Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây bảy lá một hoa (paris chinensis franch )

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN DUY PHƯƠNG BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂYBẢY LÁ MỘT HOA PARIS CHINENSIS FRANCH... BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN DU

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN DUY PHƯƠNG

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂYBẢY LÁ MỘT HOA

(PARIS CHINENSIS FRANCH.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN DUY PHƯƠNG

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA

(PARIS CHINENSIS FRANCH.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

1 Bộ môn Dược học cổ truyền

2 Khoa Hoá thực vật – Viện dược liệu

HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN

Khoá luận này là kết quả của quá trình học tập, rèn luyện của em tại trường Đại học Dược Hà Nội và quá trình nghiên cứu tại viện Dược liệu dưới

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô Nhân dịp này em xin gửi lời

cảm ơn chân thành đến TS Hà Vân Oanh, ThS Nguyễn Thị Duyên và TS

Đỗ Thị Hà, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em hoàn thành

khoá luận này

Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn đến:

Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để

em được học tập và nghiên cứu tại trường

Các cán bộ nghiên cứu khoa Hoá thực vật – Viện Dược liệu đã giúp đỡ

em trong quá trình làm thực nghiệm

Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu em khó tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp quý giá của các thầy cô để khoá luận thêm hoàn thiện

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên

Nguyễn Duy Phương

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ… 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại Paris chinensis Franch (Bảy lá một hoa)……… …… 2

1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Paris L……… 2

1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Paris L……… … 2

1.2.2 Phân bố chi Paris L……… ……….… 3

1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố loài Bảy lá một hoa (Paris chinensis Franch.)……….….4

1.3.1 Đặc điểm thực vật…… ……… ……… ….4

1.3.2 Sinh thái và phân bố 5

1.4 Thành phần hoá học……… ……5

1.5.Tác dụng sinh học 13

1.5.1.Tác dụng chống ung thư 13

1.5.2.Tác dụng kháng khuẩn……… ……… 14

1.5.3.Tác dụng trên tim mạch……… 14

1.5.4 Tác dụng cầm máu 14

1.5.5.Tác dụng giảm đau 15

1.5.6 Độc tính 15

1.6 Công dụng 15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu…… ……….………….… 17

2.1.1 Nguyên liệu……….…… 17

2.1.2 Hoá chất và trang thiết bị……… 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 18

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật……… 18

2.2.2 Nghiên cứu về hoá học……… ……… ……… 19

2.2.2.1 Phương pháp định tính……… ……… 19

2.2.2.2 Phương pháp tách chiết và phân lập chất tinh khiết từ Bảy lá một hoa 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả nghiên cứu thực vật ……… … 21

3.2 Kết quả định tính ……… 23

3.3 Kết quả chiết xuất, phân lập và nhận dạng các chất … 30

3.3.1 Chiết các phân đoạn từ phần dưới mặt đất Bảy lá một hoa…… 30

3.3.2 Kết quả phân lập và tinh sạch chất tinh khiết từ phân đoạn ethyl acetat…… …… ……… 32

3.3.2.1 Khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng……… 32

3.3.2.2 Phân lập bằng sắc ký cột………33

3.3.2.3 Biện giải cấu trúc của chất PE 1………… ….……… 37

3.4 Bàn luận………42

3.4.1 Về việc chọn đề tài và mục tiêu của đề tài……… … 42

3.4.2 Về thực vật……… … 43

3.4.3 Về hoá học……….……43

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận.……… ……… 46

4.2 Đề xuất……….46

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ

DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng Nội dung Trang

1 1.1 Các loài thuộc chi Paris L ở Việt Nam 3

2 1.2 Các saponin được Xu – Jie Qin và CS phân lập từ

thân và lá Paris polyphylla var yunnanensis 8

3 1.3 Các saponin được Xia Wu và CS phân lập từ thân

và lá Paris polyphylla var yunnanensis 11

4 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong phần

45

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ STT Hình Nội dung Trang

1 2.1 Phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa sau khi sơ

2 2.2

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu chiết xuất và phân lập chất tinh khiết từ phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa

5 3.3 Sơ đồ quy trình chiết các cao phân đoạn từ phần

6 3.4 Sắc ký đồ khi khảo sát phân đoạn EtOAc bằng các

7 3.5 Sắc ký đồ các phân đoạn sau khi chạy cột phân đoạn

8 3.6 Sắc ký đồ của cao EtOAc, phân đoạn II và chất PE1 36

9 3.7 Sơ đồ phân lập chất tinh khiết từ Bảy lá một hoa 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, với diện tích phần đất liền hơn 330.000 km2, đồi núi chiếm 4/5 diện tích Những điều kiện địa lý và khí hậu trên đã tạo cho Việt Nam có thảm thực vật phong phú và đa dạng, trong đó có rất nhiều loài được dùng làm thuốc Nhiều dược chất làm thuốc có nguồn gốc từ dược liệu như: rutin, D strophantin, berberin, taxol, palmatin, artermisinin, Xu hướng nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hợp chất thiên nhiên để làm thuốc ngày càng được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm bởi nhiều ưu điểm như: độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể so với các thuốc có nguồn gốc tổng hợp khác

Bảy lá một hoa (Paris chinenis Franch.) và những loài khác cùng chi là

những cây thuốc quý hiếm, thường được sử dụng trong dân gian để tiêu sưng nhọt, chữa rắn cắn,… [5]; từ lâu Trung Quốc đã sử dụng vị thuốc này để điều trị ung thư Hiện nay, tác dụng dược lý đặc biệt là tác dụng chống ung thư của Bảy lá một hoa đang được các nhà khoa học trên thế giới đi sâu nghiên cứu Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần

hoá học cũng như tác dụng sinh học của Paris chinensis Franch nói riêng cũng như các loài thuộc chi Paris L nói chung Vì vậy, để góp phần làm sáng

tỏ thành phần hoá học cũng như giá trị sử dụng của loài Paris chinensis

Franch ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “ Bước đầu nghiên cứu

thành phần hoá học của loài Bảy lá một hoa (Paris chinensis Franch.)”

với các mục tiêu như sau:

1 Sơ bộ xác định sự có mặt của các nhóm chất chính thuộc phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa

2 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các chất phân lập được từ

phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Vị trí phân loại chi Paris L

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi

Họ Bảy lá một hoa (Trọng lâu) (Trilliaceae)

Chi Bảy lá một hoa, Tảo hưu (Paris L.) [4]

1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Paris L

1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Paris L

Cỏ nhiều năm; thân rễ thường hình trụ, nạc, nằm ngang; phần trên mặt đất thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông Lá mọc đối hoặc mọc vòng trên thân, 4 - 10 lá; phiến lá màu lục, có vệt tím hoặc không, hình mũi giáo, hình thuôn, hình trứng ngược, mềm, gân bên rõ, không có cuống hoặc có cuống dài hoặc ngắn Hoa thường đơn độc hoặc một vài hoa mọc ở đỉnh, to, màu lục, đều, lưỡng tính, mẫu 3 - 5, cuống dài, thẳng đứng Đài (2) 3 - 5 (10), rời nhau, hình mũi giáo, màu lục hoặc màu trắng, thường to hơn cánh hoa, xếp lợp hoặc hơi vặn Cánh hoa 2 (3) - 5 (10), dạng dải hoặc hình trứng, bằng nhau, màu sắc khác nhau Nhị 3 -

22 chiếc, phần lớn là 6 - 12; chỉ nhị dẹp, ngắn, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, đỉnh trung đới kéo dài thành hình cầu hoặc hình sợi hoặc không kéo dài Bầu thượng, tròn hoặc có cạnh, 3 - 12 lá noãn, nhiều ô, với kiểu đính noãn trung trụ hoặc 1 ô với kiểu đính noãn bên, mỗi bên nhiều noãn; vòi nhuỵ 3 - 5, rời hoặc dính nhau phần

gốc; đầu nhuỵ 3 - 5 Quả mọng hoặc quả nang, mở ở lưng ô Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nước hoặc không, nội nhũ rắn chắc hoặc nạc, chứa dầu, mỡ, tinh bột, phôi nhỏ, hình cầu hoặc hình trứng [6]

1.2.2 Phân bố chi Paris L

Ở Việt Nam, chi Paris L có 6 loài [6]

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Paris L phân bố ở Việt Nam

Tài liệu tham khảo

1 Paris delavayi Franch

(Trọng lâu kim tiền)

Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phó Bảng), Cao Bằng (Nguyên Bình),

2 Paris polyphylla Smith

3 Paris dunniana Levl

(Trọng lâu hải nam)

Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Hải An), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Ninh Bình (Cúc Phương), Kon Tum (Kon Plong)

[6]

4 Paris yunnanensis Franch

(Trọng lâu vân nam)

Lào Cai (Sa Pa), Lai Châu

5 Paris chinensis Franch

(Bảy lá một hoa, Tảo hưu)

Lào Cai (Sa Pa), Yên Bái (Nghĩa Lộ), Lai Châu (Tuần Giáo), Phú Thọ (Thanh Sơn), Hà Tây (Ba Vì), Hoà Bình (Lương Sơn, Mai Châu: Pà Cò)

[6]

6 Paris fargesii Franch Sa Pa (Lào Cai) [6]

Trên thế giới chi Paris L có khoảng 22 loài [12], phân bố ở vùng nhiệt

đới và ôn đới, chủ yếu ở châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Butan, Nê pan,

Pakistan, Mianma, Thái lan), châu Âu và châu Mỹ [6]

1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố loài Bảy lá một hoa (Paris chinensis

Franch )

Bảy lá một hoa có tên khoa học : Paris chinensis Franch

Tên đồng nghĩa: P polyphylla Sm var chinensis (Franch.) Hara [5]

Tên khác : Tảo hưu, Thất diệp nhất chi hoa, cúa dô (H’Mông) [1]

Tên nước ngoài: Parisette, Herbe – Paris (Pháp) [1]

Họ Trilliaceae [1], [5]

1.3.1 Đặc điểm thực vật

Cỏ nhiều năm, cao 40 - 100 (130) cm; thân rễ gần hình trụ ngắn, nằm ngang, đường kính khoảng 2 cm; thân trên mặt đất thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông Lá 5 - 6 (7), xếp thành 1 vòng trên thân; phiến lá mỏng, màu lục, hình trứng ngược, hình thuôn, kích thước 25 (27)  5 - 7 cm, 5 - 7 gân chính, xuất phát từ gốc, chóp nhọn, gốc tròn hoặc hình nêm, cuống dài 2,5 - 4 (6) cm Hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, to, đều, lưỡng tính; cuống dài 15 - 40 cm, thẳng đứng Đài 5

- 6 (7), dạng lá, rời nhau, hình mũi giáo, kích thước (3,5) 5 - 8 (9) × (1) 1,5 - 2,5 (3,5) cm, màu lục Cánh hoa 5 - 6 (7), màu vàng, dạng dải, kích thước (3) 4,5 - 6 (7)  0,1 cm, bằng nhau Nhị 10 - 12, dài 1,5 - 3 cm; chỉ nhị dẹp, dài 0,5 - 1,2 cm, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô,

mở bằng khe dọc, đỉnh trung đới kéo dài thành hình kim, dài 1 - 3 mm Bầu thượng, hình trứng, 4 - 5 lá noãn, 5 - 6 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhuỵ 5 - 6, dính nhau phần gốc; đầu nhuỵ 5 - 6 Quả nang, mở ở lưng ô Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nước

hoặc không, có nội nhũ rắn chắc hoặc nạc chứa dầu, mỡ, tinh bột, phôi nhỏ, hình cầu hoặc hình trứng [6]

1.3.2 Sinh thái và phân bố:

Bảy lá một hoa mọc nơi đất ẩm, nhiều mùn, gần bờ nước, khe suối hay hốc đá, dưới tán rừng kín thường xanh ở độ cao trên 600 m Mùa ra hoa tháng

2 - 6, mùa quả tháng 3 - 10 [6], [5]

Bảy lá một hoa phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Yên Bái (Nghĩa Lộ), Lai Châu (Tuần Giáo), Phú Thọ (Thanh Sơn), Hà Tây (Ba Vì), Hoà Bình (Lương Sơn), Mai Châu (Pà Cò) Ngoài ra, Bảy lá một hoa còn có ở Mianma, Trung Quốc, Lào, Thái Lan [6]

1.4.Thành phần hoá học

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Paris L

chỉ ra sự có mặt của các nhóm chất tannin, flavonoid, axid phenolic, saponin [13], [23], đường [1], acid amin [21] Trong đó, thành phần chính là saponin steroid [9], [18]

* Năm 2005, Devkota đã phân lập được 6 chất từ Paris polyphylla gồm

[18]:

+ Przewalskinone B (1,5-Dihydroxy-7-methoxy-3-methylanthraquinon)

+ Polyphyllin C (Diosgenin-3-O[α-L-rhamnopyanosyl

(1—3)-β-D-glucopyranosid)

+ Polyphyllin D (Diosgenin-3-O[α-L-rhamnopyanosyl

(1Rha—2Glu)-α-L-arabinofuranosyl (1Ara4Glu)]-β-D-glucopyranosid)

+ Saponin-1 (Diosgenin-3-O[α-L-rhamnopyanosyl

(1Rha—2Glu)-α-L-rhamnopyranosyl (1Ara4Glu)]-β-D-glucopyranosid)

+ Stigmasterol

+ Stigmasterol-3-O-β-D-glucosid

* Năm 2007, Huang Yun và cộng sự đã phân lập được 12 steroid từ

Parispolyphylla var chinensis [9]

+ Diosgenin

+ Pennogenin

+ Diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(12)-β-D-glucopyranosid + Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(12)-β-D-glucopyranosid + Diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(12)[α-L-

+ 2β,3β,14α,20β,22α,25β hexahydroxycholest-7-en-6-on

+ 2β,3β,14α,20β,24β,25β hexahydroxycholest-7-en-6-on

* Năm 2012 Xu-Jie Qin và CS nghiên cứu về thành phần hóa học của

thân và lá (phần có thể tái sinh được) của Parispolyphylla var yunnanensis

phân lập được một sapogenin và 25 saponin steroidal (1-25), trong đó có 6

glycosid mới, được đặt tên chonglouosid SL-1 SL-6 (1-6) Các cấu trúc này được xác định dựa trên các dữ liệu phổ cộng hưởng từ 1D và 2D và thủy phân

axit Trong số đó, hợp chất 3 và 4 là 23, 27 dihydroxydiosgenin có liên kết đường ở vị trí C-23 và C-27, chất 6 là 27-hydroxyruscogenin Các hợp chất

10, 12, 14, 19, 20, 22 và 25 được phân lập lần đầu tiên từ chi Paris L [15]

Bảng 1.2: Các saponin đƣợc Xu-Jie Qin và CS phân lập từ thân và lá

Paris polyphylla var yunnanensis

STT Cấu tạo khung Nhóm thế

H

R2H

Glc-

* Năm 2012, Xia Wu và CS đã phân lập được 18 saponin steroidal

(26-43) từ thân rễ Paris polyphylla var yunnanensis Các cấu trúc của chúng được

xác định dựa trên các dữ liệu phổ và đặc trưng hóa lý [22]

Bảng 1.3: Các saponin đƣợc Xia Wu và CS phân lập từ thân rễ

Paris polyphylla var yunnanensis [22]

Trong đó:

S1= β-D - apiofuranosyl-[α -L-rhamnopyranosyl-β -D-glucopyranosid

S2= βDglucopyranosyl α Larabinofuranosyl[αLrhamnopyranosyl β

-D-glucopyranosid

S3= β-D-xylopyranosyl- α -L-arabinofuranosyl-β -D-glucopyranosid

S4= -α -L-rhamnopyranosyl- α -L-rhamnopyranosyl- α -L-rhamnopyranosyl-

S9= α -L-rhamnopyranosyl- α -L-rhamnopyranosyl- β -D-glucopyranosid

S10= α -L-arabinofuranosyl-α -L-rhamnopyranosyl- β -D-glucopyranosid

Ngoài ra, phân lập bằng SKC phát hiện 18 acid amin [21]

Tình hình nghiên cứu trong nước:

Các nghiên cứu về Bảy lá một hoa cho thấy thân rễ của loại thảo dược này chứa 7 - 9 % đường [1], sơ bộ chứa các nhóm chất chính là saponin, tanin catechic, sterol, acid amin, polysacharid [7]

Như vậy, những nghiên cứu về thành phần hóa học của Bảy lá một hoa tại Việt Nam còn rất hạn chế

1.5 Tác dụng sinh học

1.5.1 Tác dụng chống ung thƣ

Theo Jing Suna và CS phần chiết ethanol 95% từ Bảy lá một hoa gây ức chế tăng sinh tế bào ung thư gan người (SMMC-7721) phụ thuộc vào thời gian [19]

Các saponin steroidal được phân lập từ thân rễ Paris polyphylla var yunnanensis tại Trung Quốc có tác dụng gây độc trên dòng tế bào ung thư

biểu mô ở người (CNE) Trong đó bảy chất (26, 27, 28, 37, 39, 40, 42) có khả

năng ức chế mạnh hơn chất đối chứng cisplatin với các giá trị IC50 tương ứng là: 5.06, 3.57, 9.50, 1.50, 2.51, 7.28 và 5.92 M Các chất 32, 38, 41, 43 hoạt

tính yếu hơn (IC50 từ 35.58 tới 95.98 M) Các hợp chất còn lại có giá trị IC50 lớn hơn 100 M Ở các nồng độ 0; 0,6; 1,2; 2,4 và 4,8 M chất 37 có tác dụng

ức chế theo chu trình tế bào lần lượt là: 2,33 ± 0,01%, 9,18 ± 3,02%, 21,25 ±

1,99%, 47,89 ± 3,33% và 92,04 ± 2,93% Chất 37 có khả năng kiềm hãm giai

đoạn G1 và S trong chu kỳ tế bào của dòng tế bào CNE Theo Xiao và CS các saponin steroidal bất hoạt tăng sinh của tế bào ung thư biểu mô họng (nasopharyngeal carcinoma cells) có khả năng liên quan tới chết tế bào theo chu trình và kìm hãm sự phát triển tế bào [22]

1.5.2 Tác dụng kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn Propionibacteriumacnes của các chất 2, 3, 6, 8,

9, 11, 13, 17, 18, 21,và 24 thể hiện tương ứng qua giá trị MIC (nồng độ ức

chế tối thiểu) là 62,5, 62,5, 3,9, 16,5, 17,2, 7,8, 39,0, 17,2, 31,3, 62,5, và 31,3

g/ml [15]

1.5.3 Tác dụng trên tim mạch

Glucosid α-paristyphnin chiết từ Bảy lá một hoa gây cảm giác râm ran,

và có tác dụng ức chế trên huyết áp động mạch cảnh, cơ tim và cử động hô hấp, gây co mạch thận, nhưng lại gây giãn mạch lách và các chi [1]

1.5.4 Tác dụng cầm máu

Dịch chiết methanol của thân rễ P polyphylla, P fargesii, P vietnamensis có tác dụng cầm máu trên chuột nhắt [20]

1.5.5 Tác dụng giảm đau

Wang Q, Xu G và Jiang Y tiến hành thử nghiệm thân rễ của 6 loài khác

nhau thuộc chi Paris L đều cho thấy chúng có tác dụng giảm đau [21]

1.5.6 Độc tính

Theo Danbensky, Stepven Clavey và cộng sự, Paris polyphylla có độc

tính nhẹ, ở liều bình thường gần như không có tác dụng phụ, ở liều cao (60 –

90 g) có phản ứng ngộ độc nhẹ, xuất hiện sau 1 – 3 giờ dùng thuốc Biểu hiện: buồn nôn, nôn, ỉa chảy, hoa mắt chóng mặt, đau đầu, da mặt xanh tái, mắt mờ Một số trường hợp có thể gây co thắt, khó thở, loạn nhịp Bột dược liệu có thể gây kích ứng mũi và kết mạc mắt [8]

Công dụng: Thường dùng trị rắn độc cắn và sâu bọ đốt, viêm não nhiễm truyền, viêm mủ da, lao màng não, hen suyễn Còn dùng trị yết hầu, bạch hầu, trẻ em lên sởi có viêm phổi, quai bị, lòi dom

Ngày dùng 6 - 15 g rễ, dạng thuốc sắc; nếu có ác tính, dùng tới 15 - 30 g [5]

Ở Trung Quốc, vị thuốc tảo hưu được chế biến từ thân rễ nhiều loài cây

thuộc chi Paris L mọc ở những tỉnh miền Tây Nam Trung Quốc đã được

dùng chủ yếu làm thuốc chữa sốt, giải độc và chữa ho [1] Cũng có khả năng trị kinh phong lắc đầu, lè lưỡi Cũng có thể trị bệnh phổi và độc giang mai Dân gian thường dùng làm mát khi bị sưng đau và hen suyễn [5]

Một số bài thuốc có Bảy lá một hoa [1]

- Chữa trẻ em kinh sài, tay chân co giật: thân rễ Bảy lá một hoa, sấy khô

tán bột, uống mỗi lần 0,5 - 1 g ngày 4 - 5 lần

- Chữa trẻ em sốt cao co giật, hoặc quai bị, lên sởi và các chứng viêm sưng phát sốt: thân rễ Bảy lá một hoa (4 g), thiên hoa phấn (8 g), bạc hà (12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu cây Bảy lá một hoa tươi thu hái ở Đà Lạt, Lâm Đồng, vào tháng 12 năm 2013 Sau khi nghiên cứu về thực vật, phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa được rửa sạch, thái mỏng, sấy đến khối lượng không đổi ở 55oC Bảo quản trong túi nilon để sử dụng trong quá trình nghiên cứu

Hình 2.1: Phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa sau khi sơ chế 2.1.2 Hoá chất, trang thiết bị

Hoá chất

- Cồn 960, nước cất hai lần, dung môi n-hexan, ethyl acetat, methanol,

cloroform, aceton, dicloromethan

- Các dung môi hóa chất dùng trong phân tích đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

- Bột silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Merck), bột silica gel pha đảo YCM (30 - 50 µm, FuJi Silisa Chemical Ltd.)

- SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254(Merck) (silica gel, 0.25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0.25 mm)

- Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại có hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol hơ nóng

- Các dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm: cột sắc ký, bình cầu, bình nón, ống đong, ống nghiệm,…

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI)

- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

- Bếp điện, bếp đun cách thủy

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR

- Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV

- Máy scan CanoScan LiDe 100

- Máy siêu âm Power sonic 405

- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Phổ tử ngoại được ghi trên máy UV-VIS Cary Khoa phân tích - Viện Dược liệu

- [α]D đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter

- Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên, VKH&CNVN

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 NMR của Viện Hoá học, VKH&CNVN

FT-2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật

Mẫu tiêu bản tươi (có đủ tiêu chuẩn để định loại bao gồm cơ quan sinh sản (hoa), và cơ quan sinh dưỡng (cành non, lá) cùng các thông tin ghi chép tại thực địa) thu hái tại Trung tâm cây thuốc Đà Lạt – Lâm Đồng – Viện dược liệu (ký hiệu: P8) được gửi sang Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam để giám định tên khoa học

2.2.2 Nghiên cứu về hoá học

+ Phương pháp phân lập và tinh chế chất tinh khiết:

Sử dụng các phương pháp: SKLM, SKC, rửa, kết tinh để phân lập chất

sau đó ứng dụng các phương pháp phổ để xác định cấu trúc

Cấu trúc các hợp chất phân lập được xác định dựa trên các thông số vật

lý như điểm nóng chảy, độ tan, và các phương pháp phổ bao gồm: phổ hồng ngoại, tử ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu chiết xuất và phân lập chất tinh

khiết từ phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa

Chiết 3 lần bằng EtOH 800 thu hồi dung môi

Dịch nước Bảy lá một hoa (phần dưới mặt đất)

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu thực vật

Mẫu thực vật được thu hái vào tháng 12/ 2013 tại Trung tâm cây thuốc

Đà Lạt – Viện dược liệu Quan sát thấy các đặc điểm sau (Hình 3.1):

Cây thảo, mọc thẳng đứng, cao khoảng 120 cm; thân rễ gần hình trụ ngắn, màu nâu đỏ, đường kính khoảng 2 - 3 cm, có những ngấn ngang; thân trên mặt đất màu xanh, mọc thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh Lá có màu lục, cuống dài 3 cm, phiến lá mỏng, mép nguyên, xếp thành 1 vòng 6 lá trên thân, cách gốc khoảng 40 cm, 5 gân chính, xuất phát từ gốc, chóp nhọn, gốc hình nêm Hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, to, đều, cuống hoa dài 80 cm, thẳng đứng Đài 6, dạng lá, rời nhau, hình mũi giáo, kích thước 8×2,5 cm, màu lục Cánh hoa 6, màu vàng, dạng dải, kích thước 4,5 0,1 cm, bằng nhau Nhị nhiều, dài 2 cm Bầu thượng, hình trứng, màu tím đỏ

Qua nghiên cứu đặc điểm thực vật cây Bảy lá một hoa, đối chiếu với các tài liệu chuyên khoa phân loại thực vật như: ―Thực vật chí Việt Nam‖ [6],

―Thực vật chí Trung Quốc‖, với sự giúp đỡ của PGS TS Vũ Xuân Phương cùng các chuyên gia thực vật, chúng tôi giám định mẫu cây Bảy lá một hoa

thu hái ở Đà Lạt – Lâm Đồng có tên khoa học là Paris chinensis Franch (Phụ

lục 1) họ Trọng lâu (Trilliaceae)

Hình 3.1: Mẫu cây BLMH thu hái ở Đà Lạt – Lâm Đồng

Lá và hoa Cuống hoa và Hoa

Tràng, nhị, nhuỵ

Cả cây Thân rễ

+ Hiện tượng: có nhiều bọt xuất hiện bền vững

Kết luận: Dược liệu có chứa nhiều saponin

3.2.2 Định tính alcaloid

+ Thiết kế thí nghiệm: Lấy 0,5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung

tích 50 ml, thêm 15 ml dung dịch H2SO4 1N Đun sôi, để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH 9 - 10 Chiết alcaloid bằng cloroform (CHCl3) 3 lần, mỗi lần 5 ml Dịch chiết cloroform được gộp lại và lắc với H2SO4 1N Gạn lấy lớp nước acid, cho vào

3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1 ml rồi thêm vào từng ống 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau: Ống 1: TT Mayer; Ống 2: TT Dragendorff; Ống 3: TT

Bouchardat

+ Hiện tượng:

Ống 1: Dung dịch trong suốt, không có tủa vàng nhạt

Ống 2: Dung dịch trong suốt, không có tủa vàng cam

Ống 3: Dung dịch trong suốt, không có tủa nâu

Kết luận: Dược liệu không có alcaloid

3.2.3 Định tính glycosid tim

+ Thiết kế thí nghiệm: cho 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100

ml Thêm 100 ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 h Gạn lấy dịch chiết vào cốc có

mỏ dung tích 100 ml Thêm vào dịch chiết 3 ml chì acetat 30% khuấy đều Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào cốc cỏ mỏ dung tích 100 ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại

và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn Lắc kỹ 2 lần với CHCl3: MeOH (4: 1) mỗi lần 8 ml Gạn dịch chiết CHCl3 vào cốc cỏ mỏ, loại nước bằng Na2SO4 khan Chia đều dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:

Phản ứng Liebermann-Burchardt: cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống nghiệm 450, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống

Hiện tượng: Ở giữa hai lớp chất lỏng có vòng màu đỏ tím

Phản ứng Legal: hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 900 Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussinat 0,5% và hai giọt dung dịch NaOH 10%

Hiện tượng: Lắc đều, không thấy xuất hiện màu đỏ cam

- Phản ứng Baljet: cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 90%

Lắc đều cho tan hết cắn

Hiện tượng: Khi nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet, không thấy xuất hiện màu đỏ cam

Kết luận: Dƣợc liệu không có glycosid tim

Chuẩn bị dịch chiết cồn: cân 20 g bột dược liệu cho vào bình nón dung

tích 100 ml Thêm 50 ml cồn 800, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng Dùng

dịch lọc làm các phản ứng định tính flavonoid và coumarin sau:

3.2.4 Định tính flavonoid

- Phản ứng cyanidin: cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít

bột magie kim loại Nhỏ từng giọt HCl đặc (3 - 5 giọt)

Hiện tượng: Để yên một vài phút, dung dịch không chuyển từ màu vàng sang màu đỏ

- Phản ứng với kiềm: Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc,

hơ khô rồi đặt mảnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc Không thấy màu vàng hiện rõ

- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm vào 2 - 3 giọt dd FeCl3 Không có tủa màu xanh đen

Kết luận: Dƣợc liệu không có flavonoid.

3.2.5 Định tính coumarin

Phản ứng mở và đóng vòng lacton:

Thiết kế thí nghiệm: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết cồn, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên

Đun cả 2 ống nghiệm cách thủy đến sôi, để nguội Quan sát thấy ống 1

có màu tủa đục màu nâu, ống 2 trong suốt

Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều Quan sát thấy tủa ống 2 tan, dung dịch trong, ống 1 không có hiện tượng gì; acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 nhạt màu hơn, cả hai ống dung dịch trong suốt

Quan sát hiện tượng huỳnh quang:

Nhỏ 2 - 3 giọt dịch chiết cồn lên một khoang giấy thấm Nhỏ 2 - 3 giọt dung dịch NaOH 5% lên vị trí có dịch chiết, sấy nhẹ Che 1 phần diện tích