Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY ĐA TỬ BIỂN (LIMNOCITRUS LITTORALIS (Miq.)Sw.), HỌ CAM (RUTACEAE) Ở NINH THUẬN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2012 -1- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY ĐA TỬ BIỂN (LIMNOCITRUS LITTORALIS (Miq.)Sw.), HỌ CAM (RUTACEAE) Ở NINH THUẬN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DL - DHCT MÃ SỐ: 607310 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Viết Thân HÀ NỘI 2012 -2- LỜI CẢM ƠN Lời xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS NGUYỄN VIẾT THÂN TSKH BÀNH NHƯ CƯƠNG tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình làm luận văn tốt nghiệp Luận văn kết trình học tập gần 16 tháng liên tục Do đó, tơi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể tất thầy, cô trường Đại học Dược Hà Nội, người tham gia vào trình giảng dạy trang bị cho kiến thức để hồn thiện luận văn tốt nghiệp Tiếp đến tơi muốn gửi lời cảm ơn tới thầy cô, em học sinh trường Cao đẳng kỹ thuật y tế II anh chị công ty dược phẩm Danapha tạo điều kiện, giúp đỡ cho tơi suốt q trình học tập làm luận văn Cuối muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới người thân, bạn bè đặc biệt chồng gái động viên, giúp đỡ Tôi xin chân thành cảm ơn./ Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2012 Học viên Nguyễn Thị Thương -3- MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Thực vật 1.1.1 Vị trí phân loại chi Limnocitrus 1.1.2 Đặc điểm chung họ Cam (Rutaceae) .3 1.1.4 Đặc điểm thực vật chi Limnocitrus .4 1.1.3 Đặc điểm thực vật phân bố loài Limnocitrus littoralis Miq .5 1.2 Thành phần hóa học .6 1.3 Công dụng .6 1.4 Những kết nghiên cứu thành phần hóa học TD họ Rutaceae CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .12 2.1 Đối tượng nghiên cứu………………………………………………….12 2.2 Phương tiện nghiên cứu .12 2.2.1 Thuốc thử, dung mơi, hố chất 12 2.2.2 Phương tiện máy móc .12 2.3 Phương pháp nghiên cứu .13 2.3.1 Về thực vật 13 2.3.2 Về hóa học 14 2.3.2.1 Định tính nhóm hoạt chất DL phản ứng hóa học 14 2.3.2.2 Chiết xuất………………………………………………………… 14 2.3.2.3 Định tính cắn phân đoạn 15 2.3.2.4 Phân lập nhận dạng chất tinh khiết .16 2.3.2.5 Nghiên cứu hóa học tinh dầu .19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 22 3.1 Nghiên cứu thực vật……………………………………………… 22 3.1.1 Đặc điểm thực vật…………………………………………………… 22 -4- 3.1.2 Cấu tạo giải phẫu cành lá…………………………………… 23 3.1.2.1 Cấu tạo giải phẫu lá……………………………………………… 23 3.1.2.2 Cấu tạo giải phẫu cành…………………………………………… 24 3.1.3 Đặc điểm vi học………………………………………………………26 3.1.3.1 Bột thân…………………………………………………………… 26 3.1.3.2 Bột lá……………………………………………………………… 26 3.2 Nghiên cứu hóa học……………………………………………… 27 3.2.1 Nghiên cứu tinh dầu……………………………………………….27 3.2.1.1 Độ ẩm dược liệu………………………………………………27 3.2.1.2 Chỉ số vật lý…………………………………………………………28 3.2.1.3 Hàm lượng tinh dầu…………………………………………………28 3.2.1.4 Định tính, định lượng thành phần có tinh dầu lá, vỏ 29 3.2.2 Xác định sơ thành phần hóa học thân…………………31 3.2.2.1 Định tính sơ nhóm hợp chất hữu thân…………….31 3.2.2.2 Định tính sơ nhóm hợp chất hữu lá……………….37 3.2.2.3 Định lượng định tính cắn phân đoạn…………………… 41 3.3 Phân lập xác định cấu trúc thành phần hóa học…………………48 3.3.1 Chiết, phân lập chất thân………………………………… 48 3.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết chất LL1………………………………… 51 3.3.3 Chiết, phân lập chất lá…………………………………… 52 3.3.4 Xác định cấu trúc LL1……………………………………………… 52 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN…………………………………………………56 4.1 Về phương pháp………………………………………………………56 4.2 Về thực vật…………………………………………………………… 57 4.3 Về thành phần hóa học……………………………………………….57 -5- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………….62 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC -6- DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN: Acetonitrile BuOH: Butanol CHCl3: Cloroform Dc: Dịch chiết Dd: Dung dịch MeOH: Methanol EtOAc: Ethylacetat ESI–MS: Electrospray Ionization Mass Spectrometry GC-MS: Gas Chromatography–Mass Spectrometry HPLC: High Performance Liquid Chromatography Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectrometry H-NMR: 13 C-NMR: Carbon (13) Nuclear Magnetic resonance spectrometry IUCN: International Union for Conservation of Natural IR: Infrared Spectroscop MS: Mass Spectrum Pư: Phản ứng SKLM: Sắc ký lớp mỏng SKC: Sắc ký cột Tt/kl: Thể tích khối lượng TD: Tinh dầu TT: Thuốc thử TLC: Thin Layer Chromatography UV: Ultra Violete -7- DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang Hình 2.1: Sơ đồ chiết phân đoạn nhóm chất 18 Hình 3.2: Ảnh hình thái Đa tử biển 23 Hình 3.3: Ảnh chụp vi phẫu Đa tử biển 25 Hình 3.4: Ảnh chụp vi phẫu cành Đa tử biển 25 Hình 3.5: Ảnh chụp đặc điểm bột thân Đa tử biển 26 kính hiển vi Hình 3.6: Ảnh chụp đặc điểm bột Đa tử biển 27 kính hiển vi Hình 3.7: Sắc ký đồ phân đoạn cao ethylacetat với hệ dung môi 45 ethylacetat : acid acetic : acid formic : nước (10 : : : 2) Hình 3.8: Sắc ký đồ phân đoạn cao ethylacetat với hệ dung môi 46 toluen: ethylacetat: aceton: acid formic (10 : : : 1) Hình 3.9: Sắc ký đồ phân đoạn cắn n – Butanol 47 10 Hình 3.10: Ảnh chất phân lập từ thân Đa tử biển 49 11 Hình 3.11: Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn Ethylacetat 50 thân 12 Hình 3.12: Sắc kí đồ HPLC mẫu LL1 51 13 Hình 3.13: Sắc ký đồ phân đoạn MeOH, ethylacetat, n-butanol 52 LL1 14 Hình 3.14: Công thức cấu tạo Scopoletin -8- 55 DANH MỤC BẢNG BIỂU TT Tên bảng Bảng 1.1: Thành phần hàm lượng tinh dầu vỏ giống Citrus Trang họ Cam (Rutaceae) Bảng 3.2: Độ ẩm Đa tử biển 27 Bảng 3.3: Độ ẩm vỏ Đa tử biển 28 Bảng 3.4: Chỉ số vật lý tinh dầu vỏ Đa tử biển 28 Bảng 3.5:Tỷ lệ % tinh dầu Đa tử biển 28 Bảng 3.6: Tỷ lệ % tinh dầu vỏ Đa tử biển 29 Bảng 3.7: Kết định tính định lượng (%) thành phần 29 tinh dầu vỏ Đa tử biển Bảng 3.8: Kết định tính định lượng (%) thành phần 30 tinh dầu Đa tử biển Bảng 3.9: Kết định tính nhóm chất trong thân 40 Đa tử biển phản ứng hóa học 10 Bảng 3.10: Hàm lượng cao phân đoạn chiết thân 42 11 Bảng 3.11: Hàm lượng cao phân đoạn chiết 42 12 Bảng 3.12: Kết định tính cao phân đoạn thân 43 13 Bảng 3.13: Kết định tính cao phân đoạn 44 14 Bảng 3.14: Chương trình dung mơi rửa giải 51 15 Bảng 3.15: Số liệu phổ 1H- 13C-NMR chất LL1 53 -9- ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam, với vị trí tự nhiên có, mặt gắn liền với lục địa, mặt khác thông với đại dương, lại nằm vành đai nhiệt đới gió mùa, khí hậu có nhiều nét độc đáo đa dạng, thay đổi từ điều kiện khí hậu nhiệt đới điển hình vùng núi thấp phía Nam, đến khí hậu mang tính chất nhiệt đới vùng núi cao tỉnh phía Bắc chí có vùng nhỏ đậm sắc ôn đới Đà lạt, Sapa Điều kiện tự nhiên thực sự ưu đãi cho đất nước người Việt Nam hệ sinh thái phong phú đa dạng, tiềm to lớn tài nguyên thuốc nói riêng tài nguyên dược liệu nói chung Theo kết điều tra khảo sát nhà nghiên cứu khoa học đa ngành khác cho biết, Việt Nam có khoảng 12.000 lồi thực vật bậc cao có mạch, xác định tên 8.000 loài, 600 loài nấm, 800 loài rêu hàng trăm loài tảo lớn [51] Trong có tới gần 4.000 lồi thực vật bậc cao bậc thấp dùng làm thuốc, chúng phân bố rộng khắp nước [51] Nguồn thực vật phong phú cung cấp cho người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị, có hoạt tính sinh học ứng dụng lớn nhiều lĩnh vực khác sống, đặc biệt dùng làm thuốc chữa bệnh Cây Đa tử biển thuộc họ Cam (Rutaceae), có số nước Đơng Nam Á Ở Việt Nam, mọc Trung Nam đặc biệt tỉnh Ninh Thuận [16], [20] Cây gọi Cam đường, dược liệu sử dụng tương đối phổ biến y học cổ truyền dân tộc Chăm Nhưng việc khai thác sử dụng khơng hợp lý nên tổ chức IUCN đưa vào sách đỏ thực vật có nguy đe dọa Mặt khác, Đa tử biển có tên tài liệu thuốc chưa nghiên cứu đầy đủ dược liệu học Chính vậy, tơi thực đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học Đa tử biển (Limnocitrus littoralis (Miq.)Sw.), họ Cam (Rutaceae) Ninh Thuận” với mục tiêu sau: - 10 - - Phổ ISI-MS: m/z 193 [M + H]+ (positive), m/z 191 [M - H]+ (negative) - Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13 C-NMR (125 MHz) Số liệu phổ 1H- 13C-NMR chất LL1 trình bày bảng 3.15 Bảng 3.15 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR chất LL1 Vị trí a Chất LL1 Scopoletin δH (giá trị J) δC δH δC - 161,43 - 160,5 6,27 (1H, d, J = 9,5Hz) 113,43 6,26 (1H, d, J = 9,4Hz) 112,5 7,60 (1H, d, J = 9,5Hz) 143,28 7,58 (1H, d, J = 9,4Hz) 142,0 6,92 (1H, s) 107,56 6,89 (1H, s) 107,5 - 144,06 - 143,0 - 149,76 - 149,5 6,85 (1H, s) 103,23 6,82 (1H, s) 102,0 - 150,30 - 110,5 10 - 111,52 - 150,0 OCH3 3,96 (3H, s) 56,44 3,93 (3H, s) 55,2 Số liệu đo CDCl3; b - Biện giải cấu trúc hóa học LL1 Phổ UV LL1 có đỉnh hấp thụ cực đại 204, 227, 296, 344nm, chứng tỏ cấu trúc có liên kết đơi C=C (đỉnh 204nm) có vòng thơm (đỉnh 296nm 344nm) - 63 - Phổ IR LL1 cho biết phân tử LL1 có nhóm chức sau: nhóm OH (dải hấp thụ có đỉnh 3419 cm-1); vòng lacton (đỉnh 1714 (C=O) đỉnh 1143 (C-O)); liên kết đôi C=C (đỉnh 1632) Phổ 1H-NMR LL1 cho biết có bốn proton gắn vào vòng thơm, có proton xuất dạng đơn píc có độ dịch chuyển 6,92 6,85; proton dạng píc kép có độ dịch chuyển 7,60 (d, J = 9,5Hz) 6,27 (d, J = 9,5Hz) Ngồi có tín hiệu proton nhóm methoxy (OCH3) gắn vào vòng thơm 3,96ppm Số liệu phổ 1H-NMR khẳng định có vòng thơm cấu trúc LL1 Phổ 13C-NMR LL1 cho biết có tổng cộng 10 tín hiệu cacbon Có tín hiệu có độ dịch chuyển từ 150,30 đến 103,23ppm nằm vùng vòng thơm hay liên kết đơi C=C Có tín hiệu methoxy cacbon gắn vào vòng thơm 56,44ppm Như vậy, phổ 13C-NMR khẳng định LL1 có vòng thơm phân tử Từ tín hiệu độ dịch chuyển 161,43 ppm, kết hợp với phổ UV IR giúp ta khẳng định có vòng lacton phân tử LL1 [42] Với số lượng có 10 cacbon, có vòng thơm vòng lacton, suy chất LL1 coumarin [37], [44] Hai tín hiệu proton kép 7,60 (d, J = 9,5Hz) 6,27 (d, J = 9,5Hz) dấu hiệu đặc trưng coumarin [37], [44] Điều trùng hợp với kết định tính dược liệu có coumarin Với số liệu thu trên, chúng tơi dự đốn LL1 coumarin có 10 cacbon, có nhóm methoxy (OCH3), có proton Do đó, LL1 dự đốn Scopoletin Khi so sánh số liệu phổ LL1 với Scopoletin công bố trước [43] cho thấy trùng hợp (Bảng 3.15) Hơn nữa, phổ khối LL1 có pic khối lượng phân tử m/z 193 [M + H]+ (positive) m/z 191 [M - - 64 - H]+ (negative) cho biết khối lượng phân tử LL1 192amu, trùng với Scopoletin (C10H8O4) Kết luận: Chất LL1 thu Scopoletin Công thức cấu tạo sau: H3CO HO 10 O O Hình 3.14 Cơng thức cấu tạo Scopoletin Các liệu cụ thể phổ trình bày phần phụ lục - 65 - CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 4.1 Về phương pháp Vể phương pháp, phần thực nghiệm nghiên cứu áp dụng, phối kết hợp phương pháp nghiên cứu dược liệu học từ kinh điển, bản, thường quy, đơn giản đến đại, đòi hỏi phương tiện kỹ thuật cao Nghiên cứu hình thái phân loại thực vật, từ quan sát cảm quan (thô đại) thực địa, mẫu thu hái, chụp ảnh, đối chiếu với mô tả tài liệu phân loại thực vật chuẩn, kinh điển, so sánh với mẫu chuẩn lưu trữ, nghiên cứu vi học hiển vi Các số vật lý tinh dầu khảo sát tỷ trọng, số khúc xạ Về hóa thực vật, phương pháp nghiên cứu bao gồm từ định tính sơ phản ứng hóa học ống nghiệm, chiết ngâm lạnh, cất kéo nước (tinh dầu), chiết phân đoạn, sắc ký lớp mỏng (SKLM) (định tính điều chế), sắc ký cột (SKC), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), sắc sắc ký khí (GC), sắc ký khí– khối phổ (GC-MS), phổ hồng tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hydro (1H-NMR), carbon-13 (13C-NMR) Một số nhóm chất thường gặp dược liệu định tính phản ứng hóa học đặc hiệu thông thường Đây phương pháp phổ biến, từ lâu trở thành thường quy dược liệu học Tuy đơn giản mà tính “đặc hiệu” cao tin cậy, đặc biệt có kết hợp với SKLM Về chiết tách, số nhiều phương pháp chiết xuất nghiên cứu (quy mơ thí nghiệm) sản xuất (quy mơ cơng nghiệp), mục đích nghiên cứu thành phần hóa học, chiết ngâm lạnh lựa chọn tính đơn giản (thiết bị, phương tiện rẻ tiền, dễ kiếm), dễ tiến hành; đặc biệt gây biến đổi hóa học sản phẩm chiết Tiếp đến SKLM SKC SKLM dễ thực hiện, cho kết nhanh, mà độ nhạy cao (đòi hỏi lượng mẫu ít)… nên dùng rộng rãi để định tính, theo dõi phản ứng hóa học, q trình sắc ký - 66 - điều chế (SKC, SK gel), chiết phân đoạn… nghiên cứu hóa học, hóa dược, sinh hóa, dược liệu… Trong luận văn, SKLM sử dụng để định tính chất cắn phân đoạn chiết, thăm dò hệ dung môi để lựa chọn hệ dung môi chiết, phân lập, kiểm tra phân đoạn trình phân lập SKC hiệu tách cao, phân đoạn dễ tinh (theo dõi SKLM), đặc biệt nhẹ nhàng, khơng hay gây biến tính bảo tồn ngun vẹn chất chiết, mà tiến hành đơn giản, chi phí thấp Tinh dầu vỏ thu định lượng cất nước thông dụng phân tích, định danh cấu tử sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) Đây công cụ đại, nhanh chóng, kết chuẩn xác, tin cậy, đặc biệt thích hợp với chất dễ bay tinh dầu, nên thiếu nghiên cứu phân tích tinh dầu 4.2 Về thực vật Đa tử biển thuốc chi Đa tử biển (Limnocitrus) thuộc họ Cam (Rutaceae) Ở Việt Nam, họ Cam (Rutaceae) có khoảng 30 chi 110 lồi Trong đó, chi Limnocitrus có loài nhất, nên thuận tiện để giám định tên khoa học Ngồi mơ tả hình thái, phân loại thực địa, mẫu thu hái, nghiên cứu vi học bao gồm làm vi phẫu phận, soi hiển vi bột thân, bột góp phần mơ tả xác Đa tử biển, cung cấp thêm “tiêu chuẩn”, góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu chặt chẽ hơn, xác hơn, tránh nhầm lẫn 4.3 Về hóa học Về tinh dầu vỏ Chỉ số lý học: Chỉ số lý học tinh dầu (lá vỏ quả) khảo sát bao gồm tỷ trọng, số khúc xạ Tinh dấu vỏ khơng khác chí số khúc xạ (1,469/vỏ so với 1,478/lá), khác biệt lớn tỷ trọng - 67 - (0,845/vỏ 0,803/lá) Tỷ trọng tinh dầu vỏ cao tỷ trọng tinh dầu lá, điều hoàn toàn phù hợp với kết phân tích thành phần hóa học tinh dầu: hàm lượng Limonen/tinh dầu vỏ cao Limonen/tinh dầu Các số lý học tinh dầu đa tử biển phù hợp với tinh dầu họ Cam (Rutaceae) nói chung Hàm lượng tinh dầu: Sơ xác định hàm lượng tinh dầu 1,44%, vỏ 2,24% Hàm lượng vỏ Đa tử biển (2,24%) cao gấp lần so với hàm lượng tinh dầu vỏ số loài họ Cam (Rutaceae) Chanh (0,5%) [18], Cam (0,5%) [18], Bưởi (0,15%) [18], Mắc mật (0,55%) [29] Tương tự, hàm lượng tinh dầu Đa tử biển (1,44%) cao so với dược liệu khai thác tinh dầu khác họ Rutaceae Chanh (0,09–0,11%) [4], Mắc mật (0,53%) [29] Điều đó, Đa tử biển hứa hẹn nguồn nguyên liệu tinh dầu tiềm năng, triển vọng tương lai, tranh cấp với cac loài chi Citrus chi mà tinh dầu vỏ sử dụng nhiều công nghiệp thực phẩm, nước uống cơng nghiệp hóa mỹ phẩm Thành phần tinh dầu Thành phần tinh dầu phân tích, xác định sắc ký khí kết hợp với khối phổ (GC-MS), sơ xác định được: - Tinh dầu vỏ Đa tử biển có thành phần (1-methyl-3-(1methylethyl)-Benzene; d1-Limonen; 1,3,6–Octatriene; γ–Terpinene; 1,4,8-0Menthatriene; Caryophyllene; Valencene; 2-β-Pinene) Thành phần hóa học vỏ Đa tử biển giống với vỏ chi Citrus thuộc dẫn chất monoterpen không chứa oxy (d1-Limonen; γ–Terpinene; 2-β-Pinene) Nhưng tinh dầu vỏ Đa tử biển tinh dầu vỏ chi Citrus có khác biệt lớn: Tinh dầu vỏ chi Citrus có thành phần monoterpen chứa oxy, sesquiterpen, ceton, aldehyd, este; Đa tử biển không thấy thành phần - 68 - thay vào hydrocarbon no không no Đề tài sơ xác định có mặt 1-methy-3-(1-methylethyl)-Benzene; Valencene; 1,3,6-Octatriene tinh dầu vỏ Đa tử biển mà nhiều cơng trình sâu phân tích thành phần hóa học tinh dầu vỏ chi Citrus chưa công bố - Tinh dầu Đa tử biển sơ có 12 thành phần (β-Caryophyllene; Cyclohexane; Valencene; β-Panasinsene; 1,5,8-p-Menthatriene; Delta-3Carene; (R+)-Limonen; 1,3,6-Octatriene; β-Myrcene; 2-β-Pinene; β– Phellandrene; 1R; 2,6,6–Trimethylbicyclo[3.1.1] hept–2–ene) So với thành phần tinh dầu vỏ quả, tinh dầu có: thành phần nhiều hơn, thành phần hóa học khác với vỏ (β-Panasinsene (28,82%)/td lá; 1,3,6-Octatriene 46,79%/td vỏ quả) có thành phần hóa học (Cyclohexane; β-Panasinsene; 1,5,8-p-Menthatriene; Delta-3-Carene; β-Myrcene; β–Phellandrene; 1R; 2,6,6Trimethylbicyclo[3.1.1] hept–2–ene) khơng có mặt vỏ Như sơ thấy thành phần hoá học tinh dầu vỏ có khác thành phần, hàm lượng số thành phần nên mùi thơm, số lý học vỏ khác Trong tinh dầu vỏ lồi họ Cam (Rutaceae), thành phần quan tâm nhiều Limonen, monoterpen phổ biến tự nhiên, có độc tính thấp, độ an tồn cao có nhiều tác dụng Limonen tham gia phần nhỏ vào hương vị tinh dầu, có tác dụng làm tan sỏi mật, ức chế phát triển khối u ung thư đồng thời kháng nhiều chủng vi khuẩn [39] So sánh tinh dầu vỏ số loài thuộc chi Citrus, theo số tác giả, Limonen cao tắc (92,62%) [19], thấp chanh (26,36%) [18] Tinh dầu vỏ Đa tử biển có hàm lượng Limonen thấp (15,17%) đứng trí thứ sau 1,3,6-Octatriene (46,79%) Tuy nhiên, hàm lượng tinh dầu vỏ Đa tử biển cao nhiều so với thuộc chi - 69 - Citrus, nên sơ coi Đa tử biển vượt trội chi Citrus nói giá trị “lượng Limonen” tuyệt đối Tinh dầu Đa tử biển, tinh dầu tinh dầu vỏ quả, không bền, dễ bị nhựa hóa, thành phần khơng no, dễ trùng hợp hóa 1,3,6Octatriene 1,4,8-0-Menthatriene chiếm tỷ lệ cao Thành phần hóa học thân Ở Việt Nam, nay, Đa tử biển đối tượng hồn tồn mới, chưa có tài liệu thuốc cơng bố thành phần hóa học Vì luận văn xem nghiên cứu tiên phong loài thuốc này, trước hết vi học, thành phần hóa học góp phần hồn thiện phân loại, hính thái, sinh thái đối tượng nghiên cứu Định tính 14 nhóm chất Đa tử biển, sơ phát Đa tử biển, có flavonoid, coumarin, saponin, tannin thân có flavonoid, coumarin, đường khử Từ cao phân đoạn ethylacetat/thân qua SKC phân lập chất tinh khiết (ký hiệu LL1), tinh khiết sắc ký (SKLM, HPLC), tinh thể màu vàng, độ chảy 202–2040C Bằng phổ tử ngoại (UV), hồng ngoại (IR), cộng hưởng từ (NMR) xác định LL1 Scopoletin, thuộc nhóm coumarin Đây lần Scopoletin phát hiện, phân lập từ Đa tử biển Nó có mặt nhiều thuốc Nhàu, Benladon, Độc hoạt… có nhiều tác dụng dược lý giảm đau chống viêm, chống oxy hóa, tăng cường chuyển hóa, tăng cường sức khỏe, kháng khuẩn [32], [46] Do thông tin giá trị ấy, Scopoletin quan tâm, tích cực đầu tư nghiên cứu phát hiện, chiết tách, phân lập, khai thác từ nguồn dược liệu khác vỏ rễ Fraxinus japonica, Fraxinus mandshurica, Murraya paniculata đặc biệt từ Morinda citrifolia Do vậy, kết phát hiện, phân lập Scopoletin từ Đa tử biển đóng góp nhỏ có giá trị khoa học, - 70 - thực tiễn kinh tế Tuy nhiên, cần tiến hành xác định hàm lượng scopoletin có thân Đa tử biển để làm sở cho việc khai thác Sử dụng mẫu chất Scopoletin/thân phân lập được, phương pháp nhận dạng “dấu vân tay”, sơ xác định có mặt Scopoletin Sự có mặt Scopoletin thân Đa tử biển với tác dụng biết đến (giảm đau, chống oxy hóa, tăng cường sức khỏe, kháng khuẩn…) góp phần giải thích chứng minh tác dụng vị thuốc kinh nghiệm dân gian: Thân Đa tử biển dùng để chữa ho, cảm sốt, đau dây thần kinh tọa, phục hồi ngăn cản lão hóa tế bào da Nghĩa là, tác dụng hay có phần đóng góp Scopoletin Đây đóng góp tìm hiểu mối quan hệ thành phần hóa học tác dụng sinh học dược liệu, chứng minh kinh nghiệm dân gian sử dụng Đa tử biển, gợi mở thử nghiệm tác dụng sinh học Đa tử biển - 71 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Qua nghiên cứu thu số kết sau: Thực vật Kết hợp mơ tả hình thái, cấu tạo giải phẫu đặc điểm vi học, kết luận: Mẫu nghiên cứu có tên khoa học Limnocitrus littoralis Miq., họ Cam (Rutaceae) Tinh dầu Bằng phương pháp cất kéo nước thu tinh dầu Đa tử biển Sơ xác định hàm lượng tinh dầu 1,44% vỏ 2,24% Tinh dầu Đa tử biển (cả tinh dầu vỏ quả) có màu vàng, nhẹ nước, có mùi thơm Là hỗn hợp gồm nhiều hydrocacarbon Sơ xác định tinh dầu có 12 thành phần: β–Carophyllene (4,05%); Cyclohexane (1,09%); Valencene (5,51%); β–Panasinsene (28,82%); 1,5,8–p– Menthatriene (0,53%); Delta 3–Carene (1,88%); (R+)Limonen (1,21%); 1,3,6-Octatriene (0,42%); β–Myrcene (21,72%); 2–β– Pinene (19,05%); β–Phellandrene (1,47%); 1R,2,6,6–Trimethylbicyclo[3.1.1] hept–2–ene (0,78%) Trong β – Panasinsene thành phần Sơ xác định tinh dầu vỏ có thành phần: d1- Limonen (15,17%); 1,3,6-Octatriene (46,79%); γ-Terpinene (6,95%); 1,4,8–0– Menthatriene (6,92%); Caryophyllene (5,41%); Valencene (4,37%); 2–β– Pinene (7,49%); 1-methyl-3-(1-methylethyl)-Benzene (2,61%) Trong 1,3,6-Octatriene thành phần tinh dầu vỏ Thành phần hóa học thân mẫu nghiên cứu Định tính thành phần hóa học phản ứng hóa học thấy: - Thân Đa tử biển có chứa: coumarin, flavonoid, đường khử - Lá Đa tử biển có: saponin, flavonoid, coumarin, tanin - 72 - Từ cao ethylacetat/(thân) phân lập chất tinh khiết (kết tinh, độ chảy xác định, tinh khiết SKLM HPLC), phân tích cấu trúc (UV, IR, MS, MNR) xác định Scopoletin Đây chất lần phân lập từ thân Đa tử biển Sử dụng Scopoletin phân lập làm chất chuẩn kỹ thuật nhận dạng dấu vân tay sơ xác định Scopoletin có mặt phân đoạn ethylacetat/lá Kiến nghị Các kết đề tài đáp ứng đầy đủ mục tiêu đề Tuy nhiên, công trình bước đầu, kết hiểu biết sơ ban đầu dược liệu Đa tử biển Vậy xin đưa số đề xuất sau: - Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học thân phận khác Đa tử biển - Nghiên cứu tác dụng sinh học Đa tử biển nói chung, tinh dầu, thành phần hóa học - Nghiên cứu biến động hàm lượng tinh dầu theo điều kiện sinh thái, khí hậu, thời tiết, thời kỳ sinh trưởng phát triển cây/bộ phận; phân tích đầy đủ thành phần tinh dầu (định tính định lượng) - Điều tra tài nguyên biện pháp bảo vệ nguồn tài nguyên dược liệu, nguồn gen - 73 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bộ môn Dược liệu-Trường Đại học Dược Hà Nội (1999), Thực tập dược liệu-Phần hố học Bộ mơn Dược liệu-Trường Đại học Dược Hà Nội (1999), Thực tập Dược liệu-Phần vi học Bộ môn Dược liệu-Trường Đại học Dược Hà Nội (1999), Bài giảng Dược liệu tập I Bộ môn Dược liệu-Trường Đại học Dược Hà Nội (1999), Bài giảng Dược liệu tập II Bộ môn Thực vật-Trường Đại học Dược Hà Nội (2004), Thực tập thực vật nhận biết thuốc Bộ môn Thực vật-Trường Đại học Dược Hà Nội (1997), Thực vật dượcPhân loại thực vật Viện dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược Giáo trình sau đại học, NXB khoa học kỹ thuật Viện dược liệu (2008), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, NXB khoa học kỹ thuật Hội đông y tỉnh Ninh thuận (2008), Những thuốc, thuốc đồng bào Chăm 10 Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam III, NXB Y học 11 Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu nhận biết họ thực vật hạt kín VN, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 12 Trần Mạnh Bình (2003), Phân tích cấu trúc hợp chất hữu cơ, Trường đại học Dược Hà Nội, Bộ mơn hóa hữu 13 Nguyễn Văn Đàn-Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học thuốc, NXB Y học - 74 - 14 Lê Văn Đăng (2005), Chuyên đề số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học Quốc gia TPHCM 15 Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội 16 Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng tập II, NXB Khoa học Kỹ thuật 17 Vũ Văn Chuyên (1976), Tóm tắt đặc điểm họ thuốc, NXB Y học 18 Nguyễn Minh Hoàng (2006), Khảo sát tinh dầu vỏ trái giống Citrus sp họ Rutaceae, Luận văn thạc sỹ hóa học – Đại học Quốc gia TPHCM 19 Trịnh Hoàng Hiếu, Nguyễn Thị Thảo Trân, Lê Ngọc Thạch (2009), Khảo sát tinh dầu vỏ trái tắc, Fortunella japonica, Thumb, Đề tài luận văn thạc sỹ hóa – Đại học quốc gia TPHCM 20 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam 2, NXB trẻ, Hà Nội 21 Nguyễn Thị Thanh Lan, Lê Ngọc Thạch, Cao Như Anh, Trần Hữu Anh, Đoàn Ngọc Nhuận, Đỗ Quang Hiền (2003), Tuyển tập Hội nghị Hóa học Tồn quốc lần thứ (Hóa học Hợp chất Thiên nhiên Hóa Dược), Hà Nội 20/10/2003, 224-228 (2003) 22 Vũ Ngọc Lộ (1997), Những tinh dầu quý, NXB khoa học kỹ thuật 23 Vũ Ngọc Lộ, PGS Đỗ Trung Võ, TS Nguyễn Mạnh pha, KS Lê Thúy Hạnh (1996), Những tinh dầu Việt Nam, NXB khoa học kỹ thuật 24 Đỗ Tất Lợi (1985), Tinh dầu Việt Nam, NXB Y học TP.HCM 25 Võ Văn Lẹo (2007), Nghiên cứu khả khai thác số dược liệu thuộc chi Citrus trồng Việt Nam, Luận án tiến sỹ dược học 26 Lã Đình Mỡi (2001) Tài ngun thực vật có tinh dầu Việt Nam, NXB Nông Nghiệp 27 Lưu Dược Từ, Trần Trọng Tài (2010), Khảo sát tinh dầu vỏ Quýt Citrus sp họ Cam - Rutaceae, Luận văn thạc sỹ hóa học - Đại học quốc gia TPHCM - 75 - 28 Nguyễn Đình Triệu (2003), Phương pháp phổ khối lượng, Đại học quốc gia Hà Nội, Trường đại học khoa học tự nhiên 29 Nơng Ích Thượng (2009), Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu Mắc mật (Clausena indica (Dalzell) Oliv.1861 thuộc họ Cam – (Rutaceae) Cao Bằng, Đề tài nghiên cứu cấp sở 30 Lê Ngọc Thạch (2003), Tinh dầu, NXB Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh 31.Nguyễn Năng Vinh (1978), Kỹ thuật khai thác sơ chế tinh dầu, NXB Nông nghiệp Tài liệu tiếng anh 32 An-Sheng Cheng, Yu-Hsiang Cheng and Tsu-Liang Chang (2012), Scopoletin attenuates allergy by inhibiting Th2 cytokines production in EL-4 T cells, Food and Function 33 Brett J West and Rachel A Sabin (2012), Efficacy of a Morinda citrifolia Based Skin Care Regimen, Current Research Journal of Biological Sciences 4(3): 310-314, 2012 34 Ernest Guenther (1949), The Essential oils, VanNostrand, 2, 22-259 35 Ernestj.parry, B.SC.(Lond), F.I.C., F.C.S of Graysinn, barrister – at – law, The chemistry of essential oils and aftificial perfumer , Voll II,pp.244 36 Giovanni Dugo and Angelo Di Giacomo (2003), Citrus: The Genus Citrus, Taylor and Francis, Boca Raton, 1-15 37 Imai F., Itoh K., Kishibuchi N., Kinoshita T., Sankawa U (1989) Constituents of the root bark of Murraya paniculata collected in Indonesia Chemical & Pharmaceutical Bulletin 37 (1), 119-123 38 Nguyen Duong Thanh Thi, Tran Huu Anh, Le Ngoc Thach (2008) Journal of Essential Oil-Bearing Plants 11, 154-161 - 76 - 39 Marina Soković 1,2, Jasmina Glamočlija 2, Petar D Marin 3, Dejan Brkić and Leo J L D van Griensven (2010), Antibacterial Effects of the Essential Oils of Commonly Consumed Medicinal Herbs Using an In Vitro Model, Molecules ISSN 1420-3049 40 Nancy Sauvan, Isabelle Renimel, Cecile Lamy, Delphine Dupon (2009), Comestic composition comprising an extract of Limnocitrus littoralis 41 Pharmacopoeia of the people’s republic of china (2005) 42 Silverstein R.M., Webster F.X (1998), Spectrometric identification of organic compounds, Sixth edition John Wiley & Sons, Inc USA 43 Siddiqui B.S., Sattar F.A., Ahmad F., Begum S (2007) Isolation and structural elucidation of chemical constituents from the fruits of Morinda citrifolia Linn Archives of Pharmacal Research 30 (8), 919-923 44 Tsukamoto H., Hisida S., Nishibe S (1985) Coumarins from bark of Fraxinus japonica and F mandshurica var japonica Chemical & Pharmaceutical Bulletin 33 (9), 4069-4073 45 Flora of Indonesia 46 Yongkaew Sea – tang (2005), Chemical Constituents from Morinda citrifolia their Biological Activities, Master of Science (Chemistry) Graduate School Kasetsart University - 77 - ... học Đa tử biển (Limnocitrus littoralis (Miq. )Sw . ), họ Cam (Rutaceae) Ninh Thuận với mục tiêu sau: - 10 - Nghiên cứu đặc điểm thực vật Đa tử biển Nghiên cứu thành phần hóa học thân mẫu nghiên cứu. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY ĐA TỬ BIỂN (LIMNOCITRUS LITTORALIS (Miq. )Sw . ), HỌ CAM (RUTACEAE) Ở NINH. .. đưa vào sách đỏ thực vật có nguy đe dọa Mặt khác, Đa tử biển có tên tài liệu thuốc chưa nghiên cứu đầy đủ dược liệu học Chính vậy, tơi thực đề tài: Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học