Định lượng L-tetrahydropalmatin trong thân và củ bình vôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
+ Thuốc thử và thiết bị: Thuốc thử đã được chuẩn hoá theo ISO/IEC 17027 và GLP.
+ Thiết bị đã được hiệu chuẩn theo ISO/IEC 17025.
- Máy HPLC 1100 với detector u v nối với máy tính và máy in. - Máy lắc siêu âm.
- Bộ chiết Soxhlet 100ml. - Nồi cách thuỷ.
- Dụng cụ thuỷ tinh chính xác các loại. + Điều kiện sắc ký:
- Cột: RP-18 (250 X 4mm ; 5|im). - Tốc độ dòng: lml/phút.
- Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng. - Thể tích tiêm: 20|J,1. + Pha động. Hỗn hợp gồm : - Dung dịch KH2P 04 0,05 M: 63ml - Acetonitril: 37,5ml - Triethylamin: 0,5ml
Dùng dung dịch acid phosphoric đặc để điều chỉnh pH đến 4,0. Lọc qua màng lọc mịn cỡ 0,45 ịim, lắc siêu âm trong 5 phút để loại bọt khí.
+ Chuẩn bị mẫu thử:
- Tán nhỏ dược liệu khô và rây qua rây cỡ 0,4mm. Xác định độ ẩm của bột dược liệu bằng phương pháp sấy ở 1 0 0°c đến khối lượng không đổi.
- Cân chính xác khoảng 0,4g bột mịn dược liệu chuyển vào túi giấy lọc. Làm ẩm khối bột mịn bằng 0,5ml dung dịch amoniac 6N (TT), để yên trong 30 phút. Cho túi giấy lọc này vào trong dụng cụ chiết nóng Soxhlet cỡ 100ml. Dùng 30ml cloroform (TT) để chiết alcaloid và chiết đến kiệt alcaloid (khoảng 4 giờ).
Dịch chiết cloroform cô trên cách thuỷ đến cạn. Hoà tan cắn thu được trong dung dịch acid sulfuric 0,1N (5 lần, mỗi lần khoảng 10ml). Lọc dung dịch qua giấy lọc vào một bình gạn. Kiềm hoá dịch lọc bằng dung dịch ammoniac đặc đến pHlO. Chiết 4 lần, mỗi lần với 10ml cloroform. Tập trung dịch chiết cloroform, bốc hơi trên cách thuỷ tới khô.
Hoà tan cắn thu được trong pha động để được dung dịch có nồng độ Rotundin tương đương với nồng độ của dung dịch Rotundin chuẩn, lắc đều. Lọc sơ bộ qua giấy lọc thường, bỏ 10ml dịch lọc đầu. Dịch lọc sau đó được lọc qua giấy lọc mịn cỡ 0,45 |j.m, thu được dung dịch thử.
+ Chuẩn bị mẫu chuẩn:
Pha dung dịch chuẩn có chứa khoảng 0,05mg Rotundin khan trong lml pha động.
Độ ẩm dược liệu củ bình vôi theo phương pháp sấy dược liệu ở 100°c tới khối lượng không đổi.
Độ ẩm tuyệt đối dược liệu củ trung bình sau 3 lần là 11,5114%. Độ ẩm tuyệt đối dược liệu thân trung bình sau 3 lần là 10,8721%.
Kết quả định lượng Rotundin ở thân và củ loài Stephania brachyandra Diels
tính theo dược liệu khô tuyệt đối được trình bày ở bảng 4.
Bảng 6. Kết quả định lượng Rotundin trong thân và củ.
Lần Hàm lượng Rotundin trong thân (%) Hàm lượng Rotundin trong củ (%)
1 0,7051 3,7144 2 0,6982 3,7808 3 0,6719 3,6943 4 0,6733 3,6086 5 0,6718 3,6996 Trung bình 0,6841 3,6995 s 0,0170 0,0710 RSD 2,5339 1,9191
Thời gian lưu của L-tetrahydropalmatin trong củ là 3,68 phút, ở thân là 3,65 phút. Hệ số dung lượng k =1,12; Số đĩa lý thuyết N=5390; Hệ số bất đối của pic T=l,14.
Nhận xét: Hàm lượng Rotundin trong củ Stephania brachyandra Diels cao hơn trong thân.
