Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của rễ cây đan sâm (salvia miltiorrhiza bunge) trồng ở tỉnh lào cai

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LẠI THỊ THẮM BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA RỄ CÂY ĐAN SÂM Salvia miltiorrhiza Bunge TRỒNG Ở TỈNH LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ N

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LẠI THỊ THẮM

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN

HÓA HỌC CỦA RỄ CÂY

ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza Bunge)

TRỒNG Ở TỈNH LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI- 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LẠI THỊ THẮM

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN

HÓA HỌC CỦA RỄ CÂY

ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza Bunge)

1 Bộ môn Dược học cổ truyền, ĐH Dược Hà Nội

2 Khoa Y Dược, ĐH Quốc gia Hà Nội

HÀ NỘI- 2015

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Bùi Hồng Cường- Giảng viên Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội, TS Vũ Đức Lợi- Phó Chủ nhiệm Bộ môn Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các giảng viên, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược HN và Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia

Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận, cũng như xin gửi lời cảm ơn đến tất cả quý thầy cô trong trường đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho tôi trong suốt 5 năm theo học tại trường

Tôi cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn theo sát động viên, quan tâm

và tạo điều kiện giúp tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Lại Thị Thắm

MỤC LỤC Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Vị trí phân loại chi Salvia L 2

1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Salvia L 2

1.2.1 Đặc điểm thực vật 2

1.2.2 Phân bố và sinh thái 3

1.3 Thành phần hóa học của chi Salvia L 4

1.3.1 Diterpenoid 4

1.3.2 Các dẫn xuất của Acid phenolic 6

1.3.3 Flavonoid 7

1.3.4 Một số thành phần khác 8

1.4 Tác dụng sinh học của chi Salvia L 9

1.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền 10

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 12

2.1.1 Nguyên liệu 12

2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị 13

2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

2.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong rễ đan sâm 13

2.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc một số hợp chất có trong rễ Đan sâm 15

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 18

3.1 Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học 18

3.1.1 Định tính các nhóm chất bằng phương pháp hóa học 18

3.1.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 20

3.2 Phân lập một số hợp chất trong đan sâm 24

3.2.1 Chiết các phân đoạn từ rễ đan sâm 24

3.2.2 Phân đoạn các chất bằng sắc ký cột 25

3.2.3 Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được 26

3.3 Bàn luận 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

15 UV- VIS : Phổ tử ngoại- khả kiến

16 YMC : Sắc ký cột pha đảo

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình vẽ,

Hình 1.4 Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi Salvia L 8

Hình 2.1 Một số hình ảnh cây Đan sâm ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Đan sâm (tên khoa học Salvia miltiorrhiza Bunge) là một dược liệu quý

được sử dụng nhiều trong Y học cổ truyền Từ xưa, các thầy thuốc Đông y đã lưu truyền câu ngạn ngữ “Nhất vị Đan sâm, công đồng Tứ vật thang”, nghĩa là chỉ một

vị thuốc Đan sâm cũng có tác dụng ngang với cả bài thuốc Tứ vật (gồm 4 vị thục địa, đương quy, bạch thược, xuyên khung, là bài thuốc “bổ huyết hoạt huyết” kinh điển của Đông y) Nghiên cứu y học hiện đại cho thấy đan sâm đặc biệt tốt cho tim mạch, làm giãn mạch và tăng lưu lượng động mạch vành, cải thiện vi tuần hoàn, phòng chống tích cực tình trạng thiếu máu, làm chậm việc hình thành mảng xơ vữa động mạch [7]

Ở Việt Nam, Đan sâm đã được di thực từ những năm 1960 từ Trung Quốc, cây được nhập trồng ở các trại thuốc Sa Pa, Tam Đảo và Hà Nội Tuy nhiên sau một thời gian dài cây không được quan tâm nhiều nên không phát triển trồng trọt, do đó, dược liệu Đan sâm được sử dụng trong nước đều phải nhập từ Trung Quốc Theo các chuyên gia về dược học cổ truyền nhận định, dược liệu Đan sâm sử dụng hiện nay ở nước ta có nguồn gốc không rõ ràng, chất lượng không ổn định, thậm chí một

số đã bị chiết xuất hoạt chất Vì vậy, thời gian gần đây, cây Đan sâm đang được quan tâm và khôi phục lại việc trồng và phát triển ở một số vùng dược liệu trong nước

Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến thời điểm này chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của dược liệu Đan sâm Để góp phần cung cấp những cơ sở tiền

đề cho việc sử dụng, bảo tồn và phát triển loài Đan sâm làm thuốc ở Việt Nam,

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học

của rễ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) trồng ở tỉnh Lào Cai” nhằm

mục tiêu như sau:

1 Định tính các nhóm chất trong rễ cây Đan sâm

2 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc một số chất từ rễ cây Đan sâm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại chi Salvia L

Theo hệ thống phân loại thực vật Takhtajan (2009) [28], vị trí phân loại của

chi Salvia là:

Giới thực vật: Planta

Ngành Ngọc lan: Magnolyophyta Lớp Ngọc lan: Magnolyopsida Phân lớp bạc hà: Lamiidae

Bộ hoa môi: Lamiales

Họ hoa môi: Lamiaceae Chi: Salvia

1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Salvia L

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Các loài thuộc chi Salvia L là cây cỏ hay cây bụi nhỏ Lá đơn hay lá kép

lông chim, mọc đối dọc thân hay tập trung ở dưới gốc Cụm hoa dạng chùm, dạng chùy hay dạng bông ở đỉnh cành Lá bắc có màu hay không, tồn tại hay sớm rụng Đài hình chuông, hình trứng hay có dạng ống, 2 môi: môi trên 3 thùy hay hàn liền thành 1 thùy; môi dưới 2 thùy Tràng có ống ít nhiều thò khỏi đài, 2 môi: môi trên 2 thùy; môi dưới 3 thùy Nhị 4, nhưng chỉ có 2 nhị trên hữu thụ, 2 nhị dưới thoái hóa; chỉ nhị ngắn; trung đới kéo dài thành dạng đòn bẩy; bao phấn 2 ô Bầu nhẵn hay có lông; vòi nhụy xẻ 2 thùy ở đỉnh Đĩa mật có thùy trước phát triển Quả hình trứng hay hình 3 góc, nhẵn [10, 15]

Cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) còn gọi là huyết sâm, xích sâm,

huyết căn là cây cỏ sống lâu năm, cao 30-80 cm, toàn thân mang lông ngắn màu

vàng trắng nhạt Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5 cm, màu đỏ nâu Thân vuông trên có các gân dọc Lá kép, mọc đối: 3-5 lá chét, đặc biệt có thể có 7 Lá chét mọc giữa thường lớn hơn cả Lá kép có cuống dài, cuống lá chét ngắn có dìa

Lá chét dài 2-7,5cm, rộng 0,8-5cm Mép lá chét có răng cưa tù Mặt trên lá chét màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh tro, cũng có lông nhưng dài hơn Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá thành nhiều múi nhỏ Cụm hoa mọc thành chùm ở đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm Hoa mọc vòng, mỗi vòng 3-10 hoa, thường là 5 hoa Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, 2 môi, môi trên trông nghiêng hình lưỡi liềm, môi dưới xẻ 3 thùy, thùy giữa có răng cưa tròn Hai nhị ở môi dưới, bầu có vòi dài lòi ra ở môi trên Quả nhỏ, dài 3mm, rộng 1.5mm [7, 8]

1.2.2 Phân bố và sinh thái

Chi Salvia L là chi lớn nhất trong họ Lamiaceae, bao gồm khoảng gần 1000

loài [21, 22], được phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ẩm và cận nhiệt đới Chỉ có ít

loài ở vùng nhiệt đới [7] Cụ thể: Chi Salvia L được phân bố chủ yếu ở 3 vùng trên

thế giới, đó là: miền Trung và miền Nam Mỹ (khoảng 500 loài), Trung Á/ Địa Trung Hải (khoảng 200 loài) và khu vực Đông Á (khoảng 100 loài) [22]

Ở Việt Nam hiện nay đã phát hiện có 9 loài thuộc chi Salvia L., bao gồm: S

sonchifolia, S eberhardtii, S scapiformis, S miltiorrhiza, S japonica, S splendens,

S coccinea, S farinacea, S plebeia được phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc như:

Hà Giang, Tuyên Quang, Hòa Bình, Lào Cai, Yên Bái, Hà Nội, Vĩnh Phúc, Cao Bằng, Bắc Cạn, Sơn La Một số ít có ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế [9, 13, 15, 32]

S miltiorrhiza được phân bố rộng rãi ở miền Bắc Trung Quốc Nó cũng có

mặt tại Nhật Bản [21] Cây Đan sâm Việt Nam có nguồn gốc Trung Quốc [7] thích hợp với đất cát ẩm, được trồng bằng rễ vào mùa xuân [6] Cây trồng ở trại thuốc Sa

Pa (Viện Dược liệu) tỏ ra thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao Cây sinh trưởng phát triển tương đối tốt, ra hoa quả hàng năm, hạt giống thu được

đã gieo đi gieo lại nhiều năm Một số cây đưa xuống trại thuốc Tam Đảo (Viện Dược liệu) sinh trưởng kém hơn [7] Cây trồng tốt nhất vào tháng 2-3 để đến tháng 11-12 thu hoạch [7] Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo), mùa quả tháng 6-9 [8] Thu hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [6]

1.3 Thành phần hóa học của chi Salvia L

Cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học

của các loài thuộc chi Salvia L Thành phần hóa học chính trong chi Salvia L là

acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và một số thành phần khác Bộ phận trên mặt đất của những loài này có chứa flavonoid, triterpenoid và monoterpenoid đặc biệt là trong hoa và lá Trong khi đó, diterpenoid và acid phenolic lại được tìm thấy chủ yếu ở rễ [22]

1.3.1 Diterpenoid

Diterpenoid là nhóm thường xuyên có mặt ở chi Salvia L bao gồm rất nhiều

chất có cấu trúc khác nhau được phân thành 4 phân nhóm là abietane diterpenoid, clerodane diterpenoid, pimarane diterpenoid và labdane diterpenoid Ngoại trừ các

loài Salvia L ở Mỹ có chứa thành phần clerodane diterpenoid ở bộ phận trên mặt

đất, các loài còn lại có chứa chủ yếu là loài abietane diterpenoid ở trong rễ, clerodane diterpenoid và labdane diterpenoid thì ít hơn [21]

Thành phần chính trong nhóm abietane diterpenoid là các tanshinone như tanshinone I, II và III, sau đó đến isotanshinone I và II, isocryptotanshinone và cryptotanshinone [21] (hình 1.1)

19-21.Tanshinone I, II, III 24 Isocryptotanshinone

22-23 Isotanshinone I, II 25 Cryptotanshinone

Hình 1.1 Cấu trúc một số abietane diterpenoidClerodane diterpenoid là nhóm được tìm thấy nhiều nhất trong các loài

Salvia L Mỹ và ít hơn là abietane diterpenoid, chúng nằm ở bộ phận trên mặt đất

Thuộc nhóm này phải kể đến acid melisodoric, languiduline, salvigenolide (hình 1.2),…và nhiều chất khác nữa [21]

67 Acid melisodoric 68 Languiduline 69 Salvigenolide

Hình 1.2. Cấu trúc một số chất thuộc nhóm clerodane diterpenoid

Labdane diterpenoid và pimarane diterpenoid là loại diterpenoid ít gặp hơn

trong các loài Salvia L Một số chất thuộc 2 nhóm này là sclareol, 6α-

hydroxysclareol, acid 7β- hydroxysandracopimaric và acid 14- oxopimaric (hình 1.3)

79 Sclareol 80 6α- hydroxysclareol

81 Acid 7β- hydroxysandracopimaric 82 Acid 14- oxopimaric

Hình 1.3 Cấu trúc một số chất thuộc nhóm labdane và pimarane diterpenoid 1.3.2 Các dẫn xuất của Acid phenolic

Các Acid phenolic là thành phần chính trong nhóm chất tan được trong nước

của các loài thuộc chi Salvia L đặc biệt là trong các loài Salvia L Trung Quốc

Thành phần chính của nhóm này là acid rosmarinic và các acid salvianolic từ A- K [23]

Acid caffeic đóng vai trò trung tâm trong tác dụng sinh hóa của họ Lamiaceae, trong đó dạng dimer là quan trọng nhất như acid rosmarinic Acid caffeic bao gồm 5 loại:

- Acid caffeic monomer: là thành phần thường xuyên có mặt trong chi Salvia L

và đại diện là acid caffeic và acid 3-(3,4-dihydroxyphenyl) lactic Sau đó phải

kể đến danshensu, acid isoferulic và nhiều chất khác nữa

- Acid caffeic dimer: thành phần quan trọng nhất là acid rosmarinic Ngoài ra còn

có acid przewalskinic A, acid salvianolic B, F, G

- Acid caffeic trimer: bao gồm acid lithospermic, acid Salvianolic I, K, H và nhiều chất khác nữa

- Acid caffeic tetramer: điển hình là 3 methyl ester của acid lithospermic B có tên

là 9’- và 9’’’- monomethyl lithospermate B và dimethyl lithospermate B [23]

- Các acid oligomer caffeic cao hơn: ví dụ có acid yunnaneic A và B được tìm

thấy trong S yunnanesis là acid caffeic hexamer

Ngoài thành phần chính là các acid ceffeic, nhóm polyphenol còn bao gồm các

phenolic glycosid Thành phần này có mặt không phổ biến ở trong chi Salvia L Một số chất thuộc nhóm này từ S officinalis là 6-O-feruloyl-α- và β-glucose; 1-O-

(2,3,4-trihydroxy-3-methyl)butyl-6-O-feruloylglucoside; 6-O-caffeoyl-1-O- fructosyl-α-glucoside; 1-O-caffeoyl-6-O-apiosylglucoside và 1-O-ρ-

hydroxybenzoyl-6-O-apiosylglucoside Từ S prionitis có prionitisides A và B [23]

- Flavone và flavonol glycoside: các flavone O-glycoside xuất hiện phổ biến

trong các loài thuộc chi Salvia L và nhiều nhất trong số đó là các flavone

7-glycoside như apigenin 7-glucoside (cosmosiin), luteolin 7-glucoside (cinaroside) và các 7-glucuronide tương ứng của chúng

- Các flavonoid khác như: các anthocyanin là thành phần có mặt rất nhiều trong

các hoa đỏ hay đỏ tía ở các loài thuộc chi Salvia L

1.3.4 Một số thành phần khác

Triterpenoid phổ biến nhất và được tìm thấy trong tất cả các loài thuộc chi

Salvia L là acid ursolic và acid oleanolic (hình 1.4) Ngoài ra còn tìm thấy 1 số

triterpenoid khác như anagadiol, taraxerol acetate, germanicol (hình 1.4), navidiol,…[21]

Ngoài ra còn có Tanin và một số thành phần khác [23]

1 Acid ursolic 2 Acid oleanolic 3 Anagadiol 4 Taraxerol 5.Germanicol

Hình 1.4 Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi Salvia L

Trong loài Đan sâm, thành phần hóa học được phân thành 3 nhóm chính [7, 16], đó là:

- Phenol và acid phenolic: danshensu, acid rosmarinic, methyl ester của acid rosmarinic, các acid salvianolic A,B,C,G; acid lithospermic, dimethyl ester của acid lithospermic Acid phenolic là các chất tan trong nước

- Các hợp chất diterpen: là các chất tan trong nước và có hơn 30 loại diterpenquinon Trong đó có 3 hoạt chất có tác dụng dược lý là tanshinone I, tanshinon IIA và cryptotanshinone Tỉ lệ các tanshinon quinon là tanshinone I từ 0,12-0,32%, tanshinone IIA từ 0,02-0,32%, methylen tanshinquinon là 0,05-0,15%

- Các thành phần khác: β- sitosterol, tanin, vitamin E Ngoài ra còn có thành phần

là polysaccarid [31]

1.4 Tác dụng sinh học của chi Salvia L

Các dẫn xuất của acid caffeic và các diterpenoid là thành phần có mặt chủ

yếu trong các loài thuộc chi Salvia L đều có hoạt tính sinh học Các dẫn xuất của

acid caffeic có hoạt tính sinh học quan trọng là chống oxi hóa, chống đông máu, chống thiếu máu cục bộ và tái tưới máu, chống tăng huyết áp, chống xơ hóa, kháng virus và có tác dụng ức chế ung bướu Diterpenoid có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, bao gồm: chống oxy hóa, chống kết tập tiểu cầu, , làm tăng lưu lượng máu mạch vành, bảo vệ cơ tim trong thiếu máu cục bộ, chống vi khuẩn, ức chế ung bướu, chống ung thư [22]

Chi Salvia L được sử dụng cho hơn 60 bệnh khác nhau từ đau nhức cho đến

động kinh và chủ yếu được dùng để điều trị cảm lạnh, viêm phế quản, bệnh xuất huyết và rối loạn kinh nguyệt [22]

Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài Salvia

miltiorrhiza Bunge Các tác dụng đã được chứng minh bao gồm:

- Làm giãn mạch vành, chống huyết khối, chống thiếu máu cục bộ Các tác dụng này do các thành phần tanshinone IIA, acid rosmarinic, danshensuan B, acid salvinolic B, militrone và salvinone Ngoài ra, Đan sâm còn được chứng minh

có tác dụng chống đau thắt ngực [7, 12, 16, 18, 21,32]

- Tác dụng làm hạ đường huyết do có chứa thành phần là acid polyphenolic [18]

- Rễ đan sâm có tác dụng hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở tế bào [11, 21]

- Tác dụng an thần do thành phần miltirone, do đó được sử dụng điều trị chứng mất ngủ [2, 21]

- Dịch chiết đan sâm có tác dụng chống vi khuẩn, kể cả vi khuẩn Staphylococus

kháng thuốc Các thành phần như dihydrotanshinone I, hydroxytanshinone II-A, kryptotanshinone, methyl tanshinate và tanshinone II-B được chứng minh có tác

dụng chống vi khuẩn Staphylococus aureus [7, 21, 30, 32]

- Chống nấm, tốt cho trường hợp nấm ngoài da, mụn trứng cá, rụng tóc, ngứa và mày đay [21]

- Hoạt tính chống viêm do có thành phần tanshinone IIA có tác động trên hệ miễn dịch [12]

- Hoạt tính chống oxy hóa mạnh gây bởi dihydrotanshinone I [21], acid salvinolic

A, B, acid rosmarinic [7], và các chất thuộc nhóm polysaccarid [31]

- Mang lại lợi ích cho bệnh nhân suy thận mạn tính [21]

- Tanshinone IIA còn có tác dụng chống ung thư [24, 27]

- Đan sâm có tác dụng làm mềm và thu nhỏ thể tích của gan và lá lách khi sưng to

do bệnh gan và huyết hấp trùng, có tác dụng an thần, gây ngủ và tác dụng làm giảm các huyết quản nhỏ [5]

- Ngoài ra, tanshinone trong đan sâm còn có tác dụng lên hormon sinh dục: làm tăng nhẹ estrogen và androgen trên chuột [32]

1.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Dưỡng tâm an thần: dùng trong các bệnh tâm hồi hộp, mất ngủ, suy nhược thần kinh; dùng trong bệnh co thắt động mạch vành tim, phối hợp với đương quy, táo nhân [5, 7] Ngoài ra còn dùng để chữa bệnh nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực, tâm hư phiền nhiệt [21]

- Bổ huyết: có thể dùng đối với các bệnh thiếu máu, đặc biệt đối với các bệnh mặt nhợt nhạt, xanh xao của phụ nữ chưa có chồng Khi dùng với tính chất bổ huyết thì dùng đan sâm dạng không qua chế biến [4, 5]

- Bổ can tỳ: dùng trong các trường hợp gan và lá lách bị sưng to, trị bệnh huyết hấp trùng đều có hiệu quả [4, 5]

- Giải độc: dùng trong các trường hợp sang lở, mụn nhọt [5]

- Đây còn được xem là thuốc dùng tốt cho trường hợp đau dạ dày hay viêm vú [7, 21]

- Đan sâm còn được dùng để điều trị các bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận mạn tính, tiểu đường và các biến chứng của tiểu đường [18]

Liều dùng: 8-20g [5]

Chú ý: không dùng chung với Lê lô [3]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Rễ Đan sâm được thu hái ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào Cai vào tháng 5 năm

2014 (hình 2.1) lưu tại Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Mẫu thực vật đã được TS Phạm Thanh Huyền, Trưởng

Khoa Tài Nguyên cây thuốc Viện Dược liệu giám định tên khoa học là: Salvia

miltiorrhiza Bunge (PL1)

Hình 2.1 Một số hình ảnh cây Đan sâm ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào Cai

Rễ Đan sâm được rửa sạch, làm khô và thái nhỏ, bảo quản để nghiên cứu thành phần hóa học và chiết xuất, phân lập

2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị

- Máy Kofler micro- hotstage để đo nhiệt độ nóng chảy

- Máy DIP-360 digital polarimeter để đo góc quay cực

- Máy Jasca 200 để đo phổ UV- VIS

- Máy Agilent 1200 HPLC- MS để đo phổ khối lượng

- Máy JEOL ECX 400 NMR Spectrometer để đo phổ cộng hưởng hạt nhân

- Hệ thống máy chấm sắc ký: thiết bị bơm mẫu tự động (CAMAG- LINOMAT5, buồng chụp ảnh (CAMAG), bình triển khai sắc ký, bình phun sắc ký, máy tính với phần mềm hỗ trợ Wincats và Video Scan

- Pipet, ống nghiệm, bình nón, bình chiết…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong rễ đan sâm

2.2.1.1 Định tính bằng phương pháp hóa học

Chiết xuất lấy dịch chiết bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau (nước, ethanol, ether) để định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học [1, 2]

- Điều kiện sắc ký

 Pha tĩnh Bản mỏng SKLM Siliga gel GF254 (Merck), kích thước 3×10 cm, hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ.:

 Pha động: khảo sát các hệ dung môi sau:

 Hệ 1: Ethylacetat- Acid acetic- Nước (8:2:1)

 Hệ 2: Butanol- Ethanol (10:2)

 Hệ 3: Cloroform- Methanol (19:1)

 Hệ 4: Cloroform- Methanol (9,2:0,8)

 Hệ 5: Cloroform- Methanol- Nước (6,5:3,5:1)

 Hệ 6: Ethylacetat- Methanol- Nước (10:1,7:1,3)

 Hệ 7: Ethylacetat- Methanol- Nước (10:2:5)

 Hệ 8: Ethylacetat- Acid formic- Nước (8:1:1)

 Hệ 9: Ethylaccetat- Methanol (8:2)

 Hệ 10: Cloroform- Butanol (18:1)

 Hệ 11: Cloroform- Ethylacetat- Acid formic (5:5:1)

 Hệ 12: Cloroform- Acid acetic- Nước (5:4,5:0,5)

 Phát hiện: bằng cách quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và 366nm Chụp lại sắc ký đồ bằng máy chụp Camag TLC Visualier

2.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc một số hợp chất có trong rễ Đan sâm

2.2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất

Rễ đan sâm sơ chế được ngâm chiết kỹ 3 lần bằng dung môi Ethanol 80% , sử dụng thiết bị siêu âm ở 40oC Lọc các dịch chiết ethanol qua giấy lọc, gộp dịch lọc

và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết tổng ethanol

Phân tán cao chiết ethanol này trong nước cất và chiết phân bố bằng n- hexan

và ethyl acetat (3 lần) Các phân đoạn n- hexan, ethyl acetat được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng

2.2.2.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây cũng như phân lập các hợp chất, các phương pháp sắc ký đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột (CC), sắc ký pha đảo

Sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm Kieselgel

60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu

Sắc ký lớp mỏng điều chế (pTLC): được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60G F254 1.0 mm (Merck 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% hơ nóng để phát hiện chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất bằng dung môi thích hợp

Sắc ký cột (CC): được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040- 0,063 mm (230- 400 mesh, Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Nhật Bản) Silicagel pha đảo YMC ODS-A (50µm, YMC Co Ltd., Kyoto, Nhật Bản)

2.2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đề cập trong các tài liệu là sự kết hợp giữa việc xác định các thông số vật lý và các phương pháp phổ hiện đại, bao gồm:

- Điểm nóng chảy (Mp): điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro- hotstage của khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Góc quay cực được đo bằng máy DIP- 360 digital polarimeter (JASCA, Easton, USA) của khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS): phổ tử ngoại- khả kiến UV-VIS được ghi trên máy Jasco 200 của khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Phổ khối lượng (MS): phổ khối lượng được ghi trên máy Agilent 1200 HPLC- MSD ((Electrospray ionization source-ESI) của Khoa dược, Đại học Quốc tế Nagasaki, Nhật Bản

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên máy JEOL ECX 400 NMR Spectrometer của khoa Dược, Đại học Quốc tế Nagasaki, Nhật Bản)

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học

- Chiết xuất dịch chiết nước để làm các phản ứng định tính tanin, acid hữu cơ, acid amin, đường khử Định tính tannin bằng các phản ứng với FeCl3 5%, gelatin 1%

và chì acetat 10% Định tính acid hữu cơ bằng phản ứng với Na2CO3 Định tính acid amin bằng phản ứng với thuốc thử Ninhydrin Định tính đường khử bằng phản ứng với thuốc thử Fehling

- Chiết xuất dịch chiết ether dầu hỏa để làm các phản ứng định tính sterol, chất béo, carotene

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong Đan sâm được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phương pháp hóa học

6 Coumarin Pư đóng mở vòng lacton - Không có

7 Tanin

Có

Pư với chì acetat 10% +++

9 Acid amin Pư với thuốc thử Ninhydrin - Không có

12 Sterol Pư với H2SO4/ anhydrid acetic + Có

Ghi chú: (-) âm tính, (+) dương tính, (+++) dương tính rõ

Nhận xét: Bằng các phản ứng hóa học sơ bộ nhận thấy dược liệu Đan sâm ở

Lào Cai có các nhóm hợp chất glycosid tim, tanin, acid hữu cơ, đường khử, sterol

và caroten

3.1.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Qua khảo sát các hệ dung môi khác nhau, thu được 4 hệ dung môi cho kết quả tách vết tốt, đó là:

3.1.2.1 Hệ 1: Ethylacetat- Acid acetic- Nước (8:2:1)

Kết quả định tính bằng SKLM với hệ 1 được thể hiện ở hình 3.1 và bảng 3.2

Hình 3.1.SKĐ dịch chiết methanol ở bước sóng 254nm khi chạy SKLM với hệ 1

Bảng 3.2 Kết quả phân tích SKĐ ở bước sóng 254nm khi chạy SKLM với hệ 1

3.1.2.2 Hệ 4: Cloroform- Methanol (9,2:0,8)

Kết quả định tính bằng SKLM với hệ 4 được thể hiện ở hình 3.2 và bảng 3.3

Hình 3.2.SKĐ dịch chiết methanol ở bước sóng 366nm khi chạy SKLM với hệ 4

Bảng 3.3.Kết quả phân tích SKĐ ở bước sóng 366nm khi chạy SKLM với hệ 4