Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY ĐA TỬ BIỂN LIMNOCITRUS LITTORALIS Miq.Sw., HỌ CAM R

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CÂY ĐA TỬ BIỂN (LIMNOCITRUS LITTORALIS (Miq.)Sw.), HỌ CAM

(RUTACEAE)

Ở NINH THUẬN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CÂY ĐA TỬ BIỂN (LIMNOCITRUS LITTORALIS (Miq.)Sw.), HỌ CAM

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS NGUYỄN

VIẾT THÂN và TSKH BÀNH NHƯ CƯƠNG đã tận tình hướng dẫn, giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp

Luận văn này là kết quả của quá trình học tập gần 16 tháng liên tục Do

đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể tất cả các thầy, cô trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã tham gia vào quá trình giảng dạy và trang bị cho tôi những kiến thức để tôi có thể hoàn thiện luận văn tốt nghiệp này Tiếp đến tôi muốn gửi lời cảm ơn của mình tới các thầy cô, các em học sinh trường Cao đẳng kỹ thuật y tế II và các anh chị trong công ty dược phẩm Danapha đã tạo điều kiện, giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như làm luận văn

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới người thân, bạn bè đặc biệt là chồng và con gái của tôi đã luôn động viên, giúp đỡ tôi Tôi xin chân thành cảm ơn./

Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2012

Học viên

Nguyễn Thị Thương

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Thực vật 3

1.1.1 Vị trí phân loại chi Limnocitrus 3

1.1.2 Đặc điểm chung họ Cam (Rutaceae) 3

1.1.4 Đặc điểm thực vật chi Limnocitrus 4

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Limnocitrus littoralis Miq 5

1.2 Thành phần hóa học 6

1.3 Công dụng 6

1.4 Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học TD họ Rutaceae 7

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu……….12

2.2 Phương tiện nghiên cứu 12

2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hoá chất 12

2.2.2 Phương tiện và máy móc 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Về thực vật 13

2.3.2 Về hóa học 14

2.3.2.1 Định tính các nhóm hoạt chất trong DL bằng phản ứng hóa học 14

2.3.2.2 Chiết xuất……… 14

2.3.2.3 Định tính cắn các phân đoạn 15

2.3.2.4 Phân lập và nhận dạng chất tinh khiết 16

2.3.2.5 Nghiên cứu về hóa học tinh dầu 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 22

3.1 Nghiên cứu về thực vật……… 22

3.1.1 Đặc điểm thực vật……… 22

3.1.2 Cấu tạo giải phẫu của cành và lá……… 23

3.1.2.1 Cấu tạo giải phẫu lá……… 23

3.1.2.2 Cấu tạo giải phẫu cành……… 24

3.1.3 Đặc điểm vi học………26

3.1.3.1 Bột thân……… 26

3.1.3.2 Bột lá……… 26

3.2 Nghiên cứu về hóa học……… 27

3.2.1 Nghiên cứu về tinh dầu……….27

3.2.1.1 Độ ẩm trong dược liệu………27

3.2.1.2 Chỉ số vật lý………28

3.2.1.3 Hàm lượng tinh dầu………28

3.2.1.4 Định tính, định lượng các thành phần có trong tinh dầu lá, vỏ quả 29

3.2.2 Xác định sơ bộ thành phần hóa học trong lá và thân………31

3.2.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ trong thân……….31

3.2.2.2 Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ trong lá……….37

3.2.2.3 Định lượng và định tính cắn ở các phân đoạn……… 41

3.3 Phân lập và xác định cấu trúc thành phần hóa học………48

3.3.1 Chiết, phân lập các chất trong thân……… 48

3.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết của chất LL1……… 51

3.3.3 Chiết, phân lập các chất trong lá……… 52

3.3.4 Xác định cấu trúc LL1……… 52

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN………56

4.1 Về phương pháp………56

4.2 Về thực vật……… 57

4.3 Về thành phần hóa học……….57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……….62 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ESI–MS: Electrospray Ionization Mass Spectrometry

GC-MS: Gas Chromatography–Mass Spectrometry

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

1H-NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectrometry

13C-NMR: Carbon (13) Nuclear Magnetic resonance

TLC: Thin Layer Chromatography

UV: Ultra Violete

DANH MỤC HÌNH

1 Hình 2.1: Sơ đồ chiết phân đoạn các nhóm chất 18

2 Hình 3.2: Ảnh hình thái cây Đa tử biển 23

3 Hình 3.3: Ảnh chụp vi phẫu lá cây Đa tử biển 25

4 Hình 3.4: Ảnh chụp vi phẫu cành cây Đa tử biển 25

5 Hình 3.5: Ảnh chụp các đặc điểm bột thân cây Đa tử biển dưới

7 Hình 3.7: Sắc ký đồ phân đoạn cao ethylacetat với hệ dung môi

ethylacetat : acid acetic : acid formic : nước (10 : 1 : 1 : 2)

45

8 Hình 3.8: Sắc ký đồ phân đoạn cao ethylacetat với hệ dung môi

toluen: ethylacetat: aceton: acid formic (10 : 2 : 2 : 1)

46

9 Hình 3.9: Sắc ký đồ phân đoạn cắn n – Butanol 47

10 Hình 3.10: Ảnh chất phân lập từ thân cây Đa tử biển 49

11 Hình 3.11: Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn Ethylacetat trong

2 Bảng 3.2: Độ ẩm trong lá cây Đa tử biển 27

3 Bảng 3.3: Độ ẩm trong vỏ quả cây Đa tử biển 28

4 Bảng 3.4: Chỉ số vật lý của tinh dầu vỏ quả và lá cây Đa tử biển 28

5 Bảng 3.5:Tỷ lệ % tinh dầu trong lá Đa tử biển 28

6 Bảng 3.6: Tỷ lệ % tinh dầu trong vỏ quả cây Đa tử biển 29

9 Bảng 3.9: Kết quả định tính các nhóm chất chính trong trong thân

và lá cây Đa tử biển bằng các phản ứng hóa học

40

10 Bảng 3.10: Hàm lượng cao trong từng phân đoạn chiết thân 42

11 Bảng 3.11: Hàm lượng cao trong từng phân đoạn chiết lá 42

12 Bảng 3.12: Kết quả định tính cao các phân đoạn trong thân 43

13 Bảng 3.13: Kết quả định tính cao các phân đoạn trong lá 44

14 Bảng 3.14: Chương trình dung môi rửa giải 51

15 Bảng 3.15: Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất LL1 53

về tài nguyên cây thuốc nói riêng và tài nguyên dược liệu nói chung Theo kết quả điều tra khảo sát của các nhà nghiên cứu khoa học đa ngành khác nhau cho biết, Việt Nam có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao có mạch, đã xác định tên của 8.000 loài, 600 loài nấm, 800 loài rêu và hàng trăm các loài tảo lớn [51] Trong đó có tới gần 4.000 loài thực vật bậc cao và bậc thấp được dùng làm thuốc, chúng được phân bố rộng khắp cả nước [51] Nguồn thực vật phong phú này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị, có hoạt tính sinh học cũng như ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt dùng làm thuốc chữa bệnh

Cây Đa tử biển thuộc họ Cam (Rutaceae), có ở một số nước Đông Nam

Á Ở Việt Nam, cây mọc ở Trung bộ và Nam bộ đặc biệt là tỉnh Ninh Thuận [16], [20] Cây này còn được gọi là cây Cam đường, là dược liệu được sử dụng tương đối phổ biến trong y học cổ truyền dân tộc Chăm Nhưng do việc khai thác sử dụng không hợp lý nên nó đã được tổ chức IUCN đưa vào sách

đỏ thực vật có nguy cơ đe dọa Mặt khác, hiện nay Đa tử biển đã có tên trong các tài liệu cây thuốc nhưng chưa được nghiên cứu đầy đủ về dược liệu học

Chính vì vậy, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành

phần hóa học cây Đa tử biển (Limnocitrus littoralis (Miq.)Sw.), họ Cam

(Rutaceae) ở Ninh Thuận” với các mục tiêu như sau:

1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Đa tử biển

2 Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá và thân mẫu nghiên cứu

3 Nghiên cứu tinh dầu có trong lá và vỏ quả mẫu nghiên cứu

Để thực hiện mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

1 Đặc điểm thực vật: Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu lá,

thân, đặc điểm bột lá, bột thân Đa tử biển Kiểm định tên khoa học

2 Thành phần hóa học của lá và thân: Định tính các nhóm chất bằng

phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng đối với cao các phân đoạn của các mẫu nghiên cứu Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của chất tinh khiết

3 Nghiên cứu tinh dầu: Tiến hành chiết xuất và định lượng tinh dầu

bằng phương pháp cất kéo hơi nước Định tính, định lượng các thành phần có trong tinh dầu bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ Bên cạnh đó xác định một số chỉ tiêu lý học (tỷ trọng, chỉ số khúc xạ) của tinh dầu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Thực vật:

Qua quan sát đặc điểm hình thái, Đa tử biển là một loài thuộc chi

Limnocitrus Miq., họ Cam (Rutaceae)

1.1.1 Vị trí phân loại chi Limnocitrus

Theo khung phân loại thực vật của Takhtajan 1987, vị trí phân loại của

chi Limnocitrus như sau [15], [20], [45]:

1.1.2 Đặc điểm chung họ Cam (Rutaceae)

Đặc điểm thực vật

Cây gỗ, bụi, cây cỏ có túi tiết tinh dầu, nhị ngoài dĩa mật, vòng ngoài thường đối diện với cánh hoa Lá đơn hoặc lá kép, mọc so le hay mọc đối, không có lá kèm Cụm hoa là xim, hoa thường đều, lưỡng tính, mẫu 5, các thành phần của bao hoa rời Nhị có vòng ngoài thường đối diện với cánh hoa

Bộ nhụy thường có 4-5 lá noãn dính liền thành bầu trên, có khi nhiều lá noãn (15-20), số ô của bầu bằng số lá noãn, mỗi ô có 1-2 hay nhiều noãn đính trung trụ Quả nang hay mọng loại cam, có khi quả tụ gồm nhiều quả đại Hạt không có nội nhũ [6]

Họ này còn có nhiều tên khoa học khác: Amyridaceae Kunth (1824); Aurantiaceae Durande; Boroniaceae J.Agardh; Cneoraceae Vest (1818); Correaceae J.Agardh; Cusparia ceae (DC) Tratt; Dictamnaceae Vest; Diosmaceae R.Br; Diplolaenaceae J.Agardh; Flindersiaceae (Engl);

Fraxinellaceae Ness; Pilocarpaceae J.Agardh; Ptaeroxylaceae J-F.Leroy (1960); Pteleaceae Kunth; Zanthoxylaceae Bercht và J.pest [11], [17]

Phân loại

Họ này chia làm 4 phân họ:

+ Rutoideae: Có các lá noãn hoàn toàn tách biệt, nó chỉ liên kết với nhau ở vòi và đầu nhụy, quả nạc, có các tông sau: Ruteae, Zanthoxyleae, Boronieae, Diosmeae, Cusparieae [50]

+ Toddaloideae: Các lá noãn dính, quả bao gồm 2-4 quả hạch con [50] + Rhabdodendroideae: Các lá noãn hợp nhưng phân biệt bởi đế phình to + Aurantioideae: Bầu nguyên và quả lớn [50]

Limnocitrus littoralis Miq thuộc phân họ Aurantioideae [49]

1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Limnocitrus

Cây bụi hoặc cẫy nhỡ, cành nhẵn, có gai mập mạp Lá đơn, mọc so le, nhẵn, cứng, dai, phiến lá hình bầu dục hay hình trái xoan ngược mép khía răng cưa, cuống lá ngắn Cụm hoa ngù mọc ở đầu cành Hoa trắng thơm, có 4-

5 cánh không dính liền nhau, hình trứng Đài hình tam giác, có 4-5 lá đài dính liền nhau Bộ nhị có 10 nhị rời nhau, chỉ nhị nhẵn, bao phấn thuôn dài, trên bao phấn có 15-20 rãnh dọc Bầu nhụy gần hình cầu, chia 4-5 ô, mỗi ô có 2 lá noãn Quả hình cầu hoặc gần hình cầu, khá lớn đường kính 3,5-4cm, lúc non

có màu xanh khi chín chuyển thành màu da cam, vỏ quả mỏng có nhiều túi tiết tinh dầu, thịt không nhiều, hóa nhầy Hạt lớn, phẳng hình bầu dục, cứng,

có lớp màng màu trắng bao bọc phía ngoài và có lá mầm màu xanh [49]

Chi Limnocitrus chỉ có 1 loài duy nhất: Limnocitrus littoralis Miq.[20],

[45]

1.1.4 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Limnocitrus littoralis Miq

Cây nhỡ cao 2m, cành thẳng màu nâu xám, gai to dài 1–2cm Lá đơn, mọc so le, nhẵn, cứng và hơi dai, hình bầu dục hay trái xoan ngược, dài 5–7,5cm, rộng 3-4cm, gân phụ 8-11 cặp nghiêng một góc 40-600 so với gân chính, có rất nhiều túi tiết tinh dầu Hơi khía tai bèo ở mép lá, cuống lá hình trụ có kích thước 3,5-7 x1-1,5mm Cụm hoa có kích thước 3-4 x 2,5-5cm, đầu trục cụm hoa phân thành các cống hoa nhỏ dài 2,5-3,5mm có lông trắng mịn Dĩa mật hình chén cao 0,5-0,6mm, rộng 1,5-1,6mm Hoa trắng thơm, có 4-5 cánh rời nhau, nhẵn, hình trứng, dài 7,5–10mm Đài hình tam giác, dài 2- 3mm, nhẵn không có lông, có 4-5 lá đài màu xanh dính liền nhau Nhị có 8-10 nhị, chỉ nhị thuôn dài, bao phấn dài và mảnh (4,5-1mm) Nhụy hoa dài 10-11mm, bầu nhụy gần hình cầu cao 4,5-5mm, rộng 1,7-2mm, có lông tơ nhỏ màu trắng ở phía dưới bầu phía trên hầu như không có, chia làm 5 ô, mỗi ô 2

lá noãn, đính noãn trung trụ; vòi nhụy dài 4mm, có các nốt màu nâu nhỏ li ti Quả hình cầu, đường kính 3-5cm, lúc non có màu xanh khi chín có màu vàng,

vỏ mỏng chứa nhiều túi tiết tinh dầu, thịt không nhiều và hóa nhầy, chia làm 3-5 ô, mỗi ô chứa 1–2 hạt Hạt hình cầu, có vỏ lụa màu trắng bao bọc ở phía ngoài [49]

Phân bố: Cây ưa sống ở những vùng khô và nóng Phần lớn cây tập trung ở bờ nam của đảo Java thuộc Indonesia Ở Việt Nam cây mọc ở Trung

bộ và Nam bộ đặc biệt là tỉnh Ninh Thuận [16], [20], [45]

1.2 Thành phần hóa học

Ở Việt Nam, cho đến nay, Đa tử biển là đối tượng hoàn toàn mới chưa

có bất kỳ một tài liệu về cây thuốc nào công bố thành phần hóa học

1.3 Công dụng của Đa tử biển

Đa tử biển có tác dụng chữa ho, long đờm, hạ sốt, chống viêm và ngăn

chặn sự lão hóa của tế bào da [9], [40] Dịch chiết Limnocitrus littoralis Miq

có mặt trong một số công thức mỹ phẩm như: kem làm mờ vết nhăn, kem chống nắng, kem lót, phấn trang điểm, sữa dưỡng thể [40]

Y học dân gian tộc Chăm sử dụng dược liệu này số lượng lớn trong nhiều bài thuốc:

• Bài 1: Bài thuốc chữa viêm phế quản [9]

Đa tử biển 20g Dây chiều vàng 20g Chữa trị: Ho, ho có đờm, đau cuống họng, sốt, nuốt nước miếng khó, khò khè khó thở

Cách dùng: Sắc uống ngày một thang

• Bài 2: Bài thuốc chữa ho [9]

Đa tử biển 20g

Vỏ sung 20g Chữa trị: Ngứa cổ, ho, ho khan, ho có đờm, nhiều lúc ho thở khò khè,

chảy nước mũi

Cách dùng: Ngày sắc 2 thang, mỗi thang sắc 1 lần Đổ 3 chén nước, sắc còn 8 phân uống (sắc lửa nhỏ)

• Bài 3: Bài thuốc chữa đau thần kinh tọa [9]

Đa tử biển 20g Thằn lằn dây 16g

Cỏ chông 16g Sung rừng 16g

Ma dương 16g Chanh rừng 16g Chữa trị: Đau ngang thắt lưng, đau lan xuống mông, xuống đùi, xuống mặt sau cẳng chân, cúi ngửa không được, đi lại hạn chế

Cách dùng: Sắc uống ngày một thang

• Bài 4: Bài thuốc chữa ho [9]

Đa tử biển 30g Hương nhu rừng 20g Bình vôi 20g

Lá cam thảo dây 10g Chữa trị: Đau đầu sổ mũi, ho khan, ho có đờm, ho đau tức ngực, đau rát cuống họng không ngủ được

Cách dùng: Ngày uống 1 thang, 1 thang sắc 2 lần Đổ 3 chén nước, sắc còn 5 phần

1.4 Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học tinh dầu họ Cam (Rutaceae)

Trên thế giới, thành phần hóa học tinh dầu vỏ quả Citrus đã được

nghiên cứu từ lâu và rộng rãi Nhiều công trình đã đi sâu phân tích thành phần

hóa học tinh dầu vỏ quả chi Citrus Theo các công trình nghiên cứu đã công

bố, trong tinh dầu vỏ quả Citrus có chứa hydrocarbon nhóm monoterpen và

sesquiterpen, hợp chất chứa oxy Trong đó terpen hydrocarbon chiếm khoảng 95%, nhóm hợp chất chứa oxy chỉ có khoảng 5%

Ở Việt Nam, Phạm Minh Hoàng và Trịnh Hoàng Hiếu khảo sát tinh

dầu vỏ quả giống Citrus họ Rutaceae bằng GC–MS kết quả thu được trong các mẫu tinh dầu của Bưởi (Citrus decumana), Cam (Citrus aurantium), Chanh (Citrus medica), Quất (Citrus japonica) lần lượt có 23, 18, 37, 11

thành phần [18], [19] Trong đó thành phần chính ở các mẫu nghiên cứu trên chủ yếu là Limonen

Trịnh Hoàng Hiếu cũng đã tiến hành khảo sát thành phần hóa học tinh dầu lá Quất bằng phương pháp GC-MS thấy có 6 thành phần gồm: Elemol (18%); β-Eudesmol (16%); Epibiciclosesquiphelandren (16%); Limonen (1,45%); Elemol (17,72%); Guaien (6,65%) [19]

Kỹ sư Nông Ích Thượng nghiên cứu về thành phần hóa học của vỏ quả

và lá Mắc mật (Clausena indica) thấy: hàm lượng tinh dầu trong vỏ quả là

5,55%, có 9 thành phần trong đó chủ yếu là β-Myrcen (70%); lá chứa 2,71%

tinh dầu, gồm có 11 thành phần, trong đó Myristicin (40,37-56,04%) và

p-cymen-8-ol (18,58-22,45%) là hai thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất [29] Hàm lượng tinh dầu trong lá Chanh Việt Nam chỉ ở mức 0,09–0,11%, có chứa Citral a (24,7%); Citral b (6%); Borneol (5%); Linalylacetat (2,5%); Benzaldehyd (6%) [4]

Bảng 1.1 Thành phần và hàm lượng tinh dầu vỏ quả giống Citrus họ

Cam (Rutaceae)

Quất[19] Bưởi[18] Cam[18] Chanh[18]

3 Biciclosesquiphelandren - 0,28 - 0,13

TT Tên cấu phần Hàm lượng (%)

Quất[19] Bưởi[18] Cam[18] Chanh[18]

TT Tên cấu phần Hàm lượng (%)

Quất[19] Bưởi[18] Cam[18] Chanh[18]

TT Tên cấu phần Hàm lượng (%)

Quất[19] Bưởi[18] Cam[18] Chanh[18]

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Mẫu nghiên cứu được thu hái tháng 07/2011 tại Ninh Phước, Ninh Thuận gồm:

- Cây tươi mang hoa để giám định tên khoa học và làm tiêu bản mẫu khô

- Cây tươi mang hoa, lá để làm tiêu bản vi học cấu tạo giải phẫu

- Lá, thân phơi khô, làm nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô

ráo, thoáng mát làm mẫu nghiên cứu thành phần hóa học

Lá cắt nhỏ để cất tinh dầu thu hái tháng 10/2011 tại Ninh Phước, Ninh Thuận

Vỏ quả cắt nhỏ để cất tinh dầu thu hái tháng 05/2012 tại Ninh Phước, Ninh Thuận

2.2 Phương tiện nghiên cứu:

2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hoá chất:

Các thuốc thử, dung môi, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam III, IV

- Các dung môi: Methanol, Ethanol, Cloroform, Ethylacetat, n–Hexan

- SKLM: Dùng bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 F254 (Merck)

- Sắc ký cột: Chất nhồi cột là Silicagel pha thường, cỡ hạt 60-200µm (Merck)

- Các thuốc thử: Dragendorff, Bouchardat…

2.2.2 Phương tiện và máy móc:

- Kính hiển vi Leica Wetzlar GmbH

- Kính soi nổi Krussoptroni

- Cân kỹ thuật Precisa

- Tủ sấy Shellab

- Máy xác định độ ẩm Satorius

- Máy cắt vi phẫu cầm tay

- Máy ảnh kỹ thuật số Cannon

- Máy sắc ký khí GC/MS–QP 2010 Shimadzu

- Bộ dụng cụ cất tinh dầu

- Máy chấm mẫu Linomat 5 của Camag (Thụy sỹ)

- Máy đốt bản mỏng (Camag–Thụy sỹ)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Máy: Shimadzu, Nhật)

- SKLM: Bản mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 của hãng MERCK (Đức)

• Nghiên cứu đặc điểm vi học theo các tài liệu [5], [6]

• Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu [5]

- Sử dụng khóa phân loại tới họ, chi và loài trong tài liệu

- Đối chiếu với mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật [5]

- So sánh đối chiếu với mẫu tiêu bản trong phòng tiêu bản HNIP (Bộ môn Thực vật–Trường Đại học Dược Hà Nội), HNU (Khoa Sinh–Trường Đại học khoa học tự nhiên–Đại học Quốc gia Hà Nội) và HN (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật–Trung tâm khoa học Tài nguyên và công nghệ Quốc gia)

2.3.2.2 Chiết xuất

* Xác định độ ẩm của dược liệu:

Lấy 5g bột dược liệu để xác định độ ẩm Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 110°C Để dược liệu lên đĩa cân và trải đều trên mặt đĩa, đậy đĩa cân

và cho máy tự hoạt động, sau khoảng 10 phút máy sẽ tự động hiện kết quả Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình

* Định lượng các cao:

Cân chính xác khoảng 100g dược liệu cành và 100g dược liệu lá Đa tử biển đã xác định độ ẩm Ngâm lạnh bằng MeOH trong bình chiết Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao MeOH toàn phần Hòa tan cao MeOH toàn phần vào một lượng vừa đủ nước nóng, thu được dịch chiết nước Đem dịch chiết nước lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần

n-hexan, cloroform, ethylacetat, và n-butanol với mỗi loại dung môi lắc kỹ

đến khi nào dung môi trong suốt thu được 4 phân đoạn dịch chiết Các dịch chiết được cất thu hồi dung môi ở 60oC, thu được các cao tương ứng Chiết theo sơ đồ hình 2.1

Cao các phân đoạn thu được đem sấy ở nhiệt độ 400C tới khối lượng không đổi Quá trình chiết xuất được lặp lại 3 lần Hàm lượng cao là kết quả trung bình của 3 lần thực nghiệm Xác định hàm lượng cao trong từng phân đoạn bằng phương pháp cân Hàm lượng cao các phân đoạn được tính theo công thức

100(1 )

a F

× − Trong đó:

F: Hàm lượng chất (%)

a: Khối lượng cắn (g)

M: Khối lượng dược liệu đã sấy khô (g)

x: Độ ẩm của dược liệu

- Dung môi chấm sắc ký: MeOH

- Bình sắc ký rửa sạch, sấy khô, lót một lớp giấy lọc cao gần miệng và kín 3 mặt thành trong của bình

- Bão hòa dung môi: rót dung môi đã pha ở trên từ từ theo thành bình,

để yên cho dung môi bão hòa

- Chấm sắc ký:

+ Lấy một lượng mẫu thích hợp vào xilanh, đưa xilanh vào hệ thống bơm mẫu tự động Lập file cho mỗi mẫu phân tích Nhập các thông số cần thiết: độ rộng vết, số lượng vết, thể tích mẫu chấm

+ Song song với quá trình bơm mẫu là quá trình làm khô tự động dịch chiết trên bản mỏng bằng khí nén

- Triển khai sắc ký:

+ Đặt thẳng bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi, đậy kín,

để yên, quan sát quá trình tách đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng khoảng 2cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu đường dung môi và để khô tự nhiên trong tủ hốt

+ Quan sát và chụp ảnh bản mỏng sắc ký dưới ánh sáng trắng và ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254nm và 366nm và sau khi phun thuốc thử hiện màu

2.3.2.4 Phân lập và nhận dạng chất tinh khiết

Sử dụng phương pháp sắc ký cột thông dụng để phân lập các chất trong phân đoạn ethylacetat Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng

Sử dụng các phổ IR, UV, NMR, MS để xác định cấu trúc chất tinh khiết

Cột sắc ký được tiến hành trên cột Silicagel pha thường, có kích thước hạt 60-200µm

- Đưa mẫu vào cột: Trộn đều một lượng bột Silicagel với dung dịch cắn ethylacetat, để dung môi bay hơi rồi đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều đặn trên mặt silicagel

- Rửa giải:

+ Sử dụng hệ dung môi thích hợp

+ Kiểm soát tốc độ dòng chảy

+ Hứng dịch rửa giải bào bình nón, ống nghiệm với thể tích thích hợp + Kiểm tra các phân đoạn thu được bằng SKLM, các phân đoạn cho sắc

ký đồ giống nhau thì gộp thành một phân đoạn

2.3.2.5 Nghiên cứu về hóa học tinh dầu

• Xác định chỉ số vật lý của tinh dầu

0 1

0 2 20 20

m m

m m d

−

−

=

m2: Khối lượng trung bình của tinh dầu và bình đo tỉ trọng

m1: Khối lượng trung bình của nước cất và bình đo tỉ trọng

m0: Khối lượng trung bình của bình đo tỉ trọng

Nếu xác định ở nhiệt độ (t) khác 200C, tỷ trọng của tinh dầu phải được hiệu chỉnh về d2020

Từ công thức, tính được tỷ trọng của tinh dầu (có hiệu chỉnh nhiệt độ)

Chỉ số khúc xạ:

- Chỉ số khúc xạ của mẫu tinh dầu nghiên cứu được xác định trên máy khúc xạ kế từ 1,3000 đến 1,7000 với độ chính xác 0,0002 Máy khúc xạ kế

Shanghai Physico-Optical instrument factory tại công ty dược phẩm Danapha

- Chỉ số khúc xạ được tính theo công thức:

) ( 0004 ,

'

t t n

+ Rửa sạch nơi chứa mẫu bằng aceton

+ Sau đó cho vài giọt tinh dầu lên chỗ chứa mẫu

+ Bật đèn, và chỉnh đèn về gần phía chỗ chứa mẫu

+ Chỉnh nút để thấy rõ vùng sáng tối trong mẫu Ranh giới giữa hai vùng

là điểm cắt ngang của đường chéo

+ Bấm nút “read”, đợi máy đọc kết quả, ghi nhận lại

+ Sau đó bấm nút “temp” để xem nhiệt độ, ghi nhận kết quả

• Xác định hàm lượng tinh dầu [10]

+ Phương pháp: Cất kéo hơi nước với bộ dụng cụ cất tinh dầu cải tiến + Xử lý mẫu: vỏ quả và lá được xay nhỏ

+ Thời gian cất: Vỏ quả: 2,5-3h, lá: 3-3,5h

+ Hàm lượng tinh dầu được tính trên dược liệu khô tuyệt đối theo công thức:

% x100%

b

a

X: Hàm lượng % tinh dầu (tt/kl)

a: Thể tích tinh dầu đọc được sau khi cất (ml)

b: Khối lượng dược liệu đã trừ đi độ ẩm (gam)

+ Độ ẩm: Xác định bằng phương pháp dung môi

Độ ẩm = 100 ( 2 1)

m

V V

V1: Số ml nước cất được sau lần cất đầu

V2: Số ml nước cất được sau lần cất sau

m: Số gam dược liệu đã đem thử

 Định tính và định lượng các chất trong tinh dầu lá, vỏ quả và cành trên máy sắc ký khí kết hợp khối phổ GC/MS-QP 2010 Shimadzu tại Viện Kiểm nghiệm

- Chuẩn bị dung dịch thử: Hút 60µl mẫu thử hòa tan trong 2940µl hexan, lắc đều, lọc, qua Na2SO4 khan rồi tiêm sắc ký

n Điều kiện chạy máy sắc ký khối phổ: Cột sắc ký khí DBn 5MS (30x0,25 mm ID), khí mang He, tỷ lệ m/z từ: 40-200, nhiệt độ buồng tiêm:

1500C, nhiệt độ detector: 2000C, chương trình nhiệt độ: nhiệt độ ban đầu:

500C Tăng từ 50-1250C, 150C/phút, giữ tại 1250C trong 5 phút Tăng từ

1250C-2350C, 200C/phút, thể tích tiêm mẫu: 1µl

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 3.1 Nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Đặc điểm thực vật

Cây nhỡ cao 2m, cành thẳng màu nâu xám, gai to dài 1-1,5cm Lá đơn, mọc so le, nhẵn, cứng và hơi dai, hình bầu dục, dài 4-5cm, rộng 2-3,5cm, gân phụ 9-11 cặp, gân nhỏ rõ, nghiêng một góc 40-600 so với gân chính, có rất nhiều túi tiết tinh dầu Hơi khía tai bèo ở mép lá, cuống lá ngắn hình trụ dài 1-1,2mm Cụm hoa dạng tán xim hai ngã ở ngọn cành, đầu trục cụm hoa phân thành các cống hoa nhỏ dài 2-3mm có lông trắng mịn Hoa trắng thơm, có 5 cánh rời nhau, nhẵn, hình trứng, dài 9-12mm, tiền khai hoa vặn Đài hình tam giác dài 2-3mm, nhẵn không có lông, 5 lá đài màu xanh dính liền nhau, tiền khai đài kiểu van Bộ nhị có 8 nhị rời nhau chia làm hai vòng mỗi vòng 4 nhị, vòng nhị ngoài đối diện với vòng cánh hoa, chỉ nhị thẳng dài 10-11mm; bao phấn đính lưng, dài 1mm, hướng trong, trên bao phấn có các rãnh dọc Nhụy hoa dài 11mm, bầu nhụy gần hình cầu cao 4mm, rộng 2mm, có lông tơ nhỏ màu trắng ở phía dưới bầu, chia làm 5 ô, mỗi ô 2 lá noãn, đính noãn trung trụ; vòi nhụy dài 4mm, có các nốt màu nâu nhỏ li ti, núm nhụy màu đen xẻ 5 núm Bầu trên Quả mọng loại cam, hình cầu, đường kính 3-4,5cm, lúc non có màu xanh khi chín có màu vàng, vỏ mỏng chứa nhiều túi tiết tinh dầu, thịt không nhiều và hóa nhầy, chia làm 3-5 ô, mỗi ô chứa 1 – 2 hạt Hạt hình cầu phẳng, cứng, có vỏ lụa màu trắng bao bọc ở phía ngoài

Đối chiếu với bản mô tả ghi trong các tài liệu phân loại thực vật [20],

[45], cây Đa tử biển được sơ bộ xác định thuộc chi Limnocitrus Miq., họ Cam

(Rutaceae) và được TS Trần Văn Ơn - Bộ môn Thực vật, trường Đại học

Dược Hà Nội xác định tên khoa học là: Limnocitrus littoralis Miq., họ Cam

(Rutaceae)

Ảnh mẫu nghiên cứu được trình bày ở hình 3.2

Hình 3.2 Ảnh hình thái cây Đa tử biển

1 Quả và lá; 2 Cành mang quả; 3 Hoa; 4 Núm nhụy; 5 Hoa bổ dọc; 6 Bầu

cắt ngang; 7 Nhụy; 8 Nhị; 9 Quả bổ ngang

3.1.2 Cấu tạo giải phẫu của cành và lá

3.1.2.1 Cấu tạo giải phẫu lá

Quan sát qua kính hiển vi mặt cắt ngang vuông góc với gân chính lá cây Đa tử biển, cho thấy: Lá được chia thành 2 phần chính là phần gân lá và phiến lá

Phần gân lá:

Gân lá lồi ở cả 2 phía Ngoài cùng là lớp biểu bì trên và biểu bì dưới được cấu tạo bởi một hàng tế bào nhỏ hình chữ nhật, xếp đều đặn, thành phía ngoài hóa cutin bắt màu xanh Sát với biểu bì là mô dày trên và mô dày dưới được cấu tạo bởi 2-3 hàng tế bào hình trứng dày Tiếp đến là mô mềm gồm các tế bào hình trứng, không đều nhau, kích thước lớn hơn tế bào mô dày, thành mỏng, xếp lộn xộn, rải rác các tinh thể calci oxalat hình khối Vòng trụ bì hóa

mô cứng gần như liên tục bao quanh bó libe-gỗ gân chính, thành tế bào mô cứng dày, hóa gỗ, bắt màu xanh Chính giữa gân là hệ thống dẫn gồm bó gỗ ở trên, bó libe ở dưới

Phần phiến lá:

Biểu bì trên và biểu bì dưới có các tế bào hình chữ nhật kích thước nhỏ, thành ngoài hóa cutin Mô dậu gồm 1 hàng tế bào hình chữ nhật đều đặn, xếp đứng vuông góc với biểu bì trên Các mảnh mạch xoắn, đám sợi, mảnh mạch mạng, tinh thể calci oxalat nằm rải rác trong phần thịt lá Có rất nhiều túi tiết tinh dầu to, bao bọc xung quanh là các tế bào tiết Ảnh chụp vi phẫu lá cây Đa

tử biển được trình bày ở hình 3.3

3.1.2.2 Cấu tạo giải phẫu cành

Mặt cắt vi phẫu cành gần hình tròn, từ ngoài vào trong có: Biểu bì ở phần cành non hoặc bần ở phần cành già Sát biểu bì là phần mô mềm vỏ gồm các tế bào hình cầu hoặc hình đa giác vách móng, kích thước không đều nhau, xếp lộn xộn chứa nhiều túi tiết rất lớn Trong lớp mô mềm vỏ, gần tiếp giáp với libe cấp 2 có những đám mô cứng tập trung thành 1 vòng khép kín xung quanh thân cây, bắt màu xanh Phần trụ được bắt đầu bởi vòng libe-gỗ cấp 2, libe ở ngoài, gỗ ở trong Libe cấp 2 gồm các tế bào có kích thước nhỏ, xếp đều đặn thành hàng dọc, bắt màu hồng Gỗ cấp 2 được cấu tạo bởi các mạch ngăn và mạch thông có kích thước lớn, thành dày, xen kẽ với mô mềm gỗ và

sợi gỗ có kích thước nhỏ hơn bắt màu xanh Trong cùng là mô mềm ruột gồm nhiều tế bào lớn, vách dày, tẩm chất gỗ Tinh thể calci oxalat ít gặp trong mô mềm vỏ nhưng khá nhiều trong gỗ cấp 2 Ảnh chụp vi phẫu cành cây Đa tử biển được trình bày ở hình 3.4

Hình 3.3 Ảnh chụp vi phẫu lá cây Đa tử biển

1 Biểu bì trên; 2 Mô dày trên; 3 Tinh thể calci oxalate; 4 Tế bào mô cứng; 5 Mô dậu; 6 Gỗ; 7 Mạch mạng; 8 Libe; 9 Túi tiết tinh dầu; 10

Mô mềm; 11 Mô dày dưới; 12 Biểu bì dưới; 13 Bó sợi

3.1.3 Đặc điểm vi học.

3.1.3.1 Bột thân

Bột cành cây Đa tử biển có màu vàng, mùi thơm, vị hơi ngọt Soi dưới kính hiển vi thấy có những đặc điểm: Tinh thể calci oxalat hình khối (1); Bó sợi mang tinh thể calci oxalat hình khối (2); Sợi dài hóa cương mô (3); Mảnh mạch điểm (4); Mảnh mạch vạch (5); Mạch chấm hình đồng tiền (6); Tế bào cương mô thành dày, khoang rộng, thấy rõ các ống trao đổi (7)

Ảnh chụp các đặc điểm bột thân cây Đa tử biển dưới kính hiển vi được trình bày ở hình 3.5

Hình 3.5 Ảnh chụp các đặc điểm bột thân cây Đa tử biển dưới kính hiển vi 3.1.3.2 Bột lá

Bột màu nâu xám, có mùi thơm, vị hơi đắng, soi dưới kính hiển vi thấy

có các đặc điểm: Tinh thể calci oxalat hình khối (1); Túi tiết tinh dầu (2); Các hạt tinh bột hình trứng nằm riêng lẽ có các rốn dài nhưng không rõ vân tăng trưởng (3); Lỗ khí (4); Mạch mạng (5); Bó sợi mang tinh thể calci oxalat hình khối (6); Sợi dài hóa cương mô (7); Mảnh mạch xoắn hình lò xo (8); Mảnh biểu bì (9)

Ảnh chụp các đặc điểm bột lá cây Đa tử biển dưới kính hiển vi được trình bày ở hình 3.6

Hình 3.6 Ảnh chụp các đặc điểm bột lá cây Đa tử biển dưới kính hiển vi

3.2 Nghiên cứu về hóa học

3.2.1 Nghiên cứu về tinh dầu

3.2.1.1 Độ ẩm trong dược liệu

Lấy 3 mẫu ngẫu nhiên ở 3 vị trí khác nhau của dược liệu đem xác định

độ ẩm bằng phương pháp dung môi Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.2 và bảng 3.3

Bảng 3.2 Độ ẩm trong lá Đa tử biển

Bảng 3.3 Độ ẩm trong vỏ quả Đa tử biển

3.2.1.3 Hàm lượng tinh dầu

Lá, vỏ quả, mỗi loại lấy 3 mẫu nghiên cứu đem cất tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước để xác định hàm lượng Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.5 và bảng 3.6

Bảng 3.5 Tỷ lệ % tinh dầu trong lá Đa tử biển

(gam)

Thể tích TD (ml)

Độ ẩm

(%)

Hàm lượng TD (%)

Bảng 3.6 Tỷ lệ % tinh dầu trong vỏ quả Đa tử biển

(gam)

Thể tích TD (ml)

Độ ẩm

(%)

Hàm lượng TD (%)

3.2.1.4 Định tính và định lượng sơ bộ các thành phần có trong tinh dầu lá và

vỏ quả Đa tử biển

Thành phần hóa học của tinh dầu vỏ và lá Đa tử biển được xác định bằng phương pháp GC-MS Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.7 và bảng 3.8

Các dữ liệu cụ thể về phổ được trình bày ở phần phụ lục

Bảng 3.7 Kết quả định tính và định lượng (%) sơ bộ các thành phần trong

tinh dầu vỏ quả cây Đa tử biển