- Mục đích: Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hóa học có trong thân rễ Bảy lá một hoa.
- Tiến hành: Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu theo phương pháp hóa học [2], [3].
3.2.1. Định tính saponin
+ Thiết kế thí nghiệm: cho vào ống nghiệm to 2 g bột dược liệu, thêm vào 5 ml nước cất, lắc mạnh trong 5 phút, quan sát hiện tượng tạo bọt trong 15 phút.
+ Hiện tượng: có nhiều bọt xuất hiện bền vững.
Kết luận: Dược liệu có chứa nhiều saponin
3.2.2. Định tính alcaloid
+ Thiết kế thí nghiệm: Lấy 0,5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 15 ml dung dịch H2SO4 1N. Đun sôi, để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH 9 - 10. Chiết alcaloid bằng cloroform (CHCl3) 3 lần, mỗi lần 5 ml. Dịch chiết cloroform được gộp lại và lắc với H2SO4 1N. Gạn lấy lớp nước acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1 ml rồi thêm vào từng ống 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau: Ống 1: TT Mayer; Ống 2: TT Dragendorff; Ống 3: TT Bouchardat
+ Hiện tượng:
Ống 1: Dung dịch trong suốt, không có tủa vàng nhạt. Ống 2: Dung dịch trong suốt, không có tủa vàng cam. Ống 3: Dung dịch trong suốt, không có tủa nâu.
3.2.3. Định tính glycosid tim
+ Thiết kế thí nghiệm: cho 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml. Thêm 100 ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 h. Gạn lấy dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100 ml. Thêm vào dịch chiết 3 ml chì acetat 30% khuấy đều. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào cốc cỏ mỏ dung tích 100 ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat. Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn. Lắc kỹ 2 lần với CHCl3: MeOH (4: 1) mỗi lần 8 ml. Gạn dịch chiết CHCl3 vào cốc cỏ mỏ, loại nước bằng Na2SO4 khan. Chia đều dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:
Phản ứng Liebermann-Burchardt: cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống nghiệm 450, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Hiện tượng: Ở giữa hai lớp chất lỏng có vòng màu đỏ tím.
Phản ứng Legal: hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 900. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussinat 0,5% và hai giọt dung dịch NaOH 10%.
Hiện tượng: Lắc đều, không thấy xuất hiện màu đỏ cam.
- Phản ứng Baljet: cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn.
Hiện tượng: Khi nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet, không thấy xuất hiện màu đỏ cam.
Chuẩn bị dịch chiết cồn: cân 20 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml. Thêm 50 ml cồn 800, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng định tính flavonoid và coumarin sau:
3.2.4. Định tính flavonoid
- Phản ứng cyanidin: cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại. Nhỏ từng giọt HCl đặc (3 - 5 giọt).
Hiện tượng: Để yên một vài phút, dung dịch không chuyển từ màu vàng sang màu đỏ.
- Phản ứng với kiềm: Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc, hơ khô rồi đặt mảnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc. Không thấy màu vàng hiện rõ.
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm vào 2 - 3 giọt dd FeCl3. Không có tủa màu xanh đen .
Kết luận: Dƣợc liệu không có flavonoid.
3.2.5. Định tính coumarin
Phản ứng mở và đóng vòng lacton:
Thiết kế thí nghiệm: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết cồn, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên.
Đun cả 2 ống nghiệm cách thủy đến sôi, để nguội. Quan sát thấy ống 1 có màu tủa đục màu nâu, ống 2 trong suốt.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều. Quan sát thấy tủa ống 2 tan, dung dịch trong, ống 1 không có hiện tượng gì; acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 nhạt màu hơn, cả hai ống dung dịch trong suốt.
Quan sát hiện tượng huỳnh quang:
Nhỏ 2 - 3 giọt dịch chiết cồn lên một khoang giấy thấm. Nhỏ 2 - 3 giọt dung dịch NaOH 5% lên vị trí có dịch chiết, sấy nhẹ. Che 1 phần diện tích
dịch chiết trên giấy lọc bằng 1 miếng kim loại, rồi chiếu tia tử ngoại trong 1 vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy cả 2 phần đều phát quang giống nhau.
Kết luận : Dƣợc liệu không có coumarin.
Chuẩn bị dịch chiết nƣớc: cân 20 g bột thân rễ Bảy lá một hoa cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng định tính tanin, acid hữu cơ, acid amin, polysaccarid, đường khử như sau:
3.2.6. Định tính tanin
Thiết bị thí nghiệm: Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết nước, làm các phản ứng sau:
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: cho vào ống nghiệm 2 - 3 giọt dd FeCl3 5%.
Hiện tượng: không có tủa màu xanh đen.
Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: thêm 2 - 3 giọt dung dịch gelatin 1% vào ống nghiệm chứa dịch chiết
Hiện tượng: Không xuất hiện tủa bông vàng.
Phản ứng với chì acetat: cho vào ống nghiệm dịch chiết Bảy lá một hoa 2-3 giọt dung dịch chì acetat 10%.
Hiện tượng: Không thấy có tủa bông trắng.
Phản ứng với đồng acetat: cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết Bảy lá một hoa 2-3 giọt đồng acetat.
Hiện tượng: Không xuất hiện tủa nâu.
Kết luận: Dƣợc liệu không có tanin. 3.2.7. Định tính acid hữu cơ
Thiết kế thí nghiệm: Cho vào ống nghiệm có dịch chiết nước Bảy lá một hoa một ít tinh thể Na2CO3.
Hiện tượng: Không có bọt khí bay ra.
Kết luận: Dƣợc liệu không có acid hữu cơ. 3.2.8. Định tính acid amin
Thiết kế thí nghiệm: Lấy 2 ml dịch chiết Bảy lá một hoa vào ống nghiệm sạch, thêm vào 2 - 3 ml giọt thuốc thử ninhydrin 3%, đun cách thủy sôi 10 phút quan sát hiện tượng.
Hiện tượng: Sau khi đun cách thuỷ thấy dung dịch chuyển sang màu tím.
Kết luận: Dƣợc liệu có acid amin 3.2.9. Định tính đƣờng khử:
Thiết kế thí nghiệm: Lấy 2 ml dịch chiết nước Bảy lá một hoa, thêm vào 3 giọt thuốc thử Fehling A và Fehling B, đun cách thủy 10 phút và quan sát hiện tượng
Hiện tượng: Sau khi đun cách thuỷ thấy có tủa đỏ gạch.
Kết luận: Dƣợc liệu có đƣờng khử. 3.2.10. Định tính polysaccharid
Thiết kế thí nghiệm: Cho vào ống 1: 4 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol, ống 2: 4 ml dịch chiết BLMH và 5 giọt thuốc thử Lugol không thấy xuất hiện màu nâu đỏ.
Kết luận: Dƣợc liệu không có polysaccharid.
Chuẩn bị dịch chiết ether dầu hoả: cân 10 g bột dược liệu cho vào bình nón 100 ml; đổ ngập ete dầu hoả, ngâm qua đêm; lọc thu dịch lọc. Dịch lọc dùng để làm các phản ứng định tính chất béo và sterol.
3.2.11. Định tính chất béo
Nhỏ 2 giọt dịch chiết ether dầu hoả lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung môi thấy không để lại vết mờ trên giấy lọc.
3.2.12. Định tính sterol
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ether dầu hoả, bốc hơi dung môi đến khô. Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ. Để nghiêng ống nghiệm 450 nhỏ từ từ dung dịch H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm. Kết quả cho thấy giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện một vòng tím đỏ.
Kết luận: Dƣợc liệu có sterol. 3.2.13. Định tính caroten
Cho vào 2 ống nghiệm dịch chiết ether dầu hoả, bốc hơi cách thuỷ đến cắn, thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn, không thấy xuất hiện màu xanh.
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong phần dƣới mặt đất của Bảy lá một hoa bằng phản ứng hóa học.
STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết luận 1 Saponin Phản ứng tạo bọt ++ Có 2 Alcaloid Phản ứng với TT Mayer - Không Phản ứng với TT Dragendorff - Phản ứng với TT Bouchardat - 3 Glycosid tim Phản ứng Liebermann- Burchardat + Không Phản ứng Legal - Phản ứng Baljet - 4 Flavonoid Phản ứng Cyanidin - Không Phản ứng với kiềm - Phản ứng với FeCl3 5% - 5 Coumarin Phản ứng đóng mở vòng lacton - Không
Hiện tượng huỳnh quang -
6 Tanin Phản ứng với FeCl3 5% - Không Không Phản ứng với gelatin 1% - Phản ứng với chì acetat 10% - Phản ứng với đồng acetat -
7 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - Không 8 Đường khử Phản ứng với TT Fehling ++ Có 9 Acid amin Phản ứng với Ninhydrin 3% ++ Có 10 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol - Không 11 Sterol Phản ứng Liebermann-
Burchardat + Có
12 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc - Không
13 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc - Không
Hình 3.2: Hình ảnh kết quả định tính acid amin, saponin và đƣờng khử
Nhận xét : Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học đặc trưng cho thấy phần dưới mặt đất BLMH có chứa saponin, acid amin, đường khử, sterol, không chứa alcaloid, glycosid tim, flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, polysaccharid, chất béo, caroten.
3.3. Kết quả chiết xuất và phân lập và nhận dạng các chất
3.3.1. Quy trình chiết các phân đoạn từ phần dƣới mặt đất Bảy lá một hoa
Thân rễ Bảy lá một hoa rửa sạch, thái lát mỏng, phơi khô, cân 1,2 kg, sau đó chiết ba lần bằng cồn 80o
ở 70oC, gộp các dịch chiết, loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 450 g cao tổng (chiếm 37,5%). Hoà cao tổng trong 1 lít nước cất và chiết lỏng – lỏng 3 lần với các dung môi có độ phân cực tăng dần:
n-hexan, diclomethan và ethyl acetat, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn tương ứng: cao phân đoạn EtOAc (m = 31,04 g, chiếm 2,6%), cao phân đoạn nước (m = 398,12 g, chiếm 33,2%).
Sau khi chiết các cao phân đoạn, nhận thấy hai phân đoạn n-hexan và diclomethan khối lượng cao không đáng kể, qua tìm hiểu tài liệu cũng không
thấy tài liệu nào phân lập chất từ phân đoạn này. Nên chúng tôi lựa chọn phân đoạn ethyl acetat để tiến hành khảo sát và phân lập chất.
Hình 3.3: Sơ đồ quy trình chiết các cao phân đoạn từ phần dƣới mặt đất bảy lá một hoa.
Chiết 3 lần bằng EtOH thu hồi dung môi Cao tổng (450 g) Hoà trong 1lít nước
Lắc với EtOAc Cao nước (m = 398,12 g) Cao EtOAc (m = 31,04 g) Lắc với n-hexan Cao hexan (m = 0.5 g) Dịch nước Lắc với DCM Cao diclomethan (m = 1 g) Dịch nước Phần dưới mặt đất BLMH (m = 1,2 kg)
3.3.2. Kết quả phân lập và tinh sạch chất tinh khiết từ phân đoạn ethyl acetat acetat
3.3.2.1. Khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng
Mục đích: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để phân lập chất.
Tiến hành: Sử dụng sắc ký lớp mỏng với bản mỏng pha thường tráng sẵn silicagel GF254 (Merck) đã hoạt hóa, sử dụng các hệ dung môi khác nhau để khảo sát sự phân tách các chất.
Kết quả: Tại bước sóng 254 nm và 365 nm không thấy xuất hiện hình ảnh sắc ký đồ. Khi phun thuốc thử hiện màu là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol thấy hệ 3: diclomethan: methanol: nước (5: 1: 0,1) cho sự phân tách tốt nhất, sắc ký đồ phát hiện bằng cho nhiều vết nhất, các vết tròn, tách xa nhau với giá trị Rf khác nhau.
Hình 3.4: Sắc ký đồ khi khảo sát phân đoạn EtOAc
bằng các hệ dung môi khác nhau (hiện màu bằng dd H2SO4 10%/ EtOH)
Ghi chú:
1: Hexan: Ethyl acetat (1: 2) 2: Diclomethan : Methanol (3 :1)
3: Diclomethan: Methanol: Nước (5: 1: 0,1).
3.3.2.2. Phân lập bằng sắc ký cột
Mục đích: Dùng sắc ký cột để phân lập chất trong phân đoạn, trên cơ sở sự hấp phụ của các chất vào silica gel và giải hấp phụ bằng hệ dung môi thích hợp.
Tiến hành:
Tinh chế phân đoạn EtOAc
+ Chuẩn bị mẫu: Hòa tan hoàn toàn 17 g cắn của phân đoạn EtOAc với lượng tối thiểu EtOAc trong bình cầu, thêm 17 g silica gel, lắc đều. Cất quay dưới áp suất giảm loại hết EtOAc thu được hỗn hợp rắn. Nghiền hỗn hợp rắn thu được bằng cối sứ thu được hỗn hợp tơi xốp, đồng đều.
+ Chuẩn bị cột sắc kí: Chọn cột sắc ký có đường kính = 6 cm, chiều cao h = 30 cm. Cân khoảng 400 g silica gel (cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm) cho vào cốc, thêm ngập DCM, khuấy đều cho hết bọt khí. Để yên 12h. Lót ở đáy cột một lớp bông mỏng rồi rót từ từ hỗn dịch DCM lên cột. Mở khóa cột hứng dung môi, đồng thời bổ sung dung môi, để ổn định cột. Khi cột đã ổn định, để mức DCM khoảng 3 - 5 mm, đưa hỗn hợp chất đã trộn silicagel lên cột. Sau đó phủ lên phía trên một lớp silicagel mỏng để tránh chất khuếch tán ngược.
+ Giải hấp phụ bằng hệ dung môi DCM: MeOH: H2O với tỉ lệ như trong bảng 3, hứng các phân đoạn bằng ống nghiệm thể tích 50 ml, kiểm tra bằng SKLM.
Bảng 3.2: Hệ dung môi sử dụng chạy cột phân đoạn EtOAc
Hệ dung môi DCM (ml) MeOH (ml) H2O (ml)
Hệ I 100 0 0 Hệ II 300 20 2 Hệ III 800 80 8 Hệ IV 1000 200 20 Hệ VI 300 100 10 Hệ VII 200 200 20
Khảo sát bằng SKLM, gộp các phân đoạn thích hợp và cất thu hồi dung môi thu được 7 phân đoạn trong đó có 4 phân đoạn chính ký hiệu I (m = 0,49 g), II (m = 10,74 g), III (m = 1,34 g), và IV (m = 1,71 g).
Phân đoạn II (m = 10,74 g) trên sắc ký đồ thu được 2 vết tròn, Rf khác nhau vì vậy chọn phân đoạn II để tách tiếp bằng sắc ký cột pha đảo.
Hình 3.5: Sắc ký đồ các phân đoạn sau khi chạy cột phân đoạn EtOAc (hiện màu bằng dd H2SO4 10%/ EtOH)
Ghi chú:
1, 2: Sắc ký đồ theo dõi quá trình chạy cột phân đoạn EtOAc (D: M: W: 5: 1:0,1).
3: Sắc ký đồ phân đoạn II, sử dụng hệ dung môi pha đảo aceton: nước (3: 1).
Tinh chế phân đoạn II bằng sắc ký cột pha đảo:
Chuẩn bị cột pha đảo YCM: YCM được ngâm trong MeOH rồi đưa lên cột, đường kính cột = 2 cm, chiều cao cột h = 35 cm.
Ổn định cột: Ổn định cột với hệ dung môi nước: aceton (0:1 -> 1: 5 –> 1: 3) đã siêu âm để loại bọt khí.
Đưa chất lên cột: Hoà tan 1 g chất phân đoạn II trong lượng tối thiểu hệ dung môi aceton: nước (3: 1), dùng pipet đưa từ từ dịch chất lên cột.
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi aceton: nước (3: 1) và theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng.
Gộp các phân đoạn thích hợp thu được hai phân đoạn chính ký hiệu II1 và II2.
Phân đoạn II2 thu hồi dung môi ở áp suất giảm thu được chất bột màu trắng. Tiến hành lọc và rửa chất bột trên bằng aceton lạnh bằng hệ thống lọc hút chân không thu được phần không tan màu trắng có khối lượng 25 mg, ký hiệu PE1. PE1 được kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký bản mỏng và sắc ký HPLC.
Kết quả: Sắc ký bản mỏng chất PE1 với hệ dung môi DCM: MeOH: H2O= 5:1: 0,1 chỉ xuất hiện một vết tròn duy nhất. Sắc ký lỏng hiệu năng cao chất PE1 có độ tinh sạch đạt 97,502% (tính theo diện tích pic).
Hình 3.6: Sắc ký đồ của cao EtOAc, phân đoạn II và chất PE1 (hiện màu bằng bằng dd H2SO4 10% trong EtOH)
Hình 3.7: Sơ đồ phân lập chất tinh khiết từ BLMH 3.3.2.3. Biện giải cấu trúc của chất PE1
Kết quả phân tích phổ
Bột kết tinh màu trắng, có giá trị [α]D = -116,3o; UV (MeOH) λmax: 205, IR (KBr): υmax 3429 (-OH), 2935 (C-H), 450 (C=C), 1048 (C-0); MS m/z: 877.3 [M+Na]+ (theo tính toán m/z cho C44H70O16 = 854); Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOH) δH : 5,41 (d, 1H, J=5Hz), 5,3 (d, 1H, J=1Hz), 4,53 (2H, m), 4,41 (1H, m), 2,0 (2H, m), 1,76 (2H, m), 1,93 (m, 3H), 1,27 (d, 3H, J=6.5Hz), 0,99 (d, 3H, J=7Hz), 1,07 (s, 3H), 0,83 (s, 3H); Phổ 13C