NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN hóa học và một số tác DỤNG SINH học của cây bù dẻ tía UVARIA GRANDIFLORA ROXB EX HORNEM – ANNONACEAE

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam quốc gia phong phú dạng địa hình khí hậu, có nguồn tài nguyên thuận lợi cho phát triển ngành công nghiệp sản xuất thuốc từ dược liệu Theo thống kê, Việt Nam có mức độ đa dạng sinh học cao thứ 16 giới loài động, thực vật vi sinh vật Trong 13.894 loài thực vật, có 3948 lồi sử dụng làm thuốc [3] Phần lớn loài sử dụng theo kinh nghiệm (truyền khẩu) nhân dân lưu giữ lại từ nhiều đời Hơn nữa, cộng đồng dân tộc Việt Nam vốn có nhiều kinh nghiệm độc đáo việc sử dụng cỏ làm thuốc Tuy nhiên, số loài đưa vào để chiết xuất hợp chất làm thuốc hạn chế [17] Do vậy, nghiên cứu thuốc dựa tri thức địa hướng đầy tiềm năng, đóng góp vào việc tạo nguồn dược liệu tương lai hướng đến giải vấn đề sức khỏe bệnh tật Theo kết sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư số thuốc đồng bào Pako, Vân Kiều Quảng Trị mà khảo sát, 10 thuốc chữa bệnh liên quan đến tác dụng chống khối u đưa vào sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào invitro Trong Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem – Annonaceae) thể hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư tốt nhất, tác dụng mạnh hướng đích dòng tế bào ung thư thử nghiệm [9] Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học lồi Làm sáng tỏ thành phần hóa học tác dụng sinh học Bù dẻ tía để chứng minh kinh nghiệm sử dụng người dân cần thiết Đó sở khoa học cho việc thực đề tài: “ Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem – Annonaceae)” Đề tài thực với hai mục tiêu: 1 Nghiên cứu thành phần hóa học Bù dẻ tía theo định hướng tác dụng sinh học ức chế tế bào ung thư Thử độc tính cấp dịch chiết toàn phần từ dược liệu xác định hoạt tính ức chế tế bào ung thư phân đoạn hợp chất phân lập Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem) 1.1.1 Vị trí phân loại [4] Bù dẻ tía - Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem (tên đồng nghĩa: Unona grandiflora DC.; U platypetala Champ ex Benth.) thuộc chi Bù dẻ (Uvaria), họ Na (Annonaceae), Na (Annonales), phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) 1.1.2 Vài nét họ Na (Annonaceae) Trong hệ thực vật Việt Nam, họ Na số họ nghiên cứu hoàn hảo mặt phân loại Đây họ có số chi loài phong phú, đa dạng phân bố rộng khắp hầu hết địa phương đất nước ta [10], [12] Ở họ Na gặp hầu tất dạng sống chủ yếu, trừ thân cỏ dạng sống phụ sinh hay ký sinh Trong số mọc đứng, thường gặp bụi gỗ nhỏ, gặp bụi nhỏ gỗ lớn [1] Lá thuộc họ Na thường khơng có kèm, mọc cách, đơn, mép ngun, gân lơng chim Gân rõ mặt thường lõm mặt Ở chi Artabotrys, Cyathocalyx, Stelechocerpus… gân lồi rõ mặt Gân bên (gân thứ cấp gân cấp II) thường rõ mặt dưới, chúng song song cong hình cung Lá có lơng hình (nhất giai đoạn non) gặp đại diện thuộc chi Anomianthus, Cyathostemma, Ellipeiopsis, Melodorum, Neouvaria, Uvaria…[1] Hoa thường mọc riêng lẻ hay nách lá, kiểu vòng xoắn, đều, lưỡng tính, đơn tính Đế hoa lồi Bao hoa thường gồm vòng, vòng có phận, vòng ngồi đài, vòng cánh hoa Đài rời hay dính Cánh hoa to, dày mềm, đơi hoa có cánh Ô phấn hẹp, mở đường nứt dọc, hướng ngồi Bộ nhụy gồm nhiều nỗn rời xếp khít nhau, đơi giảm nỗn Vòi nhụy ngắn Bộ nhị gồm nhiều nhị rời xếp theo đường xoắn ốc Chỉ nhị ngắn Trong họ Annonaceae có kiểu nhị [4]: + Kiểu Uvarioid: Trung đới dày dài vượt bao phấn để tạo thành mào trung đới + Kiểu Milliusoid: Trung đới mỏng hẹp, làm cho bao phấn lồi lên so với trung đới Quả thường theo kiểu [4]: + Kiểu Annona: Quả tụ, noãn cho mọng riêng biệt tất dính vào + Kiểu Cananga: Mỗi nỗn cho mọng có cuống hoa cho chùm mọng Mỗi mọng mang hàng hạt Ở Gié nam (Unona cochinchinensis Lour.), noãn cho chuỗi hạt thắt lại thành nhiều khúc, khúc đựng hạt Hạt có vỏ cứng, láng Nội nhũ to, xếp nếp [4] Ở Việt Nam, họ Annonaceae có 29 chi, bao gồm: Alphonsea, Anaxagorea, Annona, Anomianthus, Artabotrys, Cananga (Canangium), Cyathocalyx, Cyathostemma, Dasymaschalon, Desmos (Unona), Drepananthus, Enicosanthella, Enicosanthum, Fissistigma, Friesodielsia (Oxymitra), Goniothalamus (Rauwenhoffia), Phaeanthus, Miliusa Polyalthia, (Becariodendron), Meiogyne, Melodorum (Saccopetalum),Mitrella,Mitrephora,Orophea, Popowia, Pseuduvaria, Sageraea, Uvaria (Uvariella) Xylopia với gần 179 loài [4] 1.1.3 Đặc điểm thực vật phân bố chi Bù dẻ (Uvaria L.) 1.1.3.1 Đặc điểm thực vật Phần lớn loài chi Uvaria dây leo thân gỗ hay bụi trườn Phần non có lơng hình Lá thường có gân bên rõ mặt Trong tế bào biểu bì có tinh thể hợp thành khối nhỏ Hoa lưỡng tính, thường đối diện với lá, mọc đơn độc hợp thành cụm hoa dạng xim Lá đài 3, xếp van, thường hợp gốc thành đấu Cánh hoa thường 6, phần lớn rời nhau, xếp lợp thành vòng, cánh hoa xếp thành vòng Các cánh hoa xòe hoa nở gần giống hình dạng kích thước Nhị nhiều, có trung đới dày (dạng Uvarioid), mào trung đới hình đĩa hay gần hình cầu (lớn bao phấn) hình lưỡi nhỏ (hẹp bao phấn) Bao phấn hướng Hạt phấn từ trung bình đến lớn (cỡ 40 - 80 µm), gần hình cầu, đơn độc, thường đối xứng tỏa tròn đối xứng bên, vỏ ngồi lồi lõm Lá nỗn nhiều, khơng có vòi Núm nhụy hình móng ngựa Nỗn thường nhiều (5 - 30), đính thành hàng dọc theo đường nối bụng Phân dạng mọng, thường có cuống rõ, đơi cuống dài [1] Năm 1999, Phạm Hoàng Hộ [10] miêu tả 15 lồi thuộc chi Uvaria có mặt Việt Nam, bao gồm: − − − − − − − − − − − − − − − Uvaria boniana Fin & Gagn (Bồ Bon) Uvaria calamistrata Hance (Bồ nhãn, Bồ men) Uvaria cordata (Dun.) Wall ex Alston (Bồ to) Uvaria dac Pierre ex Fin & Gagn (Bồ Đac) Uvaria fauveliana Pierre ex Ast (Bồ Ast) Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem (Bù dẻ tía) Uvaria flexuosa Ast (Bồ cong quẹo) Uvaria hamiltonii Hook.f & Thoms (Bồ Hamilton) Uvaria lurida Hook.f & Thoms (Bồ tái) Uvaria micrantha Hook.f & Thoms (Bồ nhỏ) Uvaria microcarpa Champ ex Benth & Hook.f (Bồ trái nhỏ) Uvaria pachychila Merr (Bồ phiến dày) Uvaria plagioneuron Diels (Bồ Petelot) Uvaria pierrei Fin & Gagn (Bồ Pierre) Uvaria rufa BI (Bồ hoe) Sau vào năm 2000, Nguyễn Tiến Bân [1] miêu tả 17 lồi thuộc chi Uvaria có mặt Việt Nam, bao gồm 15 loài mà Phạm Hoàng Hộ mơ tả thêm lồi Uvaria sphenocarpa Hook.f & Thoms (Bù dẻ gai) Uvaria varaigneana Pierre ex Fin & Gagnep (Bù dẻ varaigne) 1.1.3.2 Phân bố Chi Bù dẻ (Uvaria L.) phân bố rộng rãi vùng nhiệt đới châu Á, châu Đại Dương, châu Phi châu Mỹ [49] Ở Việt Nam, chi Uvaria phân bố khắp nước [1] 1.1.4 Đặc điểm thực vật Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem) Bù dẻ tía dây leo thân gỗ, dài - 10 m Cành non có lơng tơ màu vàng nâu Lá lúc non đầy lông vàng, lúc già đổi màu nâu có màu ơliu lúc khơ Chóp có mũi ngắn, gốc tròn, hình tim Mặt nhẵn, mặt có lơng rậm Gân bên khoảng 13 - 20 đôi, rõ mặt Cuống dài - mm Hoa thường mọc đơn độc, cuống hoa dài - cm, có bắc dạng lớn Đài bao kín nụ hoa, đài mỏng, hình trái xoan hay hình tròn, đường kính khoảng cm, mặt ngồi có lơng ngắn Cánh hoa rời, màu đỏ tía, hình trái xoan, mặt có lơng Nhị dài - mm, đơi có lơng mép bao phấn, mào trung đới hình lưỡi, nhỏ Đế hoa lồi hình bán cầu, đơi lõm đỉnh Phân hình trụ, dài - cm, rộng - 1,5 cm, có lơng tơ màu vàng nâu Cuống phân dài - cm, vỏ dày Quả có eo cạn, hạt nhiều, xếp theo hàng, xen ke Hạt màu vàng nâu, nhẵn Cây hoa vào tháng - 6, có tháng – hàng năm [1], [10] 1.1.5 Phân bố sinh thái Bù dẻ tía [1] Bù dẻ tía mọc rải rác rừng thứ sinh, độ cao 300 m, phân bố tự nhiên Thanh Hóa, Quảng Bình (Bố Trạch, Ba Rền), Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế (Phú Lộc, Sông Hai Nhánh), Đà Nẵng, Quảng Nam (Cù Lao Chàm), Khánh Hòa (Hòn Tre) Đồng Nai (Biên Hòa) Ngồi ra, phân bố Ấn Độ (Calcutta), Mianma, Trung Quốc (Quảng Tây, Hồng Kông, Hải Nam), Xrilanka, Malaysia Indonesia (Java) 1.2 Thành phần hóa học chi Uvaria Bù dẻ tía 1.2.1 Thành phần hóa học chi Uvaria Các nghiên cứu thành phần hóa học chi Uvaria phát triển thập kỷ qua, nghiên cứu đầu tiên công bố vào năm 1968 Từ đến nay, nghiên cứu chi liên tục phát triển Sự có mặt nhóm chất alcaloid, flavonoid dẫn xuất cyclohexen chi Uvaria trình bày bảng 1.1 Bảng 1.1 Các nhóm chất alcaloid, flavonoid, dẫn xuất cyclohexen chi Uvaria Nhóm chất Alcaloid Flavonoid Hoạt chất Có lồi Aristololactam A II Armepavine Nantenine Chondrofolin Crotsparine Enterocarpam I, II Uvariadiamide Uvarindole A, B, C, D Angoletin Angoluvarin Anguvetin Uvangoletin Chamuvaritin Diuvaretin Flavokawin B Isoschefflerin Schefflerin Chamanetin-5-methylether Demethoxymatteucinol 2’- hydroxymatteucinol TLTK U microcarpa [52] U chamae [32] U ovata U klaineana U kweichowensis U kweichowensis U angolensis [48] [45] [50] [51] [22] U angolensis [22], [31] U chamae, U angolensis, U.lucida U angolensis U scheffleri [22] [31] [41] U angolensis [22] U afzelii Uvafzelin Vafzelin 2,5-dihydroxy-7methoxyflavanon Isouvaretin U rufa U chamae, U angolensis, U leptocladon U accuminata, U chamae, U kirkii, U angolensis, U lucida, U leptocladon Uvaretin Dẫn xuất cyclohexen 1,6- desoxysenepoxid Ferrudiol Isoschefflerin 1- epizeylenol Kweichowenol A, B Kweichowenol C, D Pipoxid Senepoxid Tingtanoxid Zeylenol Uvarirufone A Uvarirufol A, B, C U ferruginea [22] U zeylanica [33] U kweichowensis [51] U catocarpa, U ferruginea U grandiflora U ferruginea U grandiflora, U zeylanica [22] U rufa [26] Như thấy nhiều hợp chất thuộc nhóm phân lập từ loài thuộc chi Uvaria Ngoài chi Uvaria có nhóm chất acetogenin, steroid, terpenoid, dẫn chất lacton số nhóm chất có cấu trúc khác  Nhóm Acetogenin Acetogenin dãy hợp chất thiên nhiên C-35/C-37 từ acid béo C-32/C-34 kết hợp với đơn vị propan-2-ol Chúng đặc trưng mạch hydrocacbon no dài gắn với vòng methyl-α, β- khơng no-γ lacton cuối mạch Ngồi ra, có 1, vòng tetrahydrofuran phân bố dọc theo mạch hydrocacbon số nhóm chứa oxy hydroxy, acetyl, ceton, epoxy liên kết bội Lớp chất đặc trưng cho họ Annonaceae xem lớp chất tự nhiên phát triển nhanh [47] Các hợp chất Acetogenin tìm thấy số lồi thuộc chi Uvaria U calamistrata, U chamae, U tonkinensis…Ví dụ: Từ loài U calamistrata người ta tách hợp chất Calamistrin A; từ loài U chamae phân lập Chamuvarinin, Tripoxyrollin, Diepoxyrollin, Dieporeticanin-1, Dieporeticanin-2 Dieporeticenin [27], [28]; từ loài U tonkinensis phân lập Tonkinelin [23]; từ loài U narum tách hợp chất Squamocin-28-on Panalicin [30]  Nhóm steroid Các dẫn xuất oxy hóa khung steroid tìm thấy số loài thuộc chi Uvaria Chẳng hạn từ loài U kurzii phân lập Betaacetylsitosterol, Stigmasterol Stigmasterol hexadecanoate; từ U.microcarpa phân lập Daucosterol, Beta-daucosterol, Betasitosterol Stigmasterol-3-O-beta-D-glucopyranoside Bên cạnh đó, Stigmasterol 6b-hydroxystigmasta-4,22-dien-3-one phân lập từ loài U hamiltonii [34], [52], [66]  Nhóm terpenoid Các chất có khung terpenoid phát số lồi thuộc chi Uvaria, ví dụ: hợp chất Tanzanene phân lập từ rễ loài U tanzaniae; hợp chất Uvariasesquiterpene A, B, C phân lập từ phần mặt đất loài U angolensis [22]  Dẫn chất lacton Một số dẫn chất lacton Squamocin phân lập từ U narum [30], Desacetyluvaricin Uvaricin phân lập từ U accuminata [22]  Nhóm chất có cấu trúc khác Ngồi nhóm hợp chất nêu trên, số hợp chất có cấu trúc khác tách từ lồi thuộc chi Uvaria Ví dụ: Emorydone, Acid uvafzelic Acid syncarpic phân lập từ U afzelii; hợp chất Zeylena phân lập từ U zeylanica; hai hợp chất Syncarpurea 7-methyl juglone phân lập từ U kirkii [22] 1.2.2 Thành phần hóa học Bù dẻ tía  Trên giới Nghiên cứu định tính sơ thành phần hóa học vỏ thân Uvaria grandiflora cho thấy có mặt alcaloid, flavonoid steroid dịch chiết [42] Căn vào tài liệu thu thập được, thành phần hóa học Bù dẻ tía tóm tắt bảng 1.2 Bảng 1.2 Thành phần hóa học Bù dẻ tía Nhóm chất Tên chất Bộ Nơi thu phận hái TLTK 2-methoxybenzyl benzoat Benzyl benzoat Benzyl-2-hydroxybenzoat Benzyl-2-methoxybenzoat Benzyl-2,6-dihydroxybenzoat Dẫn chất thơm Rễ Benzyl-2-hydroxy-6-methoxy benzoat Thái Lan [36] Benzyl-2,6-dimethoxybenzoat Benzyl-2-hydroxy-5-methoxy benzoat Benzyl-2,5-dimethoxybenzoat Grandiuvarone A Grandiuvarin A Vỏ Grandiuvarin B thân Nigeria [54] Trung Quốc [56] Grandiuvarin C Dẫn chất Polyoxygenated cyclohexen 2-acetoxyzeylenon 6-methoxyzeylenol Zeylenol Zeylenon 1-epizeylenol Uvarigranol G Uvarigranol H Uvarigranol I 2-zeylenyl 2,6-diacetat Lõi gỗ Rễ 10 Trung Quốc [46] phải có nhóm benzoyloxy gắn vào vị trí C-7 Tương tự, tương tác H-3/C-7’ cho phép định vị nhóm benzoyloxy lại vào vị trí C-3 Do tương tác H2/H-3 có J2,3 = 8.0 Hz nên H-2, H-3 phải tồn dạng trans-diaxial Tương tác vinyl H-3/H-4, tương tác W H-3/H-5 có J 3,4 = J3,5 = 1,5 Hz chứng tỏ H-3 chiếm vị trí axial Tương tác H-5/H-6 có J5,6 = 4,0 Hz chứng tỏ H-6 chiếm vị trí equatorial Hình 3.9 Tương tác HMBC ( ) H,H-COSY ( ) chọn lọc hợp chất UGC8 So sánh kiện phổ UGC8 với kiện phổ Pipoxid cơng bố tài liệu [62] cho thấy có trùng hợp hồn tồn (Bảng 3.6.) Do UGC8 xác định Pipoxid Cấu trúc hóa học hợp chất trình bày hình 3.10 Bảng 3.6 Dữ kiện phổ NMR hợp chất UGC8 PIPOXID Vị trí δC(ppm) 61,0 (s) 71,1 (d) 75,8 (d) 134,7 (d) UGC8* δH (ppm) − 4,34 (1H, d, 8,0 Hz) 5,63 (1H, ddd, 8,0, 2,5, 1,5 Hz) 5,91 (1H, td, 10,0, 1,5 Hz) 40 PIPOXID [62] δH (ppm) − 4,32 (1H, dd, J2,3 = 8,0, J2,OH = 6,0 Hz) 5,68 (1H, dt, J3,2 = 8,0, J3,5 = 2,5, J3,4 = 2,0Hz) 5,90 (1H, dt, J4,5 = 10,0, J4,3 = 2,0, J4,6 = 1,75 Hz) 125,8 (d) OH 55,1 (d) − 63,7 (t) 131,4; 131,0 (s) 130,7 (d) 129,7; 129,6 (d) 134,5; 134,4 (d) 167,7; 167,5 (s) 1’; 1’’ 2’; 6’ 2’’; 6’’ 3’; 5’ 3’’; 5’’ 4’; 4’’ 7’; 7’’ 6,14 (1H, ddd, 10,0, 4,0, 6,10 (1H, dt, J5,4 = 10,0, J5,6 = 3,75, J5,3 2,5 Hz) = 2,5 Hz) 3,66 (1H, dd, 4,0, 1,5 Hz) 3,60 (1H, dd, J6,5 = 3,75, J6,4 = 1,75 Hz) − 3,24 (1H, d, JOH,2 = 6,0) 4,91 (1H, d, 12,0 Hz) (7a) 4,57 (1H, d, 12,0 Hz) 5,10, 4,48 (2H, Abq, J = 12,0 Hz) (7b) 3,7-Dibenzoyloxy − 8,07-8,10 (4H, m) 7,49-7,54 (4H, m) 7,7 - 8,1 (10H, m) 7,62 -7,67 (2H, m) − (*)1 H (500 MHz), 13C (125 MHz) đo CD3OD, dùng TMS làm chất chuẩn nội Hình 3.10 Cấu trúc hóa học hợp chất UGC8 3.3 Kết nghiên cứu tác dụng sinh học 41 3.3.1 Kết thử độc tính cấp Kết nghiên cứu độc tính cấp dịch chiết tồn phần Bù dẻ tía trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Kết nghiên cứu độc tính cấp Liều (mg/kgP/lần) Số chuột chết/số chuột sống sau 72 5000 0/6 6000 0/6 7000 0/6 8000 0/6 9000 0/6 10000 0/6 Biểu chức vòng 24 Chuột khoẻ mạnh, di chuyển ăn uống bình thường, phản xạ ánh sáng âm tốt Chuột khoẻ mạnh, di chuyển ăn uống bình thường, phản xạ ánh sáng âm tốt Chuột khoẻ mạnh, di chuyển ăn uống bình thường, phản xạ ánh sáng âm tốt Chuột khoẻ mạnh, di chuyển ăn uống bình thường, phản xạ ánh sáng âm tốt Chuột khoẻ mạnh, di chuyển ăn uống bình thường, phản xạ ánh sáng âm tốt Chuột khoẻ mạnh, di chuyển ăn uống bình thường, phản xạ ánh sáng âm tốt Kết cho thấy, tất lô khơng có chuột bị chết dù uống nồng độ cao 10000 mg/kgP (hay 10 g/kgP)/lần Theo dõi biểu chức chuột thí nghiệm, nhận thấy chuột tất lơ thí nghiệm khỏe mạnh, di chuyển ăn uống bình thường, khơng có tượng xù lơng, di chuyển chậm Như vậy, dịch chiết tồn phần Bù dẻ tía khơng thể độc tính cấp liều nghiên cứu với liều cực đại cho chuột uống 10000 mg/kgP chuột, chưa xác định giá trị LD50 3.3.2 Kết nghiên cứu hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư 3.3.2.1 Của dịch chiết phân đoạn Dịch chiết phân đoạn H, C, E, B N (phương pháp chiết trình 42 bày mục 3.2.1.) đưa thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào MDA-BA-321 (ung thư vú) MKN7 (ung thư dày) Kết thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào dịch chiết phân đoạn dòng tế bào MDA-BA-321 MKN7 Phân đoạn H (% ức chế) MDAMKN7 BA-321 100 104,47 100,56 20 93,68 91,42 37,72 39,09 0,8 24,12 22,34 IC50 3,27 3,42 Phân đoạn B Nồng (% ức chế) độ MDA(µg/ml) MKN7 BA-321 100 95,70 97,35 20 48,16 51,21 27,19 30,02 0,8 21,14 20,46 IC50 22,72 18,77 Nồng độ (µg/ml) Phân đoạn C Phân đoạn E (% ức chế) (% ức chế) MDAMDAMKN7 MKN7 BA-321 BA-321 99,12 97,89 98,59 98,05 97,72 96,92 79,65 80,37 94,83 74,84 31,32 32,82 36,49 38,13 18,33 21,77 0,971 1,305 8,44 8,08 Phân đoạn N Ellipticine (% ức chế) (% ức chế) MDAMDAMKN7 MKN7 BA-321 BA-321 74,91 76,55 90,77 99,78 29,47 32,08 59,72 65,72 21,84 23,49 19,76 33,33 14,47 17,82 -0,54 5,76 60,92 52,48 1,249 0,935 Ghi chú: Nồng độ thử nghiệm Ellipticine 10 µg/ml; µg/ml; 0,4 µg/ml; 0,08 µg/ml Kết cho thấy, dịch chiết phân đoạn chloroform, n-hexan ethyl acetat có hoạt tính ức chế hai dòng tế bào ung thư thử nghiệm Phân đoạn n- butanol có hoạt tính gây độc dòng tế bào MKN7 khơng có hoạt tính dòng MDA-BA-321 Phân đoạn nước xem khơng có khả ức chế hai dòng tế bào thử nghiệm Trong đó, phân đoạn chloroform cho hoạt tính tốt hai dòng tế bào MDA-BA-321 MKN7 với giá trị IC50 thấp lần lượt 0,971 1,305 µg/ml Hai phân đoạn ethyl acetat n-hexan xem có hoạt tính tốt, phân đoạn n-hexan có hoạt tính tốt so với phân đoạn ethyl acetat Giá trị IC 50 hai dòng tế bào thử nghiệm phân đoạn n-hexan 3,27 3,42 µg/ml, so với phân 43 đoạn ethyl acetat 8,44 8,08 µg/ml Căn vào kết trên, phân đoạn dịch chiết đem thử nghiệm, phân đoạn chloroform thể hoạt tính ức chế tế bào ung thư mạnh nên ưu tiên lựa chọn để tiến hành phân lập hợp chất tinh khiết 3.3.2.2 Của hợp chất tinh khiết phân lập Các hợp chất phân lập (hợp chất 1, 2, 4) thử nghiệm khả gây độc tế bào dòng tế bào LU-1 Kết sàng lọc cho thấy hợp chất có khả ức chế > 50% phát triển tế bào ung thư nồng độ 100µg/ml nên tiếp tục xác định giá trị IC 50 Kết thử nghiệm xác định giá trị IC50 thể bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết xác định giá trị IC50 hợp chất phân lập dòng tế bào LU-1 Nồng độ (µg/ml) 100 20 0,8 IC50 % Ức chế Hợp chất 97,94 53,52 41,23 28,65 16,66 Hợp chất 111,17 107,54 82,73 31,74 1,30 Hợp chất 108,41 37,46 22,99 13,12 37,63 Hợp chất 106,48 48,44 35,70 25,92 26,19 Ellipticine 86,66 76,23 30,31 13,12 0,67 Ghi chú: Nồng độ thử nghiệm Ellipticine 10 µg/ml; µg/ml; 0,4 µg/ml; 0,08 µg/ml Cả hợp chất phân lập có hoạt tính gây độc dòng tế bào LU-1, hợp chất có hoạt tính mạnh với giá trị IC 50 thấp 1,30 µg/ml (< µg/ml) Do xác định hợp chất có tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư dòng LU-1 Ba hợp chất lại thể hoạt tính mức độ khác Trong hợp chất có hoạt tính mạnh hợp chất hợp chất có hoạt tính yếu Giá trị IC50 dòng tế bào thử nghiệm hợp chất 16,66 µg/ml, so với hợp chất 26,19 µg/ml hợp chất 37,63 µg/ml 44 Chương BÀN LUẬN Trong trình nghiên cứu thuốc từ cỏ, kiến thức y học dân tộc địa có vai trò quan trọng định hướng nghiên cứu ban đầu, qua tiết kiệm nhiều thời gian, công sức tiền Việc tìm hiểu, nghiên cứu tri thức địa, sàng lọc tìm kiếm hoạt chất có tác dụng làm thuốc từ dược liệu hướng ưu tiên mang lại nhiều triển vọng cho cơng tìm kiếm thuốc nhân loại Nước ta có nhiều dân tộc sinh sống, dân tộc có sắc văn hố riêng, số truyền thống sử dụng cỏ làm thuốc cộng đồng dân tộc thiểu số Tri thức kết trình đấu tranh sinh tồn người, kiến thức tích luỹ hàng trăm năm lưu truyền qua nhiều hệ Cây thuốc dân tộc tri thức địa sử dụng cỏ làm thuốc dân tộc Việt Nam nguồn tài nguyên quý giá, có giá trị khoa học có ý nghĩa thực tiễn to lớn Sự gia tăng nhanh chóng bệnh ung thư sức ép lớn cho sức khỏe cộng đồng hệ thống y tế tồn giới nói chung Việt Nam nói riêng Tại nước phát triển, ung thư nguyên nhân gây tử vong thứ hai sau tim mạch Ước tính hàng năm giới có khoảng 10,9 triệu ca ung thư mắc khoảng 6,7 triệu người chết ung thư Tại Việt Nam, hàng năm có khoảng 100.000 - 150.000 trường hợp mắc ung thư khoảng 70.000 người chết ung thư [11] Cho đến nay, ung thư bệnh hiểm nghèo điều trị ung thư thách thức lớn cho nhà khoa học Có nhiều phương pháp điều trị bệnh ung thư thuốc điều trị dùng lâm sàng thường gây nhiều tác dụng phụ, độc với thể Vì xu hướng khoa học nghiên cứu, tìm kiếm thuốc, sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên đáp ứng điều trị an toàn với thể 45 Đồng bào Pako Vân Kiều huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị dân tộc người có nhiều kinh nghiệm việc sử dụng thuốc để phòng chữa bệnh Năm 2005, nghiên cứu nhóm Đại học Y Hà Nội cho thấy, có 31 thuốc theo kinh nghiệm người Vân Kiều, cấu thành từ 88 vị thuốc có sẵn địa phương để chữa 14 bệnh thông thường Trong đó, có thuốc có giá trị sử dụng cao dùng để chữa số bệnh viêm gan cấp, viêm dày, viêm đường tiết niệu, sỏi thận [14] Bù dẻ tía thuốc thầy lang đồng bào Pako, Vân Kiều dùng để chữa số bệnh liên quan đến khối u Qua nghiên cứu đề tài, lần đầu tiên Bù dẻ tía đưa vào thử nghiệm hoạt tính ức chế tế bào ung thư Và kết nghiên cứu cho thấy dược liệu có hoạt tính ức chế mạnh dòng tế bào thử nghiệm gồm LU-1 (ung thư phổi người), KB (ung thư biểu mô), MDA-BA-321 (ung thư vú), Hep G2 (ung thư gan người), SW480 (ung thư ruột kết) MKN7 (ung thư dày) với giá trị IC 50 thấp từ 0,62 - 7,51 µg/ml, hoạt tính mạnh dòng MDA-BA-321 MKN7 [11] Do dòng tế bào lựa chọn cho nghiên cứu tác dụng sinh học dịch chiết phân đoạn Tuy nhiên theo tài liệu thu thập nay, nghiên cứu Bù dẻ tía Việt Nam Do vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học theo hướng ức chế tế bào ung thư Bù dẻ tía cần thiết Từ góp phần quan trọng giải thích tri thức làm thuốc đồng bào dân tộc Pako Vân Kiều Quảng Trị đề xuất sở cho việc sử dụng dược liệu tương lai 4.1 Về quy trình, phương pháp chiết xuất phân lập Phần mặt đất Bù dẻ tía sấy khơ, xay thành bột thô chiết xuất phương pháp ngâm nhiệt độ phòng với dung mơi methanol tuyệt đối Methanol xem dung mơi hòa tan hầu hết nhóm hợp chất Methanol có khả thấm xuyên qua màng tế 46 bào thực vật, tạo cầu nối hydrogen liên phân tử với nhóm phân cực khác nên chiết hợp chất có độ phân cực mạnh, vừa yếu [13] Trong nghiên cứu này, trình phân lập sử dụng phối kết hợp nhiều phương pháp chiết xuất sắc ký chiết xuất phân đoạn lỏng - lỏng với độ phân cực dung môi tăng dần để tách tốt phân đoạn, chiết pha rắn, sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel pha thường pha đảo, sắc ký cột Sephadex LH 20, sắc ký lớp mỏng pha thường, pha đảo Đây phương pháp sắc ký thường quy kinh điển sử dụng phòng thí nghiệm Cho đến nay, phương pháp sử dụng hiệu nghiên cứu chiết tách hợp chất từ thiên nhiên Sau thời gian nghiên cứu, qua nhiều công đoạn phân lập hợp chất tinh khiết từ Bù dẻ tía Các hợp chất tinh khiết xác định cấu trúc thông qua liệu vật lý (màu sắc, nhiệt độ nóng chảy), số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY, NOESY phổ khối lượng MS Hiện nay, phương pháp đại thường sử dụng để xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ thiên nhiên, cho kết với độ tin cậy cao [8] 4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng tác dụng sinh học Trong trình thực hiện, đề tài nghiên cứu thành phần hóa học Bù dẻ tía theo định hướng lấy tác dụng sinh học để dẫn đường Cụ thể từ dịch chiết tồn phần có hoạt tính tạo dịch chiết phân đoạn đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư phân đoạn với mục đích lựa chọn phân đoạn có hoạt tính tốt để tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học Từ kết đó, phân đoạn chloroform chọn để tiến hành phân lập hợp chất tinh khiết Việc nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng tác dụng sinh học 47 mang lại kết mong đợi Đó phân lập hợp chất có tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư mức độ khác Theo định hướng phương pháp cần phải thử nghiệm hoạt tính tiếp phân đoạn phân cắt nhỏ từ dịch chiết chloroform để dẫn đường cho trình phân lập Tuy nhiên với điều kiện hạn chế thời gian kinh phí nên đề tài chiết tách phân lập trực định hướng chiết tách hợp chất (phân lập hợp chất có hàm lượng lớn thơng qua định tính mỏng sắc ký) từ phân đoạn Với hợp chất phân lập có hoạt tính ức chế tế bào ung thư mức độ khác (đặc biệt hợp chất có hoạt tính tốt), kết đề tài mở triển vọng tìm kiếm hợp chất làm thuốc điều trị ung thư từ dược liệu Bù dẻ tía Hiện việc lấy tác dụng sinh học dẫn đường cho nghiên cứu thành phần hóa học hướng cho trình tìm kiếm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học theo định hướng mong muốn 4.3 Về độc tính cấp dịch chiết toàn phần dược liệu Trong dân gian, số thuộc họ Na thường cho ăn được, ví dụ lồi mãng cầu ta - Annona squamosa, mãng cầu xiêm - Annona muricata, bình bát - Annona reticulata… Tuy nhiên, số phận khác lại có độc tính Kinh nghiệm dân gian cho hạt mãng cầu chứa chất độc dùng hạt giã nhỏ lấy nước làm thuốc sát trùng da, diệt trùng; dịch chiết bình bát nước – Annona glabra L có độc tính, dùng để trừ chấy, rận [68]; Ở Peru, hạt loài Annona cherimolia gây loét giác mạc mù mắt, nhựa mủ lồi Annona chrysophylla Bojer gây kích ứng da [67]… Dưới góc độ khoa học, thành phần hóa học lồi thuộc họ Na thường chứa alcaloid Đây nhóm chất có tác dụng sinh học mạnh độc tính cao Trên giới, số loài thuộc họ Na nghiên cứu độc tính Chẳng hạn người ta xác định liều LD 50 dịch chiết phân đoạn ethanol từ vỏ rễ loài U chamae 166mg/kg thể trọng 48 chuột [54], dịch chiết nước từ loài Annona muricata 155 ± 20 mg/kg thể trọng chuột [55] Một nghiên cứu Ấn Độ xác định liều an toàn chuột dịch chiết từ hạt Annona squamosa 300mg/kg thể trọng, đồng thời dịch chiết hạt A squamosa độc gấp lần so với dịch chiết hạt Pongamia pinnata (cây Đậu dầu- họ Đậu) [21] Như thấy số lồi thuộc họ Na có độc tính mức độ định Tuy nhiên, theo kết đề tài, dịch chiết toàn phần phần mặt đất Bù dẻ tía khơng thể độc tính cấp mức liều nghiên cứu với liều lớn cho chuột uống 10000 mg/kg chuột (tương đương 62,5g dược liệu/ kg chuột) chưa xác định giá trị LD 50 Liều tương đương với liều dùng người 5,2g dược liệu/kg, liều cao gấp 43 lần so với liều dùng Bù dẻ tía thực tế đồng bào dân tộc địa 6g/ người/ ngày (0,12g dược liệu/kg) Kết cho thấy Bù dẻ tía dược liệu an tồn mặt đánh giá độc tính cấp 4.4 Về tác dụng sinh học dịch chiết phân đoạn Trong trình nghiên cứu, xác định hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn dịch chiết H, C, E, B N dòng tế bào MDA-BA-321 MKN7 nhận thấy điều đáng lưu ý giá trị IC 50 dịch chiết phân đoạn dòng tế bào thử nghiệm xấp xỉ Điều gợi lên giả thuyết tác dụng dịch chiết phân đoạn dòng tế bào ung thư có tương đồng Do thời gian tiếp theo, phân đoạn có hoạt tính tốt nên thử hoạt tính gây độc tế bào nhiều dòng khác để có nhìn tồn diện đầy đủ tác dụng sinh học phân đoạn Việc tìm phân đoạn chloroform có tác dụng tốt khơng có ý nghĩa việc định hướng cho trình chiết tách phân lập mà điều hướng đến sử dụng dịch chiết phân đoạn trình phát triển thành 49 thuốc Việc sử dụng cao chiết có số thành phần xác định se thuận lợi cho công tác tiêu chuẩn hóa cao dược liệu Điều quan trọng cao chiết chloroform có tác dụng gần tương đương với cao toàn phần khối lượng khoảng 1/6 so với khối lượng cao toàn phần Điều có ý nghĩa quan trọng trình nghiên cứu thuốc từ dược liệu Vì biết, khó khăn việc phát triển thuốc dân tộc cổ truyền lâu thường dùng dịch chiết tổng (dịch chiết tồn phần) mà khơng tìm ra, khơng chứng minh phân đoạn có tác dụng Cao chiết tồn phần với khối lượng lớn khó đưa vào dạng bào chế phân liều đại Việc giảm khối lượng cao chiết mà không làm giảm tác dụng sinh học góp phần giải vấn đề khó khăn nêu 4.5 Về thành phần hóa học tác dụng sinh học hợp chất phân lập Đề tài phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ Bù dẻ tía, Uvarilactam, (−)-3-O-debenzoylzeylenon, Zeylenon Pipoxid Trong hợp chất Uvarilactam trước phân lập từ loài U microcapa Champ ex Benth [29] Tuy nhiên, Uvarilactam có thành phần hóa học U grandiflora chưa cơng bố cơng trình Như thông báo đầu tiên Uvarilactam phân lập từ U grandiflora Uvarilactam alcaloid thuộc nhóm Aristolactam Đây nhóm chất có hoạt tính sinh học mạnh tìm thấy nhiều họ thực vật Aristolochiaceae, Annonaceae, Minispermaceae, Pipreraceae, Saururaceae [59] Bên cạnh số hoạt tính diệt nấm, chống ngưng kết tiểu cầu, chống oxy hóa [57], hợp chất thuộc nhóm thể hoạt tính gây độc tế bào ung thư Theo nhóm nghiên cứu người Anh, Aristolochic acid I từ loài Aristolochia cucurbitifolia có tác dụng gây độc dòng tế bào ung thư biểu mơ biểu bì (9-KB), ung thư biểu mơ phổi (A549), ung thư ruột kết (HT- 50 29) ung thư máu (HL-60) với giá trị IC 50 thấp Aristolactam AIIIa từ lồi Aristolochia argentina có khả gây độc chọn lọc dòng tế bào ung thư biểu mơ biểu bì (9-KB), ung thư biểu mơ phổi (A549) [25] Ngoài ra, hai hợp chất 3,5-dihydroxy-2,4-demethoxyaristolactam, Goniopectaline từ loài Dasymaschalon blumei có khả ức chế tế bào ung thư máu dòng lympho chuột (P-388), ung thư biểu mơ người (KB) Aristolactam BI từ lồi Dasymaschalon blumei có hoạt tính dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) Đáng ý hợp chất có tác dụng chọn lọc tế bào khối u mà không ảnh hưởng đến tế bào thường Đây đặc tính an tồn việc ứng dụng điều trị ung thư cho người [59] Trong năm gần đây, có số nghiên cứu tổng hợp bán tổng hợp khung Aristolactam dẫn xuất Điều cho thấy cấu trúc quý, có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị, đặc biệt tiềm ứng dụng lĩnh vực điều trị ung thư [25] Zeylenon, (−)-3-O-debenzoylzeylenon Pipoxid hợp chất thuộc nhóm dẫn xuất Polyoxygenated cyclohexen Zeylenon nhóm nghiên cứu người Trung Quốc phân lập từ U grandiflora năm 2002 [56], hợp chất biết có U tonkinensis (họ Annonaceae) [60] Plumbago zeylanica L (họ Plumbaginaceae) [16] Hợp chất Pipoxid biết có U grandiflora thu hái Thái Lan [22] Bên cạnh hợp chất tìm thấy lồi khác Uvaria purpurea, Piper hookeri Piper polysyphorum [45], [62] Hiện nay, nhóm chất quan tâm nghiên cứu với hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm bật tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư Một số dẫn chất Polyoxygenated cyclohexen phân lập từ chi Uvaria có tác dụng gây độc dòng tế bào khối u người tế bào KB (ung thư biểu mô miệng), HCT-8 (ung thư ruột kết), Bel 7402 (ung thư gan) A 2780 (ung thư buồng trứng) [47] Hai dẫn chất Polyoxygenated cyclohexen phân lập từ U kweichowensis Kweichowenol C 51 Kweichowenol D cho thấy hiệu lực kháng khối u tốt [51] Zeylenon chứng minh chất ức chế vận chuyển nucleosid nhân thymidin uridin tế bào ung thư cổ trướng Ehrlich với giá trị IC 50 thấp lần lượt 8,2 µM 10,1 µM [37] Hợp chất thể tác dụng gây độc nhiều dòng tế bào khối u người tế bào HCT-8 (ung thư ruột kết), BGC-823 (ung thư dày), Bel 7402 (ung thư gan) [64] dòng tế bào nhạy cảm đa kháng thuốc tế bào ung thư vú MCF-7 MCF-7/ADM, tế bào ung thư biểu mô miệng KB KB/VCR với giá trị IC50 thấp [37] Những hoạt tính cho thấy nhóm chất Polyoxygenated cyclohexen có chi Uvaria nhóm chất có hoạt tính sinh học tốt, có triển vọng định hướng sử dụng, đặc biệt điều trị bệnh liên quan đến khối u Cho đến nay, chưa tìm thông báo tác dụng sinh học (−)-3-O-debenzoylzeylenon Pipoxid Tuy nhiên hợp chất (−)-3-Odebenzoylzeylenon nhóm nghiên cứu Mỹ bán tổng hợp thành cơng từ Zeylenol [39] Điều cho thấy thu hút ý nhà khoa học việc hướng đến tạo nguồn nguyên liệu lớn cho việc nghiên cứu phát triển hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên có tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư Như theo tài liệu nghiên cứu thu thập được, hợp chất phân lập có cấu trúc thuộc hai nhóm Aristolactam dẫn chất Polyoxygenated cyclohexen nhóm chất có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư mức độ khác nhau, có số chất có hoạt tính mạnh với giá trị IC50 thấp Trong đó, kết nghiên cứu đề tài cho thấy tương đồng với nghiên cứu giới, hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thư thử nghiệm Trong hợp chất (−)-3-Odebenzoylzeylenon thể hoạt tính mạnh hợp chất phân lập được, với giá trị IC50 thấp dòng tế bào LU-1 1,30 µg/ml, gần 52 tương đương với chất chuẩn Ellipticine Đây xác định hợp chất có tác dụng ức chế mạnh phát triển tế bào ung thư dòng LU-1 Kết mở triển vọng cho việc nghiên cứu bán tổng hợp thuốc có tác dụng chống khối u từ (−)-3-O-debenzoylzeylenon, việc xác định hàm lượng hợp chất dược liệu để định hướng tách chiết nguyên liệu tinh khiết cho thử nghiệm gây độc tế bào ung thư invivo Trong hợp chất lại, Uvarilactam có hoạt tính mạnh hơn, tiếp đến Pipoxid cuối Zeylenon, với giá trị IC 50 tương ứng 16,66 µg/ml, 26,19 µg/ml 37,63 µg/ml Mặc dù hợp chất thể hoạt tính gây độc tế bào ung thư mức độ vừa phải, thông báo đầu tiên tác dụng ức chế tế bào ung thư dòng LU-1 chúng Kết góp phần làm phong phú thêm tác dụng sinh học hợp chất Trên sở tài liệu tham khảo khả gây độc tế bào ung thư Zeylenon, nhóm dẫn chất Polyoxygenated cyclohexen Aristolactam kết nghiên cứu đề tài hợp chất phân lập cần xác định hoạt tính nhiều dòng tế bào ung thư khác, tế bào thường để có kết luận đầy đủ hoạt tính sinh học chúng Như vậy, q trình thực hiện, đề tài từ công đoạn đầu tiên thử nghiệm tác dụng ức chế tế bào ung thư dịch chiết toàn phần Tiếp đến chiết xuất phân đoạn để đưa vào thử nghiệm nhằm chọn phân đoạn có hoạt tính mạnh để tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học Và kết cuối phân lập hợp chất có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư mức độ khác Trong khuôn khổ thời gian kinh phí thực hiện, kết đạt đề tài khiêm tốn Tuy nhiên, nghiên cứu góp phần giải thích kinh nghiệm dùng thuốc quý giá đồng bào dân tộc cho thấy dược liệu có triển vọng cần nghiên cứu diện rộng mức độ sâu thành phần hố học hoạt tính sinh học để tìm hoạt chất có tác dụng diệt tế bào ung thư tốt 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN * Về thành phần hóa học - Đã xác định Bù dẻ tía có: alcaloid, flavonoid, anthranoid, acid amin, acid hữu cơ, chất béo, đường khử steroid - Đã chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ Bù dẻ tía: Uvarilactam, 3-O-debenzoylzeylenon, Zeylenon, Pipoxid Trong lần đầu tiên cơng bố phân lập hợp chất Uvarilactam từ Bù dẻ tía * Về tác dụng sinh học - Đã xác định dịch chiết toàn phần bù dẻ tía khơng thể độc tính cấp tất liều nghiên cứu chưa xác định giá trị LD50 - Đã xác định dịch chiết hai phân đoạn chloroform phân đoạn n-hexan có hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh dòng tế bào MDA-BA-321 MKN7, phân đoạn chloroform có hoạt tính mạnh với giá trị IC 50 tương ứng 0,971µg/ml 1,305µg/ml - Đã xác định hợp chất 3-O-debenzoylzeylenon có hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào ung thư phổi LU-1 mạnh hợp chất phân lập với giá trị IC50 1,30 µg/ml KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu thành phần hoá học khác phân đoạn chloroform - Tiếp tục thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập dòng tế bào ung thư khác 54 ... (Java) 1.2 Thành phần hóa học chi Uvaria Bù dẻ tía 1.2.1 Thành phần hóa học chi Uvaria Các nghiên cứu thành phần hóa học chi Uvaria phát triển thập kỷ qua, nghiên cứu đầu tiên công bố vào năm... Tổng quan Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem) 1.1.1 Vị trí phân loại [4] Bù dẻ tía - Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem (tên đồng nghĩa: Unona grandiflora DC.; U platypetala Champ ex Benth.)... sử dụng làm thuốc an thần, ngừng nôn mữa, thấp khớp Lá sử dụng để làm giảm đau, giảm sưng [12] 1.4 Tác dụng sinh học công dụng Bù dẻ tía 1.4.1 Tác dụng sinh học Bù dẻ tía Các cơng trình nghiên