Cắn alcaloid toàn phần ở trên chiết bằng acid HC1 5%, đến pHl tạo tủa alcaloid dạng muối. Lọc bằng phễu lọc chân không, lấy tủa riêng, dịch acid riêng.
* Dịch acid: Dùng nước cất điều chỉnh dịch acid thu được về pH3, để ở nhiệt độ phòng 36-48h, ta thu được tinh thể hình kim không màu, lọc qua phễu lọc chân không,
rửa nhanh tủa vài lần bằng ether ethylic tinh khiết. Kết tinh lại tinh thể vài lần trong methanol thu được 1 chất ký hiệu là RL,.
* Tủa alcaloid: dạng muối thu được ở trên sấy nhẹ, hoà trong nước, điều chỉnh tới pH6 xuất hiện tủa sau đó lọc qua phễu chân không sẽ thu được tủa và dịch lọc.
- Hoà tan hoàn toàn tủa trong nước, kiềm hoá bằng NH4OH 6N tới pH 10-11, chiết lấy alcaloid base bằng cloroform. Dịch chiết alcaloid trong cloroform để bốc hơi tự nhiên thu được tủa sau đó, kết tinh nhiều lần trong MeOH thu được một chất có tinh thể hình kim không màu (ký hiệu là Tị).
3.9.3- Phân lập alcaloid bằng SKLM điều chế.
- Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng có kích thước 20 X 20 cm đã tráng chất hấp phụ là Silicagen GF254+366 dầy khoảng lmm, được hoạt hoá ở 1 10°c/lh.
- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký:
+ Dịch lọc alcaloid pH6 ở trên lắc với cloroform rồi cô thành dịch đậm đặc (dịch chiết 1).
+ Dịch alcaloid pH6 còn lại sau khi lắc với cloroform ở trên kiềm hoá bằng dung dịch NH4OH 6N đến pH 10-11, chiết nhiều lần với cloroform ta thu được hỗn hợp alcaloid base trong CHCI3, cồ đặc dịch chiết dùng chấm sắc ký (dịch chiết 2).
- Tiến hành:
Chấm dịch đã chuẩn bị lên nhiều bản mỏng đã được hoạt hoá.
Khai triển các tấm sắc ký bằng hệ dung môi: CHC13: MeOH : NH4OH (50:9:1). Bản mỏng sau khi để khô ở nhiệt độ phòng đem soi dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng X
=366nm để phát hiện và đánh dấu vết chất cần tách. Cạo lấy lớp Silicagen chứa chất cần tách này, phản hấp phụ bằng MeOH, lọc. Dịch lọc được bốc hơi tới khô dưới áp suất giảm, thu được cắn, kết tinh lại nhiều lần trong MeOH.
- Dịch chiết 1: thu được alcaloid T2 - Dịch chiết 2: thu được alcaloid Pị.
3.10- Nhận dạng các alcaloid.
Từ củ bình vôi Stephania brachyandra Diels đã phân lập được 5 chất: Vị, Tị, T2, Pj và RL]. Từ thân cây đã phân lập được 1 alcaloid RT
3.10.1- Kiểm tra độ tinh khiết các alcaloid.
Các alcaloid T2, Tị, RT, Pị, RL|, Vị và đều được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM ở 3 hệ dung môi khác nhau:
Hệ I : Cloroform : Methanol [ 9:1 ]
Hệ II : Cloroform : Methanol: Amoniac [ 50:9:1 ] Hệ in : Toluen : Aceton : Cồn : Amoniac [45:45:7:3] Riêng chất P| được kiểm tra ở 3 hệ dung môi I, II, IV.
Hệ IV : Cloroform : Methanol [1:1]
Kết quả: Tất cả các chất đều xuất hiện 1 vết ở các hệ dung môi khác nhau, chứng tỏ các chất đã sạch, có thể tiến hành đo phổ.
3.10.2- Nhận dạng các chất T2, Tj, Rx, Pị, RLj và V j. 3.10.2.1- Nhận dạng chất T2:
- Chất T2: dạng tinh thể hình kim, không màu, tan tốt trong CHC13, MeOH. - Tan tốt trong CHCI3, MeOH.
- Độ chảy: 140,5°c.
- Phổ tử ngoại (UV) đo trong EtOH cho Ằ.max = 282; 223; 213 nm.
- Phổ IR đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở: 3610,7; 3312,5; 3196,7; 2936,4; 2797,6; 1611,0; 1519,9; 1459,1; 1336,8; 1280,1; 1227,3; 1139,9; 1078,9; 1029,0; 864,6 và 784,1 c m 1.
- Phổ khối (MS) cho pic [M]+: 355 mu tương ứng với công thức phân tử C21H2504N. Đối chiếu với thư viện phổ cho biết chất T2 phù hợp với L- tetrahydropalmatin.
Ngoài ra, chúng tôi còn kiểm tra trên SKLM so sánh T2 với L- tetrahydropalmatin chuẩn ở 3 hệ dung môi khác nhau:
Hệ I Cloroform : Methanol [9:1]
Hệ II : Cloroform : Methanol: Amoniac [ 50:9:1 ] Hệ III : Toluen : Aceton : Cồn : Amoniac [45:45:7:3 ]
H3CO- H3CO-
■o c h3
-o c h3
L- Tetrahydropalmatin
Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ vết chất T2 luôn cùng R, với L-tetrahydropalmatin chuẩn.
Kết luận: Căn cứ vào độ chảy, SKLM so sánh với chất chuẩn, phổ u v , IR và phổ khối, phổ mô phỏng dựa vào phần mềm MASS PRONTIER (V.1.0), chúng tôi nhận dạng chất T2 là L-tetrahydropalmatin.
3.10.2.2- Nhận dạng chất Tj.
- Chất Tị ở dạng tinh thể hình kim không màu. - Tan tốt trong MeOH, CHC13.
m
-Độ chảy: 116-118°c.
- Phổ u v đo trong EtOH cho 282,2; 225,5 và 211,1 nm.
- Phổ IR đo trong KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở: 3610,6; 3314,5; 2936,0; 1611,5; 1513,6; 1459,3; 1336,7; 1280,2; 1258,2; 1227,5; 1139,7; 1104,1; 1029,1; 865,1 và 784,5 cm'1.
- Phổ khối (MS) cho pic [M]+ = 355 mu tương ứng với công thức phân tử C21H25O4N.
- Đối chiếu thư viện phổ cho biết chất Tị tương ứng với cấu trúc Norcoralydin.
Kết luận: Căn cứ vào độ chảy, phổ u v , IR, phổ khối, đối chiếu với thư viện phổ và phổ mô phỏng MASS PRONTIER (V.1.0), chúng tôi sơ bộ nhận dạng chất Tị là Norcoralydin. Công thức hóa học: H3CO o c h3 o c h3 Norcoralydin 3.10.2.3- Nhận dạng chất RT:
- Chất Rt dạng hình kim không màu. -Đ ộ chảy: 141,5°c.
I
- Phổ tử ngoại (UV) đo trong MeOH cho Ầmax: 282,2; 225,5 và 206,6 nm.
- Phổ hồng ngoại (IR) đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở: 3610,4; 3314,9; 3197,0; 3000,6;2799,1; 2751,7; 1610,8; 1514,4; 1459,9; 1385,5; 1335,9; 1280,1; 1208,2; 1139,6; 1104,5; 1079,3; 1028,5; 1004,6; 955,1; 864,5; 810,6 và 785,0 cm'1.
- Phổ khối (MS) cho pic [M]+ = 355 mu tương ứng với công thức phân tử c21h25o4n .
Đối chiếu với thư viện phổ cho thấy chất RT phù hợp với L-tetrahydropalmatin.. So sánh với L-tetrrahydropalmatin chuẩn trên SKLM, khai triển 3 tấm sắc ký ở 3 hệ dung môi khác nhau cho thấy vết Rx trên sắc ký đồ luôn phù hợp với L-tetrahydropalmatin chuẩn.
Kết luận: Dựa vào độ chảy, phổ u v , phổ IR, phổ khối, SKLM so sánh với chất chuẩn, chúng tôi nhận dạng chất RT là L-tetrahydropalmatin.
Pi Pl+Pc Pc Pi Px+Pc Pc P1 P1+Pc pc
Hệ I Hệ IV Hệ II
Hình 7. Đối chiếu SKLM chất P[ với Palmatin chuẩn. Pf. chất Pi Pc: Palmatin chuẩn. Pi+Pc: vết chấm chồng chất Pị và pc ị ế ■ ■ • : T2 R.+T2 Rc T2 Rc+T2 Rc T2 Rc+T2 R, c T Hệ I Hẹn H ệm Hệin
Hình 8. Đối chiếu SKLM chất Pj với Palmatin chuẩn.
P^chấtP! Hình 9
Pc: Palmatin chuẩn.
P!+Pc: vết chấm chồng chất Pj và Pc
3.10.2.4- Nhận dạng chất Pj.
- Chất Pị ở dạng tinh thể hình kim màu vàng.
- Độ chảy: 237°c
- Dự kiến V! có thể là Palmatin do đó chúng tôi tiến hành SKLM so sánh với Palmatin chuẩn tiến 3 hệ dung môi khác nhau.
- Phổ u v đo trong MeOH cho Ằmax: 431,1; 347,5; 271,1; 225,5 và 203,3 nm. - Phổ hồng ngoại (IR): đo trong KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở 2924,1; 2358,8; 1731,4; 1462,6; 1376,7; 1271,0; 1121,8 và 1071,3 em '.
- Phổ khối (MS) cho pic [M]+ = 352 mu tương ứng với công thức phân tử C2|H2204N. So với thư viện phổ cho they chất Pị phù hợp với Palmatin.
Kết luận: Căn cứ vào độ chảy, SKLM so sánh với Palmatin chuẩn chạy ở 3 hệ dung môi khác nhau, phổ u v , phổ IR, phổ MS, chúng tôi nhận dạng chất P| là Palmatin.
3.10.2.5- Sơ bộ nhận dạng chất Vj.
- Chất V) ở dạng tinh thể hình kim màu vàng. - Tan tốt trong CHC13, MeOH.
I
- Phổ IR đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở: 2921,9; 1610,0; 1510,5; 1344,9; 1272,2; 1213,8; 1156,6; 1010,6; 801,5; 740,1 và 603,7 cm'1.
- Phổ [M]+ = 352 mu, tương ứng với công thức C24H22NO4.
Tra thư viện phổ không có chất này. Để xác định cấu trúc chất V|, chúng tôi đang đo tiếp phổ ‘H-NMR và 13N,MR.
3.10.2.6- Sơ bộ nhận dạng chất RLj.
Chất RL mới phân lập được một lượng rất ít, chúng tôi mới đo được phổ u v và IR. Kết quả:
- Phổ UV- đo trong EtOH cho A,max:282,2; 226,6; 207,7 nm.
- Phổ IR đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở: 2935,4; 2836,0; 2306,8; 1610,1; 1516,0; 1458,6; 1350,4; 1277,8; 1226,4; 1128,6; 1091,5; 988,5; 859,5 và 799,9 c m 1.
Chất RL, cần phân lập tiếp để có đủ lượng chất đo các phổ, xác định cấu trúc hóa học.
3.11- Thử độc tính cấp dịch ép củ tươi.
- Mẫu thử: Xay dược liệu thành bột nhuyễn, ép và vắt kiệt lấy dịch, mỗi ml dịch ép tương đương khoảng 2,7g dược liệu tươi. Pha loãng dịch ép để được các mẫu thử như
Dịch A: dịch ép pha loãng 10 lần với nước. Dịch B: dịch ép pha loãng 5 lần với nước. Dịch C: dịch ép pha loãng 2 lần với nước. Dịch D: dịch ép nguyên thể, không pha loãng. - Tiến hành:
Chuột được nhịn ăn 15 giờ trước khi thí nghiệm, nước uống bình thường. Cho chuột uống bằng kim cong đầu tù, đưa dịch thử vào thẳng dạ dày chuột. Thăm dò các liều gây độc trên động vật thí nghiệm. Dựa trên kết quả thăm dò, thí nghiệm tiến hành
trên 70 chuột, chia làm 7 nhóm, một nhóm chứng dùng nước cất và 6 nhóm thử, mỗi nhóm cho dùng một mức liều, uống 1 hoặc 2-3 lần cách nhau 3 giờ. Theo dõi chuột 72 giờ sau khi cho uống thuốc.
Bố trí thí nghiệm và kết quả thu được ghi trên bảng 7.
Bảng 7: Kết quả thử độc tính cấp dịch ép củ tươi.
Nhóm Thể tích cho chuột uống
(ml/ 1 0 g chuột)
Lượng dược liệu tương đương (g/kg chuột) Số chuôt thí ' nghiệm Số chuột chết 1 0 , 2 0 ml nước cất (nhóm chứng) 10 0 2 0,20 ml dịch A 5,4 g 1 0 0 3 0,20 ml dịch B 1 0,8g 10 0 4 0,20 ml dịch c 27,Og 1 0 0 5 0,20 ml dịch D X 1 lần 54,Og 1 0 0 6 0,20 ml dịch D X 2 lần 108,Og 1 0 0 7 0,20 ml dịch D X 3 lần 162,0g 1 0 0 Nhận xét:
- Sau khi uống nước cất: Chuột ở nhóm 1 (nhóm chứng) hoạt động và ăn uống bình thường.
- Sau khi uống mẫu thử: Chuột ở hầu hết các nhóm thử đều có biểu hiện giảm hoạt động sau đó ngủ. Thời gian ngủ tuỳ thuộc vào mức liều dùng.
-Nhóm 2 (uống dịch ép pha loãng 10 lần với nước cất): giảm hoạt động, sau đó ngủ lơ mơ; dễ tỉnh khi có tiếng động. Sau khoảng lgiờ 30 phút, tất cả chuột đều hoạt động, ăn uống bình thường.
- Nhóm 3-4: chuột ngủ sau khoảng 5-7 phút. Chuột ngủ êm dịu, thời gian kéo dài khoảng 3-4 giờ. Chuột có thể tỉnh khi có tiếng động hoặc bị quấy rầy. Sau khi tỉnh, chuột hoạt động, ăn uống bình thường.
- Chuột ở các nhóm 5, 6, 7: Uống dịch ép nguyên (không pha loãng). Hầu hết chuột giảm hoạt động và ngủ rất nhanh sau khoảng 3-5 phút sau khi uống. Chuột ngủ say, hầu như không tỉnh khi có tiếng động hoặc bị quấy rầy. Chuột nhóm 5 (uống 1 lần dịch ép) ngủ tương đối êm dịu, thở đều. Giấc ngủ kéo dài khoảng 8 giờ. Sau 24 giờ,
chuột hoạt động , ăn uống bình thường. Chuột nhóm 6, 7: Sau khi uống lần 2, 3, hầu hết chuột ở tình trạng mệt mỏi, thở yếu, lông xù. Sau khi uống lần 3, chuột nhóm 7 quá mệt, toàn thân mềm, cơ giãn. Sau 24 giờ, chuột đều tỉnh, hoạt động và ăn uống nhưng một số còn mệt, lông hơi xù. Sau 48 giờ, tất cả chuột hoạt động trở lại bình thường. Không có chuột nào chết trong thời gian theo dõi.
Kết luận:
Thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng cho uống một hoặc vài lần trong ngày dịch ép từ thân củ tươi với các mức liều tính tương đương theo dược liệu tươi từ 5,4g/kg tới mức liều cao nhất có thể đưa vào dạ dày chuột là 162g/kg cho thấy hầu hết chuột đều có biểu hiện giảm hoạt động sau đó ngủ. Thời gian ngủ tuỳ thuộc vào mức liều đã dùng. Ở các nhóm uống liều cao, chuột ngủ trong tình trạng mệt m ỏ i, xù lông, cơ giãn. Sau 48 giờ, tất cả chuột đều trở lại hoạt động, ăn uống bình thường, không có chuột nào chết trong thời gian theo dõi.
3.12- Khảo sát sơ bộ khả năng nhân giống.
Chúng tôi đã thử nghiệm nhân giống bằng biện pháp giâm cành nhưng thấy tỷ lệ hom nảy chồi rất thấp do đó không tiến hành tiếp mà chỉ khảo sát nhân giống bằng củ.
3.12.1- Nhân giống bằng mảnh củ.
Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 8.
Bảng 8. Khả năng nảy chồi của các hom giống lấy từ các mảnh củ.
STT Số mảnh thí nghiệm
Tỷ lệ sống của mảnh chóp củ (%)
Tỷ lệ sống của các mảnh ở phần đáy hoặc cạnh của củ (%)
Trung bình Min- Max Trung bình Min - Max
1 25 76 59-85 16 7-32
Nhận xét: Mảnh củ nhân giống chồi tuy sinh trưởng bình thường nhưng thời gian tạo thành rễ củ rất lâu. Mảnh củ nhân giống tăng trưởng không đáng kể. Đây chỉ là một biện pháp giữ giống, khó ứng dụng trong quy mô trồng thu hoạch củ.
3.12.2- Nhân giông bằng củ nguyên vẹn.
Củ loài Stephania brachyandra Diels mang mẫu Sa Pa về trồng và theo dõi tại Hà Nội, kết quả cho thấy củ phát triển khá nhanh và dễ dàng, nhất là vào đầu hạ. Mẫu nghiên cứu hiện tại phát triển rất tốt, đã ra hoa, cần được tiếp tục theo dõi.
3.12.3- Nhân giống bằng hạt.
Thu hái quả chín của loài này, tách bỏ thịt quả, đãi sạch và xử lý hạt trước khi gieo. Kết quả:
Gieo ngay sau khi thu hái: Trung bình 50 ngày mới nảy mầm (tối thiểu 40 ngày, tối đa 65 ngày). Tỷ lệ nảy mầm cao nhất trung bình 84,6% (tối thiểu 75%, tối đa tới
100%).
Bảo quản hạt trong cát ẩm (70-75% độ ẩm): Trung bình 34 ngày nảy mầm sau gieo hạt (tối thiểu30 ngày, tối đa 45 ngày). Như vậy trong điều kiện bảo quản thích hợp, thời gian nảy mầm của hạt vẫn chậm hơn nhiều so gieo hạt tươi ngay sau khi thu hái. Tỷ lệ nảy mầm khá cao, trung bình đạt 78,2%, tối đa tới 100% nhưng tối thiểu chỉ có 50%.
Bảo quản ở điều kiện nhiệt độ và độ ẩm bình thường trong phòng: Thời gian nảy mầm còn chậm hơn rất nhiều, trung bình 124 ngày sau gieo hạt (tối thiểu 93 ngày, tối đa 135 ngày). Tỷ lệ nảy mầm giảm xuống nhanh chóng, trung bình chỉ đạt 38,2%, tối đa mới có 49,5%, tối thiểu 30%.
Như vậy hạt sau thu hái về nên xử lý và gieo ngay.
Kết luận: Qua khảo sát theo dõi 3 phương pháp trong quá trình làm thực nghiệm khoa học trong hơn 2 năm, chúng tôi sơ bộ rút ra kết luận sau:
- Nhân giống bằng hạt là phương pháp hiệu quả, có thể nhân giống trong thời gian ngắn. Do đó có thể áp dụng trong sản xuất tạo ra giống phục vụ cho trồng trọt.
- Việc nhân giống bằng củ hoặc mảnh củ theo chúng tôi chỉ là biện pháp cần thiết để giữ giống.
PHẦN 4- KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
4.1- Kết luận.
Sau thời gian làm thực nghiệm khoa học từ năm thứ 3 và thời gian làm khoá luận tốt nghiệp về cây bình vôi thu hái ở Sa Pa chúng tôi đã thu được một số kết quả: - Về th ự c vật:
- Đã thu hái mẫu cây có hoa, quả, hạt, mô tả đặc điểm thực v ậ t, đặc biệt lần đầu tiên đã mô tả chi tiết cấu tạo hoa đực loài bình vôi nghiên cún. Đối chiếu với cầc tài liệu phân loại và cử nhân Nguyễn Chiều đã định tên khoa học là:
Stephanỉa brachyandra Diels - Menispermaceae
- Đã xác định đặc điểm vi phẫu cuống lá, gân lá, phiến lá, thân và đặc điểm bột thân, bột củ góp phần tiêu chuẩn hoá dược liệu.
- Vê hoá học:
- Đã định tính xác định trong củ loài Stephania brachyandra Dỉels ở Sa Pa có alcaloid, anthranoid, tinh bột, đường khử tự do, trong thân có alcaloid, coumarin, tinh bột, đường khử tự do. Trong củ và thân alcaloid đều là thành phần chính.
- Bằng SKLM với hệ dung môi thích hợp đã phát hiện có 12 alcaloid trong củ, 11 alcaloid trong thân, trong đó có 7 alcaloid có Rf giống nhau.