NGHIÊN cứu đặc điểm THỰC vật và THÀNH PHẦN hóa học THEO ĐỊNH HƯỚNG tác DỤNG CHỐNG OXY hóa của cây “HỒNG RỪNG” THU hái tại SAPA, lào CAI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VĂN THÙY LINH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY “HỒNG RỪNG” THU HÁI TẠI SAPA, LÀO CAI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VĂN THÙY LINH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY “HỒNG RỪNG” THU HÁI TẠI SAPA, LÀO CAI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực hồn thành luận văn này, em nhận nhiều quan tâm, động viên giúp đỡ tận tình từ thầy cơ, gia đình bạn bè Nhân dịp này, em xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển Thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành luận văn Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: PGS TS Trần Thế Bách, TS Nguyễn Văn Tài hỗ trợ cho em nhiều trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, bạn anh chị môn Dược học cổ truyền, môn Thực vật - Trường đại học Dược Hà Nội, mơn Hóa thực vật I, môn Dược lý - Viện Dược Liệu, Viện sinh thái tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, Trạm kiểm lâm Núi xẻ - Sapa, Vườn quốc gia Hoàng Liên hỗ trợ em suốt trình nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, tồn thể thầy giáo, cán Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện để em lĩnh hội kiến thức quý giá ngành Dược thời gian qua Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, người thân ln sát cánh, động viên em hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2019 Học viên Văn Thùy Linh DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt C-NMR 13 Tên đầy đủ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 H-NMR ALAT ASAT BuOH CAT CC D DPPH ESI-MS (Carbon (13) Nuclear magnetic resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Alanin aminotransferase Aspartat aminotransferase Butanol Catalase Sắc ký cột (Column chromatography) Diospyros 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Phổ khối lượng ion hóa tia điện EtOAc EtOH GSH GSH - Px IC50 IR LOP MBC MDA MIC MS NMR ROS/RNS/RC (Electrospray ionization mass spectrometry) Ethyl acetat Ethanol Glutathion Glutathion peroxidase Nồng độ ức chế 50% Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) Lipid Oxidation Product Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu Malondialdehyd Nồng độ ức chế tối thiểu Phổ khối (Mass Spectrometry) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) Reactive oxygen species/Reactive nitrogen species/Reactive N UV-VIS chlorine species Phổ tử ngoại DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt CK EDTA HDL LDL MCF-7 NBT SKLM Tên đầy đủ Creatin-kinase Ethylenediaminetetraacetic acid High-density lipoprotein Low-density lipoprotein Michigan Cancer Foundation-7 Nitro blue tetrazolium Sắc ký lớp mỏng SOD TBA TCA TG Superoxide dismutase Tert-butyl alcohol Trichloroacetic acid Triglycerid MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN CHI DIOSPYROS L 1.1.1 Vị trí phân loại chi Diospyros L 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố .3 1.1.3 Một số loài thuộc chi Diospyros L 1.1.4 Tác dụng sinh học .10 1.1.5 Tổng quan “Hồng rừng” 12 1.2 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA .13 1.2.1 Gốc tự 13 1.2.2 Chất chống oxy hóa 14 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 15 2.1.2 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 15 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.2.1 Giám định tên khoa học đặc điểm thực vật nghiên cứu 16 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 17 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu - đánh giá kết 23 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 3.1 VỀ THỰC VẬT 24 3.1.1 Đặc điểm thực vật .24 3.1.2 Giám định tên khoa học 26 3.1.3 Đặc điểm vi phẫu thân “Hồng rừng” 26 3.1.4 Đặc điểm phần bột thân “Hồng rừng” 29 3.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CAO CÁC PHÂN ĐOẠN 31 3.2.1 Định tính sơ số nhóm chất hữu “Hồng rừng” 31 3.2.2 Chiết xuất 36 3.2.3 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro cao phân đoạn dịch chiết phương pháp dọn gốc tự do: .38 3.3 PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA MỘT SỐ CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ĐÃ LỰA CHỌN .41 3.3.1 Phân lập 41 3.3.2 Xác định cấu trúc 46 3.3.3 Thử tác dụng chống oxy hóa chất phân lập phương pháp dọn gốc tự 51 Chương BÀN LUẬN 55 4.1 VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 55 4.1.1 Đặc điểm hình thái giám định tên khoa học lồi nghiên cứu 55 4.1.2 Đặc điểm vi học loài nghiên cứu 56 4.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CAO CÁC PHÂN ĐOẠN 56 4.2.1 Định tính sơ số nhóm chất hữu 56 4.2.2 Chiết xuất 56 4.2.3 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro cao phân đoạn dịch chiết phương pháp dọn gốc tự 57 4.3 PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA IN VITRO CỦA MỘT SỐ CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ĐÃ LỰA CHỌN 58 4.3.1 Phân lập, xác định cấu trúc .58 4.3.2 Thử tác dụng chống oxy hóa chất phân lập phương pháp dọn gốc tự 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 KIẾN NGHỊ .64 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học số thuộc chi Diospyros L .5 Bảng 2.1 Hỗn hợp phản ứng 20 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất hữu phương pháp hóa học .34 Bảng 3.2 Khối lượng cao phân đoạn từ dịch chiết ethanol “Hồng rừng” .38 Bảng 3.3 Khả dọn gốc DPPH cao chiết phân đoạn từ “Hồng rừng” .38 Bảng 3.4 Giá trị IC50 mẫu thử mơ hình dọn gốc DPPH 39 Bảng 3.5 Khả dọn gốc Superoxide cao chiết “Hồng rừng” 39 Bảng 3.6 Hoạt tính dọn gốc Superoxide Quercetin 40 Bảng 3.7 Giá trị IC50 mẫu thử mơ hình dọn gốc tự Superoxide .40 Bảng 3.6 Khả dọn gốc DPPH chất chiết phân đoạn từ “Hồng rừng” 52 Bảng 3.7 Khả dọn gốc DPPH Quercetin 52 Bảng 3.8 Khả dọn gốc Superoxide chất phân lập 53 Bảng 3.9 Hoạt tính dọn gốc Superoxide Quercetin 53 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn 18 Hình 3.1 Đặc điểm quan sinh dưỡng “Hồng rừng” 25 Hình 3.2 Đặc điểm hoa lưỡng tính “Hồng rừng” 25 Hình 3.3 Đặc điểm hoa đực Hồng rừng 26 Hình 3.4 Đặc điểm hạt “hồng rừng” 26 Hình 3.5 Vi phẫu thân “Hồng rừng” 27 Hình 3.6 Vi phẫu “Hồng rừng”, phần gân .28 Hình 3.7 Vi phẫu “Hồng rừng”, phần phiến 29 Hình 3.8 Ảnh bột thân “Hồng rừng” .30 Hình 3.9 Ảnh bột “Hồng rừng” 31 Hình 3.10 Sắc ký đồ cao toàn phần với hệ II điều kiện quan sát 35 Hình 3.11 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn từ loài .37 Hình 3.12 Sắc ký đồ cao EtOAc với hệ V điều kiện quan sát 42 Hình 3.13 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao EtOAc 44 Hình 3.14 Sơ đồ phân lập chất từ cao phân đoạn EtOAc 45 Hình 3.15 Cấu trúc hóa học Quercetin 46 Hình 3.16 Cấu trúc hóa học Quercetrin 47 Hình 3.17 Cấu trúc hóa học 4’-O-methyl myricetin 48 Hình 3.18 Cấu trúc hóa học 3-O-β-arabinofuranoside-4’-O-methoxy myricetin 50 ĐẶT VẤN ĐỀ Nước ta nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có điều kiện tự nhiên thuận lợi cỏ phát triển đa dạng phong phú Ở Việt Nam, việc sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược có từ lâu đời, thuốc có nguồn gốc tự nhiên thường có ưu điểm độc tính thấp vừa có giá trị điều trị bệnh, vừa có giá trị bồi dưỡng, phục hồi sức khỏe, tăng khả phòng trừ bệnh Trên giới, nhà khoa học trọng vào việc sàng lọc từ thiên nhiên để tìm hoạt chất sinh học có dược tính mạnh hơn, độc Và nay, xu chung toàn cầu dùng loại thuốc có nguồn gốc thảo dược, thành phần từ tự nhiên để đảm bảo tính an tồn Năm 1954, bác sỹ Denham Harman người nhận hữu gốc tự thể với nguy gây tổn thương tế bào Gốc tự có vai trò phân hủy, tổng hợp hóa học thơng qua bẻ gãy liên kết để tạo liên kết mới, làm sai lệch cấu trúc làm rối loạn thông tin phân tử sinh học, vật chất di truyền tế bào Đây nguyên nhân gây nhiều bệnh lý: viêm, xơ vữa động mạch, thối hóa hệ thần kinh, lão hóa quan phủ tạng… Chi Diospyros L thuộc họ Thị (Ebenaceae) chi lớn giới có 500 lồi, phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới, đa dạng khu vực Đơng Nam Á, có số loại thuộc Tây Á, Nhật Bản Đông Nam nước Mỹ [12] Ở Việt Nam thống kê 70 loài [5], có số lồi thuộc chi Diospyros L nghiên cứu giới với tác dụng chống oxy hóa, điều trị ung thư, tăng cholesterol máu, hạ huyết áp, chống viêm, giảm đau… Cây “Hồng rừng” thuộc chi Diospyros L tồn phát triển tự nhiên địa bàn Lào Cai Lá “hồng rừng” vị thuốc nam quý người dân địa phương sử dụng theo kinh nghiệm với mục đích điều trị bệnh gan như: lọc gan, hạ men gan, giải độc gan rượu bia, Với lợi khí hậu, thổ nhưỡng, tri thức địa đồng bào dân tộc thiểu số thuốc, việc sử dụng rộng rãi dược liệu quý có giá trị kinh tế tam thất, đương quy, atisô,… “Hồng rừng” sử dụng làm thuốc thời gian gần địa bàn tỉnh Lào Cai Phụ lục 3.5 Phổ 1H-NMR hợp chất A5Đ4F8 (Quercetrin) Phụ lục 3.6 Phổ 13C-NMR hợp chất A5Đ4F8 (Quercetrin) Phụ lục 3.7 Phổ DEPT hợp chất A5Đ4F8 (Quercetrin) Phụ lục 3.8 Phổ ESI-MS (-) hợp chất A5Đ4F8 (Quercetrin) Phụ lục 3.9 Phổ ESI-MS (+) hợp chất A5Đ4F8 (Quercetrin) Phụ lục 3.10 Phổ 1H-NMR hợp chất C6N3I4Đ4,5F5,6 (1A2A) Phụ lục 3.11 Phổ 13C-NMR hợp chất C6N3I4Đ4,5F5,6 (1A2A) Phụ lục 3.12 Phổ HSQC hợp chất C6N3I4Đ4,5F5,6 (1A2A) Phụ lục 3.13 Phổ HMBC hợp chất C6N3I4Đ4,5F5,6 (1A2A) Phụ lục 3.14 Phổ ESI-MS (-) hợp chất C6N3I4Đ4,5F5,6 (1A2A) Phụ lục 3.15 Phổ ESI-MS (+) hợp chất C6N3I4Đ4,5F5,6 (1A2A) Phụ lục 3.16 Phổ 1H-NMR hợp chất Đ3F5,6 (Mearnsetin) Phụ lục 3.17 Phổ 13C-NMR hợp chất Đ3F5,6 (Mearnsetin) Phụ lục 3.18 Phổ ESI-MS (-) hợp chất Đ3F5,6 (Mearnsetin) Phụ lục 3.19 Phổ ESI-MS (+) hợp chất Đ3F5,6 (Mearnsetin) ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VĂN THÙY LINH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY “HỒNG RỪNG” THU HÁI TẠI SAPA, LÀO... Sapa, Lào Cai với mục tiêu sau: Mô tả đặc điểm thực vật, vi học giám định tên khoa học “Hồng rừng” thu hái Sapa, Lào Cai Nghiên cứu thành phần hóa học, chiết xuất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa. .. khoa học cho việc nâng cao giá trị sử dụng thu c có nguồn gốc từ thảo dược chọn đề tài: Nghiên cứu đặc điểm vật thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa “Hồng rừng” thu hái Sapa,