1.2.2 Cầu tạo giải phẫu cành

Mặt cắt vi phẫu cành gần hình tròn, từ ngoài vào trong có: Biểu bì ở

phân cành non hoặc bân ở phần cành già Sát biểu bì là phần mô mềm vỏ gồm

các tế bào hình câu hoặc hình đa giác vách móng, kích thước không đều nhau,

xếp lộn xộn chứa nhiều túi tiết rất lớn Trong lớp mô mềm vỏ, gần tiếp giáp với libe cấp 2 có những đám mô cứng tập trung thành 1 vòng khép kín xung quanh thân cây, bắt màu xanh Phần trụ được bắt đầu bởi vòng libe-gỗ cấp 2, libe ở ngoài, gỗ ở trong Libe cấp 2 gồm các tế bào có kích thước nhỏ, xếp

đều đặn thành hàng dọc, bắt màu hong Gỗ cấp 2 được câu tạo bởi các mạch

ngăn và mạch thông có kích thước lớn, thành dày, xen kẽ với mô mêm gô và

Trang 34

33-sợi gỗ có kích thước nhỏ hơn bắt màu xanh Trong cùng là mô mềm ruột gồm nhiều tế bào lớn, vách dày, tâm chất gỗ Tinh thể calci oxalat ít gặp trong mô

mềm vỏ nhưng khá nhiều trong gỗ cấp 2 Ảnh chụp vi phẫu cành cây Đa tử biển được trình bày ở hình 3.4

Hình 3.3 Ảnh chụp vi phẫu lá cây Đa tử biển

1 Biểu bì trên; 2 Mô day trén; 3 Tinh thé calci oxalate; 4 Té bao mé cứng; 5 Mô dậu; 6 Gỗ; 7 Mach mạng: § Libe; 9 Túi tiết tinh dầu; 10

Mô mềm; 11 Mô dày dưới; 12 Biểu bì dưới; 13 Bó sợi

1

2 Hình 3.4 Ảnh chụp vi phẫu cành

3 cây Đa tử biến

Trang 35

-3.1.3 Dac diém vi hoc

3.1.3.1 Bột thân

Bột cành cây Đa tử biển có màu vàng, mùi thơm, vị hơi ngọt Soi dưới kính hiển vi thấy có những đặc điểm: Tinh thê calci oxalat hình khối (1); Bó sợi mang tỉnh thể calci oxalat hình khối (2); Sợi dài hóa cương mô (3); Mảánh

mach diém (4); Manh mach vạch (5); Mạch cham hình đồng tiền (6); Tế bào cương mô thành dày, khoang rộng, thấy rõ các ông trao đối (7)

Ảnh chụp các đặc điểm bột thân cây Đa tử biển dưới kính hiên vi được

trình bày ở hình 3.5

Hình 3.5 Anh chụp các đặc điêm bột thân cây Đa tử biển dưới kính hiển vi

3.1.3.2 Bột lá

Bột màu nâu xám, có mùi thơm, vị hơi đăng, sơi dưới kính hiển vi thấy

có các đặc điểm: Tinh thể calci oxalat hình khối (1); Túi tiết tinh dầu (2); Các

hạt tỉnh bột hình trứng nằm riêng lẽ có các rốn dài nhưng không rõ vân tăng

trưởng (3); Lỗ khí (4); Mạch mạng (5); Bó sợi mang tinh thể calci oxalat hình khối (6); Sợi dài hóa cương mô (7); Mảánh mach xoắn hình lò xo (8); Manh

biểu bì (9)

Trang 36

35-Ảnh chụp các đặc điểm bột lá cây Đa tử biển dưới kính hiển vi được

trình bày ở hình 3.6

Hình 3.6 Anh chụp các đặc điêm bột lá cây Đa tử biên dưới kính hiến vị

3.2 Nghiên cứu về hóa học

3.2.1 Nghiên cứu về tỉnh dau

3.2.1.1 Độ ẩm trong được liệu

Lẫy 3 mẫu ngẫu nhiên ở 3 vị trí khác nhau của được liệu đem xác định

Trang 37

Bảng 3.3 Độ ẩm trong vỏ quả Đa tử biển Lan | Khôi lượng DL (g) Vi(m) | V2(ml) Độ âm (%) 1 10,03 1,95 8,95 69,79 2 10,05 2,00 9,05 70,15 3 10,04 2,00 9,05 70,15 Độ âm trung bình 70,03 3.2.1.2 Chỉ số vật lý

Tình dâu được chiêt tách từ vỏ quả và lá Đa tử biên có màu vàng nhạt,

mùi thơm Kết quả đã xác định được một số chỉ số vật lý trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Chỉ số vật lý của tỉnh dầu vỏ quả và lá cây Đa tử biển Nguyên liệu Ty trong Chỉ sô khúc xạ Vỏ quả 0,845 1,469 Lá 0,803 1,478

3.2.1.3 Hàm lượng tinh dâu

Lá, vỏ quả, mỗi loại lây 3 mẫu nghiên cứu đem cất tỉnh dâu băng

Trang 38

Bảng 3.6 Tỷ lệ % tỉnh dầu trong vỏ quả Đa tử biển Lân | KhôilượngDL | ThếtíchTD | Độâm | Hàm lượng TD (gam) (ml) (%) (%) 1 300,06 0,67 70,03 2,26 2 300,03 0,65 70,03 2,20 3 300,06 0,68 70,03 2,27 Trung binh 2,24

3.2.1.4 Định tính và định lượng sơ bộ các thành phần có trong tỉnh dầu lá và

vỏ quả Đa tử biến

Thành phần hóa học của tỉnh dầu vỏ và lá Đa tử biển được xác định

băng phương pháp GC-MS Kết quả thu được thê hiện ở bảng 3.7 và bảng 3.8 Các dữ liệu cụ thê về phô được trình bày ở phần phụ lục

Trang 39

Nhận xét: Sơ bộ xác định trong tỉnh dầu vỏ quả có 8 thành phản Chiém tỷ lỆ cao nhất 1,3,6 -Octatriene (46,79%,), tiếp đến d1-Limonen (15,17%) Thấp nhất là I- methyl—3-(1-methyl ethyl)-Benzene (2,61%)

Bảng 3.8 Kết quả định tính và định lượng (%) sơ bộ các thành phần trong tinh dau lá cây Đa tử biển TT Thanh phan Hàm lượng (%) Lân1 | Lân2 | TB 1 | B-Caryophyllene 3,90 4,20 4,05 2 | Cyclohexane 1,06 1,12 1,09 3 | Valencene 5,33 5,70 551 4 | 6 Panasinsene 27,91 29,73 28.82 5 1,5,8-p-Menthatriene 0,53 0,53 0,53 6 | Delta 3-Carene 1,73 2,02 1,88 7 |(R+)-Limonen 1,20 1,22 1,21 8 1,3,6-Octatriene 0,42 0,42 0,42 9 | B-Myrcene 21,17 22,27 21,72 10 | 2-6-Pinene 18,72 19,37 19,05 II | 6 Phellandrene 1,47 1,47 1,47 12 | 1R; 2,6,6-Trimethylbicyclo[3.1.1] 0,71 0,86 0,78 hept-2-ene Tổng 86,51

Nhận xét: Qua bảng trên ta thấy tinh dầu ở lá Đa tử biển sơ bộ có 12 thành phân, trong đó /-Panasinsene chiếm tỷ lệ cao nhất 28,82%, tiếp đến là

8-Myrcene (21,72%) Thấp nhất là 1,3,6-Octatriene (0,420%)

Trang 40

3.2.2 Xác định sơ bộ thành phân hóa học trong lá và thân cây Đa tử biển

3.2.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ trong thân cây Đa tử biển bằng phản ứng hóa học

© Dinh tinh Alcaloid:

Cho khoảng 10g bột thân vào bình nón dung tích 100ml, thắm âm bằng dung dịch amomiac đặc, đậy kín bình trong 30 phút Cho thêm 15ml cloroform, lắc đều, ngâm 12 gid Loc lay dịch chiết cho vào bình gạn Sau đó

lắc kỹ 2 lần, mỗi lần với 10ml dung dịch H;SOx 1N Dé phân lớp, gạn lấy dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết acid

+ Ông 1: 1ml dịch chiết + 2 giot tt Mayer + Ông 2: 1Iml dich chiết + 2 giot tt Bouchardat

+ Ong 3: 1ml dich chiét + 2 giọt tt Dragendorff

Kết quả: Cả 3 ống nghiệm đều không xuất hiện kết tủa Sơ bộ kết luận: Mẫu nghiên cứu khơng có alcaloid © Dinh tinh Glycosid tim:

Cho 20g bột thân vào bình nón dung tich 250ml, thém 60ml ethanol 20%, lắc đều, ngâm qua đêm Lọc lẫy dịch chiết loại tạp (chất nhày, chất nhựa) bằng chì acetat 30% để dư Đề lắng, lọc Loại chì acetat thừa bằng dung

dich Na2SO, bao hoa dén khi không còn tủa với Na;SO¿ nữa Lọc lẫy dịch lọc

vào bình gạn Lắc kỹ 2 lần với hỗn hợp cloroform : ethanol (4 : 1), mỗi lần

20ml, để lắng, gan lay dịch chiết, loại nước bằng cách lọc qua bông Cho dịch

chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ, đem cô cách thủy tới khô Căn thu được để làm phản ứng định tính:

+ Phản ứng Lieberman:

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn Iml anhydride acetic, lắc đều cho tan