Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học loài bình vôi thu hái ở sapa ( stephania brachyandra diels )

Theo Đỗ Tất Lợi [25] có trích dẫn các tài liệu khác, năm 1940 Bùi Đình Sang xác định củ bình vôi mọc ở Việt Nam có tinh bột, đường khử, men oxydase, nhiều alcaloid với tỉ lệ 0,12-0,15% t

Bộ Y tế

ĐỖ PHƯƠNG LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN• • •

HOÁ HỌC LOÀI BÌNH VÔI THU HÁI Ở SA PA

(STEPHANIA BRACHYANDRA DIELS)

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1999 - 2 0 0 4 )-^

r f y < 0.01%

\$4 9 t T / V j

- Người hướng dẫn : GS.TS Phạm ThanftJCy Z s (ử /

ThS Nguyễn Quốc Huy

TRƯỜNG ĐH DƯỢC HÀ NỘI

- Thời gian thực hiện : 15/ 02/ 2004 - 15/ 05/ 2004

HÀ NỘI, THÁNG 05 - 2004

\ l l 8 l • \ \

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỂ 1

PHẦN 1- TỔNG Q U A N 2

1.1- Đặc điểm thực vật của chi Stephania L our 2

1.1.1- Vị trí phân loại của chi Stephania Lour 2

1.1.2- Đặc điểm chung của chi Stephania L o u r 2

1.1.3- Các loài thuộc chi Stephania ở Đông Dương và Việt N am 2

1.2- Phân bố của chi Stephania L our 3

1.2.1- Trên thế g iớ i 3

1.2.2-ở Việt Nam 4

1.3- Thành phần hoá học 4

1.3.1- Nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania trên thế giới 4

1.3.2- Những nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania ở Việt Nam 5

1.4- Tác dụng dược lý và độc tín h 7

1.5- Công dụng và dạng bào chế 8

PHẦN 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 10

2.1- Nguyên liệ u 10

2.2- Phương tiện nghiên cứu 10

2.2.1- Súc vật thí nghiệm 10

»2.2.2- Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 10

2.3- Thử độc tính cấp 11

PHẨN 3- THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 12

* 3.1- Mô tả đặc điểm thực v ậ t 12

14 14 14 15 17 17 17 19 19 19

20

20

20

21

21

21 22 24 26 27 29 32 32 32 32 34

3.2- Đặc điểm vi phẫu

3.2.1- Đặc điểm vi phẫu thân

3.2.2- Đặc điểm vi phẫu cuống l á

3.2.3- Đặc điểm vi phẫu gân lá

3.3- Đặc điểm bột dược liệu

3.3.1- Đặc điểm bột củ

3.3.2- Đặc điểm bột th â n

3.4- Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân và c ủ

3.4.1- Định tính alcaloid

3.4.2- Định tính flavonoid

3.4.3- Định tính antranoid

3.4.4- Định tính coumarin

3.4.5- Định tính glycosid

3.4.6- Định tính saponin

3.4.7- Định tính tanin

3.4.8- Định tính tinh b ộ t

3.4.9- Định tính đường khử tự do

3.5- Định tính alcaloid bằng SKLM

3.6- Định lượng alcalid toàn phần

3.7- Định lượng L-tetrahydropalmatin

3.8- Chiết xuất alcaloid toàn phần từ c ủ

3.9- Phân lập alcaloid

3.9.1- Phân lập alcaloid bằng sắc ký cột

3.9.2- Phân lập alcaloid bằng phương pháp điều chỉnh pH 3.93- Phân lập alcaloid bằng SKLM điều chế

3.10- Nhận dạng alcaloid

.34 34 34 35 36 39 39 40 40 42 42 43 43 45 45 46

3.10.1- Kiểm tra độ tinh khiết các alcaloid

3.10.2- Nhận dạng các chất T2, Tj, RT, Pj, RLj, V| 3.10.2.1- Nhận dạng chất T2

3.10.2.2- Nhận dạng chất Tt

3.10.2.3- Nhận dạng chất RT

3.10.2.4- Nhận dạng chất Pt

3.10.2.5- Nhận dạng chất R L j

3.10.2.6- Nhận dạng chất V !

3.11- Thử độc tính cấp của dịch ép củ tươi

3.12- Khảo sát sơ bộ khả năng nhân giống loài

3.12.1- Nhân giống bằng mảnh c ủ

3.12.2- Nhân giống bằng củ nguyên vẹn

3.12.3- Nhân giống bằng hạt

PHẦN 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT

4.1- Kết lu ậ n

4.2- Đề x u ấ t

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Đ Ặ T V Ấ N ĐỂ

Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới và đa dạng về địa hình do đó Việt Nam có nguồn tài nguyên cây thuốc rất phong phú

Chi Stephania Lour, là một chi lớn và phức tạp đã được nghiên cứu nhiều trên

thế giới cũng như ở Việt Nam Tuy nhiên cho đến nay nhiều loài trong chi này vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ

Với xu thế sử dụng thuốc hiện nay, ngành Dược đang chú trọng đến các chất có tác dụng chữa bệnh nguồn gốc thảo dược Hơn nữa, đã có những khuyến cáo chính thức

về nhóm thuốc Diazepam do khả năng gây nghiện và một số tác dụng không mong muốn khác nên việc nghiên cứu các dược liệu có tác dụng an thần càng trở nên có ý nghĩa

Loài bình vôi Stephania brachyandra Diels thu hái ở Sa Pa chưa có tài liệu nào ở

Việt Nam công bô cụ thể Với đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần

hoá học một loài bình vôi thu hái ở Sa Pa (Stephania brachyandra Diels)” em hy

vọng góp một phần nhỏ nghiên cứu để có hướng sử dụng và bảo tồn tốt hơn với các nội dung sau:

1- Về thực vật:

- Mô tả đặc điểm thực vật, kiểm định tên khoa học của loài nghiên cứu

- Xác định đặc điểm vi phẫu thân, lá và đặc điểm bột dược liệu loài nghiên cứu.2- Thành phần hoá học:

- Định tính các nhóm chất trong dược liệu

- Định lượng alcaloid toàn phần và L-tetrahydropalmatin trong dược liệu

- Chiết xuất và phân lập một số alcaloid

PHẦN 1- TỔNG QUAN

1.1- Đặc điểm thực vật của chi Stephania Lour.

1.1.1- Vị trí phân loại chi stephania Lour.

Theo tài liệu [2], [7], [12], [39], chi Stephania Lour, thuộc họ Tiết dê

(Menispermaceae), phân bộ Tiết dê (Menispermineae), bộ Hoàng liên (Ranunculales), thuộc liên bộ Hoàng liên (Ranunculanae), trong phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae), thuộc lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), trong ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) hay còn gọi là ngành Hạt kín (Angiospermae)

1.1.2- Đặc điểm chung của chi stephania Lour.

Theo tài liệu [2], [25], [39], [42], [43], chi Stephania Lour, được mô tả như sau:

Dây leo, hầu hết mảnh khảnh Thân gỗ hay thân cỏ Rễ đôi khi thành củ Lá với cuống thường gấp khúc ở gốc, phiến lá hình lọng, thường hình trứng hay gần hình tròn, 8-13 gân lá hình chân vịt Cụm hoa ở kẽ lá hay mọc trên thân cây già không lá, thường cấu tạo bởi những xim dạng tán có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm, ít nhất ở các nhánh của tán cấp 1, các nhánh cuối cùng đôi khi không đều, hoặc đôi khi có các xim tụ họp thành đầu hình đĩa Hoa đực 6 -8 lá đài rời nhau, xếp thành 2 vòng, bằng

nhau hay không bằng nhau, hoặc chỉ có 2-3 lá đài ở loài s capitata, đài ít nhiều hình

trái xoan ngược Cánh hoa rời nhau, 3 hay 4, hình trứng ngược, mép bên nhiều khi gập vào trong Nhị hợp thành một trụ, bao phấn 4-8 ô nứt ngang Hoa cái đối xứng hay bất đối xứng, 1-8 lá đài, 2-4 cánh hoa, 1 lá noãn vòi rất ngắn hoặc không có, núm nhị chia thuỳ ngắn hoặc rách, choãi ra Quả hạch hình trứng ngược với vết sẹo của núm gần gốc, nhẵn; vỏ quả trong ở phía lưng mang một dải hình móng ngựa gồm 2 hay 4 dãy dọc các bướu hay những gờ ngang Hạt hình móng ngựa Giá noãn có các lỗ thủng có hoặc không Cây mầm có lá mầm bằng rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ

1.1.3- Các loài thuộc chi Stephania Lour, ở Đông Dương và Việt Nam.

Trên thế giới hiện nay thống kê được tên khoảng 107 loài thuộc chi Stephania [39].

2

Thống kê ở Đông Dương và Việt Nam, theo tác giả Nguyễn Tiến Bân [2] có 9 loài, Võ Văn Chi [12] có 8 loài, Phạm Hoàng Hộ [19] có 7 loài, Trần Công Khánh [6]

có 9 loài, Sách đỏ Việt Nam [30] có 5 loài

Theo Nguyễn Chiều, Ngô Trại [10], Nguyễn Tiến Vững [11], [39], [40] mô tả

14 loài thuộc chi Stephania có ở Việt Nam (bảng 1)

Bảng 1 Một sô loài thuộc chi Stephania Lour, có ở Việt Nam.

23; 36

1.2- Phân bố của chi stephania Lour.

1.2.1- Trên thê giới.

Theo tài liệu [39], [42], [43] chi Stephania phân bố ở vùng nhiệt đới, Á nhiệt

đới, có ở các nước: Indonexia, Myanma, Malayxia, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Philippin, Ấn Độ, Bangladesh, Srilanca, Trung Quốc, Đài Loan, Papua New Guinea, Nhật Bản, Australia, Nigeria, Ethiopi về số lượng loài thuộc chi Stephania Lour, trên thế giới các tài liệu không thống nhất

1.2.2- Ở Việt Nam.

Theo tài liệu [5], [10], [21], [39], các loài bình vôi thường mọc hoang ở một số vùng núi đá vôi, núi đất, núi đất lẫn đá, ở đồng bằng, ven biển, có loài mọc ngay trên bãi cát hoặc gò cát hoang vùng ven biển

Các loài bình vôi ở nước ta có diện phân bố rất rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung,Nam

+ Miền Bắc: Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Hà Tây, Hoà Bình, Yên Bái, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Phú Thọ, Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Nam Định, Ninh Bình

+ Miền Trung: Thanh Hoá, Nghệ An, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Ninh Thuận, Quảng Nam, Đà Nẵng, Thừa Thiên Huế, Bình Định, Phú Yên

+ Miền Nam: An Giang, Đồng Nai, Sông Bé, Bà Rịa-Vũng Tàu

1.3- Thành phần hoá học.

1.3.1- Những nghiên cứu về alcaloid trong chi stephania trên thế giới.

Song song việc nghiên cứu về thực vật của chi Stephania, nhiều nhà khoa học đã

đi sâu nghiên cứu thành phần hoá học của các loài trong chi này Thành phần hoá học của chi Stephania gồm có alcaloid, tinh bột, đường khử, acid malic, men oxydase Trong đó alcaloid là thành phần chính và được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất

Theo tài liệu [39], alcaloid có trong chi Stephania Lour, chia làm 8 nhóm chính (bảng 2)

4

+■

Bảng 2 Các nhóm chất chính trong chi Stephania Lour.

1 Benzyl isoquinolin Gồm 3 chất, trong đó có chất Papaverin C20H2| N 04

2 Bis benzyl isoquinolin Gồm 40 chất, trong đó có chất Tetrandrin C38H42N20 4

C21H25 N 04 và Palmatin C21H25 N(+)04

5 Proaporphin Gồm 3 chất, trong đó có Stepharin C18H19N 03

7 Morphinan Gồm 11 chất, trong đó có Sinoacutin C14H2|N 04

8 Dibenzazonin Gồm 1 chất là Protostephanin C21H27N0 4 có trong

loài Stephania japonica (Thunb) Miers

1.3.2- Những nghiên cứu về alcaloid trong chi stephania ở Việt Nam.

Theo Đỗ Tất Lợi [25] có trích dẫn các tài liệu khác, năm 1940 Bùi Đình Sang xác định củ bình vôi mọc ở Việt Nam có tinh bột, đường khử, men oxydase, nhiều alcaloid với tỉ lệ 0,12-0,15% (tính trên củ tươi), trong đó chiết được một alcaloid, Bùi Đình Sang đặt tên là Rotundin

Năm 1965, Viện nghiên cứu cây thuốc và cây có tinh dầu toàn bang Xô Viết (Vilar) đã xác định Rotundin của Bùi Đình Sang chiết được từ củ bình vôi ở Việt Nam chính là L-tetrahydropalmatin

Năm 1964, Ngô Vân Thu [33] chiết được một alcaloid ở loài bình vôi khác với

tỷ lệ 0,1% và đã xác định đó là Roemetin năm 1971

L-tetrahydropalmatin trên một số mẫu bình vôi mọc hoang ở các bộ phận thân, rễ, củ đi đến kết luận:

- Hàm lượng L-tetrahydropalmatin trong củ bình vôi không phụ thuộc vào màu sắc, khối lượng và hình dáng của củ Để bảo đảm chất lượng của dược liệu, kết hợp bảo

vệ tái sinh cây, chỉ nên thu những củ có khối lượng từ 800g đến lOOOg trở lên

Năm 1981, Văn Thị Sáu [30] phát hiện L-tetrahydropalmatin ở loài Stephania

piereỉ Diels thu được ở Nghĩa Bình.

Năm 1992, Ngô Thị Tâm [31] công bố phát hiện có chất Cepharanthin trong củ

bình vôi Stephania pierrei Dỉels thu hái ở Nghĩa Bình.

Năm 1999, Nguyễn Tiến Vững [39] đã phân lập và xác định cấu trúc 5 alcaloid:

- L-tetrahydropalmatin từ củ cả 3 loài Stephania glabra (Roxb.) Miers., Stephanỉa kuinanensis H.S.Lo et M.Yang., Stephania sp3.

- Roemetin từ quả xanh loài Stephania glabra (Roxb.) Miers

- Palmatin từ củ loài Stephania sp3 thu hái từ Quảng Ninh.

- Cycleanin từ củ loài Stephania sp3 thu được từ Quảng Ninh.

- Stepharin từ củ loài Stephania kuinanensis H.S.Lo et M.Yang

« Năm 1999, Nguyễn Thị Hoài Anh [1] đã phân lập được 3 alcaloid từ củ bình vôi

mọc ở Mộc Châu - Sơn La, không rõ loài gì nhưng đã xác định được cấu trúc hoá học

- 9,10 Dihydroxy - 2,3 - dimethoxy tetrahydroprotoberberin

- 2,10 Dihydro - 3,9 - dimethoxy tetrahydroprotoberberin (Stepholidin)

- 2 Hydroxy - 3,9,10 - trimethoxy tetrahydroprotoberberin (Iso corypalmin tetrahydrocolumbamin)

L-tetrahydropalmatin trong củ Dòm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) thu hái ở Hà Tây là

0,41% Đã chiết xuất và phân lập được một chất khác, dự kiến công thức là CiyH1303N,

có cấu trúc khung Aporphin

ở Việt Nam chưa tìm được tài liệu nào nghiên cún cụ thể về thành phần hoá

học của loài bình vôi Stephania brachyandra Diels thu hái ở Sa Pa.

6

1.4- Tác dụng dược lý và độc tính.

Rotundin (L-tetrahydropalmatin)

Theo tài liệu [35] L-tetrahydropalmatin thử trên chuột cống trắng đã chứng minh có tác dụng an thần, gây ngủ, với liều 25-30 mg/kg làm giảm hoạt động tự nhiên của chuột thí nghiệm Dùng với liều cao xuất hiện loạn vận động và triệu chứng giữ nguyên thể (catalepsy) với liều 2,5 mg/kg L-tetrahydropalmatin đối kháng tác dụng kích thích làm tăng hoạt động của chuột do Phenamin gây nên Trên chuột nhắt trắng bằng đường uống với liều 30mg/kg L-tetrahydropalmatin có tác dụng kéo dài giấc ngủ của Thiopentan gấp 1,5 lần Đối với hoạt động của hệ thần kinh trung ương, quan sát trên điện não đồ của thỏ có cắm điện cực ở các vùng cảm giác, vận động trước sau phải trái và vùng thị giác của hai bán cầu não thấy L-tetrahydropalmatin với liều 20mg/kg làm xuất hiện các cụm sóng chậm có biên độ cao Ngoài ra, thành phần các sóng delta ở các vùng vận động tăng và thành phần các sóng nhanh beta giảm

Trên mô hình gây co giật bằng Conazol hoặc bằng Strychnin hoặc bằng shock điện Rotundin với liều cao ( > 100 mg/kg) có tác dụng kháng co giật và bảo vệ được một phần súc vật khỏi bị tử vong Trên mèo gây mê dùng Rotundin bang đường tiêm tĩnh mạch với liều 5-20 mg/kg có tác dụng làm hạ huyết áp [35]

Thí nghiệm trên ruột thỏ tại chỗ (insitu) với liều 0,5-1,0 mg/kg làm giảm trương lực cơ trơn trên ruột Bằng đường uống trên thỏ thí nghiệm với liều 15mg/kg L-tetrahydropalmatin có tác dụng giảm đau [35]

Trên chuột cống trắng bình thường và chuột bị cắt tuyến giáp trạng, L-tetrahydropalmatin đều có tác dụng hạ nhiệt độ và giảm chuyển hoá cơ bản Tác dụng hạ nhiệt có thể là do ức chế trung khu điều nhiệt và làm giãn các mạch máu ngoại vi [35]

Về độc tính cấp, trên chuột nhắt trắng bằng đường uống, Rotundin chlohydrat có

LD50 = 1000 mg/kg Trên thỏ, tiêm tĩnh mạch với liều 30mg/kg, súc vật tỏ ra mệt mỏi trong 1-2 ngày sau đó phục hồi bình thường [35]

v ề độc tính mạn, trên chuột cống trắng cho cùng với liều 10-30mg/kg trong 60 ngày liên tiếp không thấy xuất hiện các triệu chứng nhiễm độc trên các lô thí nghiệm [35],

Thí nghiệm trên chuột cống trắng đực, dùng với liều 8mg trên mỗi con chuột, không gây đột biến nhiễm sắc thể ở tế bào tuỷ xương và tế bào tinh hoàn [35]

Cepharanthin

Cepharanthin được phân lập từ Stephania cepharantha và Stephania pỉerrei theo

tài liệu [32] thử trên súc vật chiếu xạ tia X, Cepharanthin với liều lmg/kg làm giảm nhẹ hiện tượng giảm bạch cầu do sử dụng các thuốc chống ung thư gây nên, còn có tác dụng

ức chế kết tập tiểu cầu máu do collagen gây nên và có tác dụng ngăn ngừa sự phát triển của bệnh bụi phổi thí nghiệm Cepharanthin được coi là một chất có tác dụng kích thích miễn dịch và làm giảm nhẹ một cách hữu hiệu những tác dụng phụ của các thuốc chống ung thư Cepharanthin ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao Thí nghiệm trên ống kính (invitro) ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư Hela và Hela S3 Cepharanthin

đã được chứng minh có tác dụng ức chế mạnh quá trình sao chép (replication) của HIV I [35]

1.5- Công dụng và dạng bào chế.

Theo các tài liệu [4], [5], [8 ], [9], [25], [35], [38] đã ghi loài bình vôi Việt Nam có:

Tính vị, quy kinh: Vị đắng hơi ngọt, tính mát, quy vào hai kinh can và tỳ

Công năng, chủ trị: An thần, dưỡng huyết, thanh nhiệt, giải độc, tán ứ, hành huyết, hoá đàm, tán kết, khu phong, hoạt lạc Chủ trị mất ngủ, sốt nóng, nhức đầu, đau

dạ dày, hen suyễn, khó thở, phối hợp với các thuốc khác để trị ho, sốt rét, kiết lỵ, ngoài

da lở ngứa, mụn nhọt

Ngày 3-6g dược liệu dạng thuốc sắc, thuốc bột hay rượu thuốc

Ngày dùng 0,05g - 0,1 Og Rotundin dưới dạng thuốc bột, thuốc viên Có thể chế thành dạng tiêm 0,05g Rotundin hydroclorid hay Rotundin sulfat trong ống 5ml Trẻ

em từ 1-5 tuổi uống với liều từ 0,020g - 0,025g; trẻ em 5-10 tuổi uống từ 0,030g- 0,050g

8

Hiện nay trên thị trường có các dạng bào chế:

- Viên Rotunda 30mg, viên Sen vông, viên Tepar, siro Rotunda (Xí nghiệp Dược phẩm TW II)

- Viên Rotunda 30mg (Xí nghiệp Dược phẩm TW I)

- Viên Rosen30 (30mg/viên), chè an thần (Xí nghiệp Dược phẩm Hà Nội)

- Viên StiluxóO (60mg/viên) (Công ty cổ phần Traphaco)

- Rotundin sulphat tiêm (60mg/2ml) (Học viện Quân Y)

PHẦN 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1- Nguyên liệu.

Chúng tôi thu hái mẫu tại Sa Pa (Lào Cai) từ tháng 07 năm 2002 đến nay, lấymẫu trồng ở Hà Nội, theo dõi sự phát triển của cây, thu mẫu có hoa, quả, hạt để địnhtên khoa học và lấy củ, thân cây làm nguyên liệu nghiên cứu

2.2- Phương tiện nghiên cứu.

2.2.1- Súc vật thí nghiệm:

Chuột nhắt trắng (chủng Swiss do viện vệ sinh dịch tễ cung cấp) cả hai giống

khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, trọng lượng 20 ± 2 (g).

2.2.2- Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.

- Vi phẫu được chụp ảnh trực tiếp trên kính hiển vi tại bộ môn Thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội

- Phân tích hoa bằng kính núp nổi Nikon của Nhật tại bộ môn Thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội

- Đo độ ẩm xác định trên máy Precisa tại Bộ môn Dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội

- Đo phổ tử ngoại (UV) trên máy UV-VIS Spectrophotometer cary IF-Varian (Australia) tại phòng thí nghiệm trung tâm Trường Đại học Dược Hà Nội

- Đo phổ hồng ngoại (IR) trên máy FT-IR- Spectrophotometer 1650 Elmer (USA) tại phòng thí nghiệm trung tâm Trường Đại học Dược Hà Nội

- Phổ khối (MS) đo trên máy: 5989B-MS, tại phòng cấu trúc, Viện hóa học, Trung tâm Khoa học tự nhiên và công nghệ Quốc gia

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy NMR-BRUKER- 500MHZ tại phòng NMR, Viện hoá học, Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia

- Định lượng Rotundin trong dược liệu trên máy HPLC 1100 với detector uv

tại Viện kiểm nghiệm

10

- Thử độc tính cấp tại phòng Dược lý Viện kiểm nghiệm Trung Ương.

2.3- Phương pháp nghiên cứu.

- Vi phẫu được cắt và nhuộm kép theo phương pháp ghi trong tài liệu “Thực tập hình thái và giải phẫu thực vật” [24]

- Vi phẫu sau khi nhuộm kép được chụp qua kính hiển vi

- Định tính các nhóm chất trong dược liệu theo tài liệu “Bài giảng dược liệu” [5] và “Thực tập dược liệu” [6]

- Chiết xuất và phân lập các alcaloid trong dược liệu theo tài liệu “Bài giảng dược liệu” [5],

- Định lượng alcaloid toàn phần bằng phương pháp acid - base

- Định lượng L-tetrahydropalmatin theo phương pháp HPLC [16]

- Nhận dạng các chất phân lập được dựa trên điểm chảy, SKLM so với chất chuẩn và số liệu các phổ u v , IR, MS và phổ mô phỏng

- Thử độc tính cấp theo hướng dãn kèm theo quyết định số 371/BYT-QĐ ngày 12/3/1996 về xác định độ an toàn cho thuốc cổ truyền của Bộ Y Tế và tài liệu [19], [46],

PHẦN 3- THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

3.1- Mô tả đặc điểm thực vật.

Quan sát tại thực địa và tiêu bản lấy được cho thấy cây bình vôi chúng tôi nghiên cứu có thân leo nhỏ, yếu Cành non màu nhạt, khi già chuyển sang màu nâu xám Toàn cây không lông, có nhựa trong suốt không màu Củ dạng thay đổi, vỏ xù xì, màu nâu xám, nâu nhạt hay màu đất, khối lượng 3-5kg, đường kính củ 15-30cm, ruột

củ màu vàng, lát cắt có nhiều xơ Lá đơn màu xanh, mép nguyên, mọc so le Cuống lá dài Phiến lá hình trứng nhọn hoặc hình tim Chóp lá nhọn sắc, gốc lá bằng hoặc hơi lõm Gân 10 chiếc, toả đều, xuất phát từ đỉnh của cuống lá Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa cái tán kép, cuống cụm hoa dài 5-10cm, do 17-18 tán kép có cuống dài 0,5- l,0cm tạo thành, ở gốc tán có lá bắc nhỏ, mỗi tán lại gồm 3 tán nhỏ, cuống tán rất ngắn l-2mm, mỗi tán nhỏ gồm 3 hoa đính sát gốc Hoa cái nhỏ có một đài màu lục nhạt, nhỏ, hình mác rộng nhọn đầu, 2 cánh hoa rời, xếp lệch về hai phía, màu vàng cam, hình trứng ngược, dày, nạc, dài 0,5-0,7mm Bầu hình trứng ngược, cuống ngắn, núm nhuỵ 4-

5 thuỳ Cụm hoa đực tán kép gồm 6 tán, cuống cụm hoa dài 10-15cm, cuống tán dài 2- 3cm, mỗi tán gồm 5-6 hoa, cuống hoa dài 4-5mm, ở gốc có lá bắc nhỏ Hoa đực nhỏ gồm 6 lá đài rời, xếp trên một vòng, kích thước đều nhau, dài l,8-2,0mm, đầu hơi tròn,

3 cánh hoa rời, kích thước gần đều nhau, hình trứng ngược, dài 0,8-l,0mm, bộ nhị hàn liền thành một trụ cao khoảng 0,5-l,0cm, với 6 bao phấn xếp thành vòng tròn Quả hình trứng ngược, dài 0,7-0,8cm, hơi dẹt, khi chín có màu đỏ, Hạt hình móng ngựa có 4 hàng gai gờ lên phía mép hạt, mỗi hàng gai gồm 12-14 gai nhỏ Giá noãn có lỗ hình trứng đảo ở giữa

Sau khi quan sát và phân tích nhiều lần các đặc điểm mẫu cây nghiên cứu ở Sa

Pa (Lào Cai), đối chiếu với các tài liệu phân loại và cử nhân Nguyễn Chiều đã định tên

loài Stephania chúng tôi nghiên cứu là Stephania brachyandra Diels, họ Tiết dê:

Menỉspermaceae Tên Việt Nam: Bình vôi núi cao, bình vôi nhị ngắn.

12

3.2- Đặc điểm vi phẫu.

3.2.1- Đặc điểm vi phẫu thân: Sử dụng đoạn thân bánh tẻ làm mẫu nghiên cứu

Lấy lát cắt ngang phần thân cây: Tẩy, nhuộm kép, loại nước, cố định tiêu bằn

để khô tự nhiên, soi dưới kính hiển vi, quan sát thấy các đặc điểm sau (hình 2):

- Biểu bì (1): Cấu tạo bởi một hàng tế bào hình chữ nhật đều, phía ngoài phủ cutin

- Mô mềm vỏ (2): Mô mềm vỏ thân được phân thành 2 phần bởi cung mô cứng uốn lượn hình cánh hoa “ 12 cánh”

+ Mô mềm phía ngoài cung mô cứng: Gồm khoảng 10-15 hàng tế bào hình trứng, màng mỏng bằng cellulose, kích thước nhỏ hơn nhiều so với các tế bào mô mềm

xếp liền nhau tạo thành vòng gồm 12 cung

- Bó libe - gỗ cấp II (4): Libe ở ngoài, gỗ ở trong, giữa bó libe - gỗ là hàng tế bào tượng tầng (tầng phát sinh libe - gỗ)

- Mô mềm ruột (5): Gồm những tế bào màng mỏng bằng cellulose, hình cầu, kích thước không đều nhau

- Tia ruột (6): Gồm những tế bào màng mỏng bằng cellulose, nằm xen kẽ các bó libe gỗ

-3.2.2- Đặc điểm vi phẫu cuống lá.

Cắt ngang cuống, tẩy và nhuộm kép, soi kính hiển vi thấy có đặc điểm sau:

Mặt cắt cuống lá có tiết diện tròn, từ ngoài vào trong có (hình 3):

- Biểu bì (1): Gồm 1 hàng tế bào hình chữ nhật đều đặn, phía ngoài phủ một lớp cutin

- Mô dày (2): Gồm 2-3 hàng tế bào mô dày góc xếp xen kẽ với hàng tế bào biểu bì

14

- Mô mềm vỏ (3): Gồm 4-5 hàng tế bào hình trứng kích thước không đều nhau, xếp khá xít vào nhau.

- Cung mô cứng (4): Gồm 2-3 hàng tế bào hình nhiều cạnh, có màng hoá gỗ, xếp uốn lượn theo các bó libe - gỗ

- Bó libe - gỗ (5): Gồm 8 bó libe - gỗ kích thước khá đều nhau

+ Bó libe: Phía ngoài, gồm nhiều tế bào màng mỏng bằng cellulose

+ Bó gỗ: Phía trong, gồm nhiều bó gỗ kích thước không đều nhau

- Mô mềm ruột (6): Gồm những tế bào màng mỏng bằng cellulose, hình tròn, kích thước không đều nhau

3.2.3- Đặc điểm vi phẫu phần gân lá.

Lát cắt ngang gân lá và một phần phiến lá được tẩy và nhuộm kép, soi kính hiển

vi thấy (hình 6):

* Gân lá.

- Biểu bì trên và dưới (1): Gồm 1 hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn, phía ngoài phủ

- Mô dày (2):

+ Mô dày trên: Một hàng tế bào mô dày ngay dưới lớp biểu bì hình dạng các tế bào không đều nhau

+ Mô dày dưói: Gồm 1-2 hàng tế bào mô dày có kích thước lớn hơn mô dày phía trên

- Mô mềm (3): Các tế bào màng mỏng bằng cellulose hình trứng kích thước không đều nhau, xếp xít vào nhau

- Bó libe - gỗ (4): Libe - gỗ tạo thành một bó lớn ở giữa gân lá Libe ở phía dưới, gỗ ở phía trên

* Phiến lá.

- Biểu bì trên và dưới: tương tự phần gân lá

- Mô giậu (5): gồm vài hàng tế bào mô giậu hình chữ nhật đều đặn xếp vuông góc với hàng tế bào biểu bì trên

Hình 2 Vi phẫu thân.

Hình 3 Vi phẫu cuống lá.

1 6

3.3- Đặc điểm bột dược liệu.

3.3.1- Đặc điểm bột củ.

Bột màu vàng, vị đắng, sau hơi ngọt

Soi kính hiển vi thấy các đặc điểm sau: Tinh bột (1); tinh thể calcioxalat (2), thể cứng (3) (hình 4)

3.3.2- Đặc điểm bột thân.

Bột màu hơi xanh, vị đắng, sau hơi ngọt

Soi kính hiển vi có các đặc điểm sau: Mảnh mạch điểm (1); tinh bột (2); thể cứng (3); tinh thể calcioxalat (4), mô mềm (5), mảnh bần (6) (hình 5)

Hình 4 Đặc điểm bột củ Hình 5 Đặc điểm bột thân.

Ĩ 5

út

Hình 6 Vi phẫu lá.

18

3.4- Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân và củ.

3.4.1- Định tính alcaloid.

Lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nón có dung tích 200-250ml thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch amoniac 6N, trộn cho thấm đều, để yên 30 phút, cho vào bình nón 50ml cloroform Lắc 5-10 phút, rồi để yên 1 giờ Dịch chiết cloroform lọc qua giấy lọc không gấp nếp Lấy 30ml dịch lọc cho vào bình gạn, thêm 5ml H2S0410% lắc 2-3 phút, gạn lấy phần acid để làm phản ứng Cho vào bốn ống nghiệm, mỗi ống lml dịch chiết, rồi thêm vào từng ống một loại thuốc thử và thấy kết quả như sau:

- Ống 1: nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer : có tủa trắng

- Ống 2: nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Dragendorff : có tủa da cam

- Ống 3: nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat : có tủa nâu

- Ống 4: nhỏ 2 - 3 giọt acid picric : có tủa màu vàng

Nhận xét: Dược liệu có alcaloid.

3.4.2- Định tính Flavonoid.

Lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50ml cồn 90°c Lắc đều rồi để qua đêm Lọc và cô cách thuỷ dung dịch lọc còn lại khoảng 10ml Dịch này để thử các phản ứng định tính sau:

- Phản ứng Cyanidin: Cho 2ml dịch chiết vào 1 ống nghiệm, thêm một ít bột Magie kim loại Sau đó cho thêm vài giọt HC1 đặc Để yên một vài phút quan sát không thấy dung dịch chuyển màu từ vàng sang đỏ (phản ứng âm tính)

- Phản ứng với kiềm: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ khô rồi để yên trên miệng lọ có chứa amoniac đặc không thấy màu vàng của dịch chiết được tăng lên (phản ứng âm tính)

- Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết dược liệu, thêm vài giọt NaOH 10%, không thấy xuất hiện tủa màu vàng (phản ứng âm tính)

- Phản ứng với FeCL,: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% không thấy xuất hiện màu xanh đen (phản ứng âm tính)

Nhận xét: Dược liệu không có flavonoid.

3.4.3- Định tính antranoid.

- Định tính antranoid: Cho 2g bột dược liệu vào bình nón 100 ml, thêm 15ml dung dịch acid H2S04 10% Đun cách thuỷ 15 phút Lọc, chuyển dịch lọc vào bình gạn, lắc với 5-7ml ether ethylic trong 1-2 phút Để yên cho tách thành hai lớp, loại bỏ phần nước Cho vào phần ether 5ml dung dịch NaOH 10% Lắc lên thấy xuất hiện màu đỏ sim trong dung dịch kiềm (phản ứng dương tính)

- Vi thăng hoa: Cho vào ống trong nút chai bằng nhôm 1 ít bột dược liệu Đậy nút bằng một phiến kính, trên đó có một ít bông thấm nước Đun dưới nút chai bằng đèn cồn qua lưới amiăng, lấy ra để nguội quan sát dưới kính hiển vi có tinh thể hình kim (phản ứng dương tính)

Nhận xét: Dược liệu có antranoid.

để nguội cho thêm vào mỗi ống 2ml nước cất quan sát và không thấy hiện tượng gì xảy

ra (phản ứng âm tính)

- Phản ứng diazo hoá: Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm vào đó 2ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thuỷ đến sôi và để nguội Thêm vài giọt thuốc thử diazo (mới pha) không thấy xuất hiện màu đỏ gạch (phản ứng âm tính)

- Vi thăng hoa: Làm tương tự như phản ứng vi thăng hoa ở phần định tính antranoiđ (phản ứng dương tính)

Nhận xét: Dược liệu không chứa coumarin.

- Phản ứng Liebermann: Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết cồn, bốc hơi cách thuỷ đến khô để nguội Thêm 0,5ml anhydrid acetic, lắc mạnh, sau đó thêm từ từ 0,5ml

H2S04 đậm đặc (sử dụng pipet đã sấy khô) theo thành ống nghiệm Không thấy màu tím

đỏ xuất hiện ở mặt tiếp xúc hai chất lỏng (phản ứng âm tính)

- Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm 0,5ml thuốc thử mới pha(gồm 0,5ml dung dịch NaOH 10% và 9,5ml dung dịch acid picric trong nước) không thấy xuất hiện màu đỏ cam (phản ứng âm tính)

- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm 5 giọt dung dịch Natri Nitropprusiat 1% và vài giọt dung dịch NaOH 10%, không có màu đỏ xuất hiện (phản ứng âm tính)

Nhận xét: Dược liệu không có glycosid tim.

3.4.6- Định tính saponin.

Lấy 2g bột dược liệu, cho vào bình nón 100ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc Dịch lọc cho vào một ống nghiệm và lắc ống nghiệm 5 phút dọc theo chiều dọc để yên 15 phút, quan sát hiện tượng tạo bọt Bọt tan sau 5 phút

Nhận xét: Dược liệu không có saponin.

3.4.7- Định tính tanin.

Lấy lg dược liệu cho vào cốc 100ml, cho vào đó 15ml H20 , đun cách thuỷ trong

15 phút Lọc dịch chiết qua giấy lọc thu được dung dịch dùng để định tính các phản ứng sau:

- Phản ứng với FeCl3 5%: Cho lml dịch lọc ở trên vào ống nghiệm, thêm vài giọt FeCl3 5%, không thấy xuất hiện màu xanh đen (phản ứng âm tính)

- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Cho lml dịch lọc ở trên vào một ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1% Quan sát không thấy xuất hiện tủa bông (phản ứng âm tính)

Nhận xét: Dược liệu không có tanin.

3.4.8- Định tính tinh bột.

Nhỏ 1-2 giọt nước cất lên phiến kính nhỏ Dùng mũi mác lấy một ít dược liệu để vào giọt nước và nghiền đều Đậy lam kính lên trên, rồi nhỏ 1-2 giọt dung dịch Iod-

Iodid loãng nhỏ vào cạnh lam kính, dung dịch Iod-Iodid thấm vào trong (hiện tượng

mao dẫn) Soi kính hiển vi thấy các hạt tinh bột bị nhuộm màu xanh

Nhận xét: Dược liệu có tinh bột.

3.4.9- Định tính đường khử tự do.

Lấy lg bột dược liệu cho vào ống nghiệm 20ml Thêm vào đó 10ml nước cất,

đun cách thuỷ 3-5 phút Lọc nóng, lấy dịch lọc thử phản ứng sau:

- Cho 2ml dịch lọc vào một ống nghiệm thêm vào đó 0,5ml thuốc thử Fehling A

và 0,5ml thuốc thử Fehling B Đun sôi cách thuỷ vài phút thấy xuất hiện tủa đỏ gạch

(phản ứng dương tính)

Nhận xét: Dược liệu có đường khử.

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong củ và thân loài bình vôi thu hái ở

Sa Pa được tóm tắt ở bảng 3

22

Bảng 3 Tóm tắt kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu.

lactonPhản ứng diazo hoá

Vi thăng hoa

++

Ghi chú:

+ : Phản ứng dương tính

+++ : Phản ứng lên rõ

++ : Phản ứng lên khá rõ.++++ : Phản ứng lên rất rõ

Kết luận: Trong củ và thân cây bình vôi nghiên cứu (Stephania brachyandra Diets) đều

chứa alcaloid, tinh bột, đường khử tự do Riêng ở củ có thêm antranoid, ở thân có thêm coumarin Trong đó alcaloid là thành phần chính

3.5- Định tính alcaloid bằng SKLM.

- Chuẩn bị bản mỏng:

+ Sử dụng bản mỏng Silicagen GF254 đã tráng sẵn của Merck, hoạt hoá ở

1 1 0° c/lh, để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm

+ Bản mỏng dùng cho sắc ký điều chế: Cân 2,4g Silicagen G (Merck) cho vào cối nghiền mịn, thêm 15ml nước cất Nghiền nhanh, trộn đều, tráng nhanh lên tấm kính 5xl5cm Để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó hoạt hoá ở 110°c/lh, để nguội bảo quẳn trong bình hút ẩm

- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký:

Lấy lg bột dược liệu cần nghiên cứu (thân và củ) chiết như phần định tính rồi cô cách thuỷ đến khô, cắn còn lại để nguội, hoà tan trong methanol Dịch chiết này để chấm sắc ký

- Tiến hành:

Chấm dịch chiết thân và củ dược liệu đã chuẩn bị ở trên lên cùng một bản mỏng

đã hoạt hoá, sau đó triển khai bằng 3 hệ dung môi sau:

Hệ II : Cloroform : Methanol: Amoniac [50:9:1 ]

Hệ III : Toluen : Aceton : Cồn : Amoniac [45:45:7:3]

Phun hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff So sánh sau nhiều lần khai triển sắc

ký với 3 hệ dung môi trên chúng tôi nhận thấy hệ III tách với số lượng và các vết rõràng nhất đối với cả dịch chiết thân và củ

24

Kết quả sắc ký khai triển với hệ dung môi III của dịch chiết sau khi phun thuốc thử Dragendorff được trình bày ở bảng 4 và hình 9.

Bảng 4 Kết quả định tính alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng (với hệ dung môi III)

Nhận xét:

- Kết quả SKLM cho thấy dịch chiết củ có 12 vết, dịch chiết thân có 11 vết, trong đó có 7 vết có R| bằng nhau

- Ở dịch chiết củ vết V2 là đậm nhất, dịch chiết thân vết RT đậm nhất

3.6- Định lượng alcaloid toàn phần.

Cân chính xác khoảng 7,00g dược liệu đã được sấy khô Thấm ẩm bằng amoniac 6N để qua đêm, sau đó cho vào túi bằng giấy lọc rồi đặt vào bình Soxhlet chiết với cloroform đến kiệt alcaloid (thử bằng thuốc thử Mayer) Cất thu hồi dung môi, hoà cắn vào dung dịch acid H2S040,1N 5-7 lần, mỗi lần 10ml Lọc dung dịch qua giấy lọc vào bình gạn Kiềm hoá dịch lọc bằng amoniac 6N đến pH=10-ll Chiết 6 -8 lần bằng cloroform, mỗi lần 10ml đến kiệt alcaloid Tập trung dịch chiết cloroform và rửa bằng nước cất tới pH trung tính Để bốc hơi tự nhiên đến khô Hoà cắn vào một lượng chính xác 20ml dung dịch H2S04 0,1N Định lượng H2S04 dư bằng dung dịch NaOH 0,1N với chỉ thị màu đỏ methyl

Hàm lượng alcaloid toàn phần được tính theo L-tetrahydropalmatin, lml dung địch H2S04 0,1N tương ứng với 0,071g C2ịH2504N

Tỷ lệ phần trăm alcaloid toàn phần (X%) trong củ được tính theo công thức:

(20-V) X 0,071 X 100

x% = - —

-MV: Số ml NaOH 0,1N dùng để trung hoà H2S04 0,1N dư

M: Số gam dược liệu khô tuyệt đối (đã trừ độ ẩm)

Độ ẩm của dược liệu: 11,51%

Tiến hành định lượng 5 lần, kết quả được trình bày ở bảng 5

26

Bảng 5 Hàm lượng alcaloid toàn phần trong thân và củ.

Lần

Hàm lượng alcaloid toàn phần trong thân (%)

Hàm lượng alcaloid toàn phần trong củ (%)

Nhận xét: Hàm lượng alcaloid toàn phần trong củ cao hơn alcaloid toàn phần trong

thân loài nghiên cứu

3.7- Định lượng L-tetrahydropalmatin trong dược liệu.

Định lượng L-tetrahydropalmatin trong thân và củ bình vôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

+ Thuốc thử và thiết bị: Thuốc thử đã được chuẩn hoá theo ISO/IEC 17027 vàGLP

+ Thiết bị đã được hiệu chuẩn theo ISO/IEC 17025

- Máy HPLC 1100 với detector u v nối với máy tính và máy in.

- Máy lắc siêu âm

- Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng.

Dịch chiết cloroform cô trên cách thuỷ đến cạn Hoà tan cắn thu được trong dung dịch acid sulfuric 0,1N (5 lần, mỗi lần khoảng 10ml) Lọc dung dịch qua giấy lọc vào một bình gạn Kiềm hoá dịch lọc bằng dung dịch ammoniac đặc đến pHlO Chiết 4 lần, mỗi lần với 10ml cloroform Tập trung dịch chiết cloroform, bốc hơi trên cách thuỷ tới khô

Hoà tan cắn thu được trong pha động để được dung dịch có nồng độ Rotundin tương đương với nồng độ của dung dịch Rotundin chuẩn, lắc đều Lọc sơ bộ qua giấy lọc thường, bỏ 10ml dịch lọc đầu Dịch lọc sau đó được lọc qua giấy lọc mịn cỡ 0,45 |j.m, thu được dung dịch thử

+ Chuẩn bị mẫu chuẩn:

Pha dung dịch chuẩn có chứa khoảng 0,05mg Rotundin khan trong lml phađộng

28

Độ ẩm dược liệu củ bình vôi theo phương pháp sấy dược liệu ở 100°c tới khối lượng không đổi.

Độ ẩm tuyệt đối dược liệu củ trung bình sau 3 lần là 11,5114%

Độ ẩm tuyệt đối dược liệu thân trung bình sau 3 lần là 10,8721%

Kết quả định lượng Rotundin ở thân và củ loài Stephania brachyandra Diels

tính theo dược liệu khô tuyệt đối được trình bày ở bảng 4

Bảng 6 Kết quả định lượng Rotundin trong thân và củ.

Lần Hàm lượng Rotundin trong thân (%) Hàm lượng Rotundin trong củ (%)

Nhận xét: Hàm lượng Rotundin trong củ Stephania brachyandra Diels cao hơn trong

thân

3.8- Chiết xuất alcaloid toàn phần.

Alcaloid trong dược liệu (thân, củ) loài nghiên cứu được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi cồn 70° đã acid hoá bằng acid tatric 1%

Dược liệu được tán nhỏ đến độ mịn thích hợp, sau đó thấm ẩm bằng cồn 70° đã được acid hoá, để qua đêm Chuyển lượng dược liệu này vào bình ngấm kiệt và tiến

hành ngấm kiệt với dung môi cồn đã acid hoá ở trên tới kiệt alcaloid (thử bằng thuốc thử Mayer), thu được dịch chiết alcaloid trong cồn, cất thu hồi cồn dưới áp suất giảm thu được dịch chiết đậm đặc Kiềm hoá dịch này đến pH 10-11 thu được tủa alcalọid dạng base Chiết alcaloid dạng base bằng dung môi cloroform tới kiệt Cất thu hồi dung môi ta được cắn alcaloid toàn phần.

Quy trình chiết được tóm tắt ở sơ đồ 1

30

Sơ đồ 1 Sơ đồ chiết xuất alcaloid

+ Cho dịch alcaloid đã chuẩn bị vào với một lượng Silicagen (đã hoạt hoá ở

1 1 0°c/lh) vừa đủ rồi đưa hỗn hợp này lên cột

+ Rửa giải bằng hệ dung môi CHCI3: MeOH theo tỉ lệ tăng dần độ phân cực bằng MeOH, hứng vào ống nghiệm nhỏ, mỗi ống khoảng 2ml Sau đó kiểm tra bằng SKLM (dùng cả 3 hệ dung môi chạy SKLM như ở phần định tính alcaloid bằng SKLM)

Dồn dịch rửa giải chứa 1 vết alcaloid cùng R| vào một cốc nhỏ, bốc hơi dung môi thu được cắn, kết tinh lại nhiều lần trong MeOH thu được 1 chất kết tinh

Kết quả: Phân lập được 1 chất ký hiệu V, từ củ và 1 chất ký hiệu Rx từ thân cây.

3.9.2- Phân lập alcaloid bằng phương pháp điều chỉnh pH.

Cắn alcaloid toàn phần ở trên chiết bằng acid HC1 5%, đến pHl tạo tủa alcaloid dạng muối Lọc bằng phễu lọc chân không, lấy tủa riêng, dịch acid riêng

* Dịch acid: Dùng nước cất điều chỉnh dịch acid thu được về pH3, để ở nhiệt độ phòng 36-48h, ta thu được tinh thể hình kim không màu, lọc qua phễu lọc chân không,

32

rửa nhanh tủa vài lần bằng ether ethylic tinh khiết Kết tinh lại tinh thể vài lần trong methanol thu được 1 chất ký hiệu là RL,.

* Tủa alcaloid: dạng muối thu được ở trên sấy nhẹ, hoà trong nước, điều chỉnh tới

pH6 xuất hiện tủa sau đó lọc qua phễu chân không sẽ thu được tủa và dịch lọc

- Hoà tan hoàn toàn tủa trong nước, kiềm hoá bằng NH4OH 6N tới pH 10-11, chiết lấy alcaloid base bằng cloroform Dịch chiết alcaloid trong cloroform để bốc hơi

tự nhiên thu được tủa sau đó, kết tinh nhiều lần trong MeOH thu được một chất có tinh thể hình kim không màu (ký hiệu là Tị)

3.9.3- Phân lập alcaloid bằng SKLM điều chế.

- Tiến hành:

Chấm dịch đã chuẩn bị lên nhiều bản mỏng đã được hoạt hoá

Khai triển các tấm sắc ký bằng hệ dung môi: CHC13: MeOH : NH4OH (50:9:1)

Bản mỏng sau khi để khô ở nhiệt độ phòng đem soi dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng X

=366nm để phát hiện và đánh dấu vết chất cần tách Cạo lấy lớp Silicagen chứa chất cần tách này, phản hấp phụ bằng MeOH, lọc Dịch lọc được bốc hơi tới khô dưới áp suất giảm, thu được cắn, kết tinh lại nhiều lần trong MeOH

- Dịch chiết 1: thu được alcaloid T2

- Dịch chiết 2: thu được alcaloid Pị

3.10- Nhận dạng các alcaloid.

Từ củ bình vôi Stephania brachyandra Diels đã phân lập được 5 chất: Vị, Tị,

T2, Pj và RL] Từ thân cây đã phân lập được 1 alcaloid RT

3.10.1- Kiểm tra độ tinh khiết các alcaloid.

Các alcaloid T2, Tị, RT, Pị, RL|, Vị và đều được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM ở 3

hệ dung môi khác nhau:

Hệ II : Cloroform : Methanol: Amoniac [ 50:9:1 ]

Hệ in : Toluen : Aceton : Cồn : Amoniac [45:45:7:3]

Riêng chất P| được kiểm tra ở 3 hệ dung môi I, II, IV

- Chất T2: dạng tinh thể hình kim, không màu, tan tốt trong CHC13, MeOH

- Tan tốt trong CHCI3, MeOH

- Độ chảy: 140,5°c.

- Phổ tử ngoại (UV) đo trong EtOH cho Ằ.max = 282; 223; 213 nm

- Phổ IR đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở: 3610,7; 3312,5; 3196,7; 2936,4; 2797,6; 1611,0; 1519,9; 1459,1; 1336,8; 1280,1; 1227,3; 1139,9; 1078,9; 1029,0; 864,6 và 784,1 c m 1

34

- Phổ khối (MS) cho pic [M]+: 355 mu tương ứng với công thức phân tử

C21H2504N Đối chiếu với thư viện phổ cho biết chất T2 phù hợp với tetrahydropalmatin

L-Ngoài ra, chúng tôi còn kiểm tra trên SKLM so sánh T2 với tetrahydropalmatin chuẩn ở 3 hệ dung môi khác nhau:

Hệ II : Cloroform : Methanol: Amoniac [ 50:9:1 ]

Hệ III : Toluen : Aceton : Cồn : Amoniac [45:45:7:3 ]

H3CO- H3CO-

Kết luận: Căn cứ vào độ chảy, SKLM so sánh với chất chuẩn, phổ u v , IR và phổ khối,

phổ mô phỏng dựa vào phần mềm MASS PRONTIER (V.1.0), chúng tôi nhận dạng chất T2 là L-tetrahydropalmatin

3.10.2.2- Nhận dạng chất Tj.

- Chất Tị ở dạng tinh thể hình kim không màu.

- Tan tốt trong MeOH, CHC13