Mục đích: Dùng sắc ký cột để phân lập chất trong phân đoạn, trên cơ sở sự hấp phụ của các chất vào silica gel và giải hấp phụ bằng hệ dung môi thích hợp.
Tiến hành:
Tinh chế phân đoạn EtOAc
+ Chuẩn bị mẫu: Hòa tan hoàn toàn 17 g cắn của phân đoạn EtOAc với lượng tối thiểu EtOAc trong bình cầu, thêm 17 g silica gel, lắc đều. Cất quay dưới áp suất giảm loại hết EtOAc thu được hỗn hợp rắn. Nghiền hỗn hợp rắn thu được bằng cối sứ thu được hỗn hợp tơi xốp, đồng đều.
+ Chuẩn bị cột sắc kí: Chọn cột sắc ký có đường kính = 6 cm, chiều cao h = 30 cm. Cân khoảng 400 g silica gel (cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm) cho vào cốc, thêm ngập DCM, khuấy đều cho hết bọt khí. Để yên 12h. Lót ở đáy cột một lớp bông mỏng rồi rót từ từ hỗn dịch DCM lên cột. Mở khóa cột hứng dung môi, đồng thời bổ sung dung môi, để ổn định cột. Khi cột đã ổn định, để mức DCM khoảng 3 - 5 mm, đưa hỗn hợp chất đã trộn silicagel lên cột. Sau đó phủ lên phía trên một lớp silicagel mỏng để tránh chất khuếch tán ngược.
+ Giải hấp phụ bằng hệ dung môi DCM: MeOH: H2O với tỉ lệ như trong bảng 3, hứng các phân đoạn bằng ống nghiệm thể tích 50 ml, kiểm tra bằng SKLM.
Bảng 3.2: Hệ dung môi sử dụng chạy cột phân đoạn EtOAc
Hệ dung môi DCM (ml) MeOH (ml) H2O (ml)
Hệ I 100 0 0 Hệ II 300 20 2 Hệ III 800 80 8 Hệ IV 1000 200 20 Hệ VI 300 100 10 Hệ VII 200 200 20
Khảo sát bằng SKLM, gộp các phân đoạn thích hợp và cất thu hồi dung môi thu được 7 phân đoạn trong đó có 4 phân đoạn chính ký hiệu I (m = 0,49 g), II (m = 10,74 g), III (m = 1,34 g), và IV (m = 1,71 g).
Phân đoạn II (m = 10,74 g) trên sắc ký đồ thu được 2 vết tròn, Rf khác nhau vì vậy chọn phân đoạn II để tách tiếp bằng sắc ký cột pha đảo.
Hình 3.5: Sắc ký đồ các phân đoạn sau khi chạy cột phân đoạn EtOAc (hiện màu bằng dd H2SO4 10%/ EtOH)
Ghi chú:
1, 2: Sắc ký đồ theo dõi quá trình chạy cột phân đoạn EtOAc (D: M: W: 5: 1:0,1).
3: Sắc ký đồ phân đoạn II, sử dụng hệ dung môi pha đảo aceton: nước (3: 1).
Tinh chế phân đoạn II bằng sắc ký cột pha đảo:
Chuẩn bị cột pha đảo YCM: YCM được ngâm trong MeOH rồi đưa lên cột, đường kính cột = 2 cm, chiều cao cột h = 35 cm.
Ổn định cột: Ổn định cột với hệ dung môi nước: aceton (0:1 -> 1: 5 –> 1: 3) đã siêu âm để loại bọt khí.
Đưa chất lên cột: Hoà tan 1 g chất phân đoạn II trong lượng tối thiểu hệ dung môi aceton: nước (3: 1), dùng pipet đưa từ từ dịch chất lên cột.
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi aceton: nước (3: 1) và theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng.
Gộp các phân đoạn thích hợp thu được hai phân đoạn chính ký hiệu II1 và II2.
Phân đoạn II2 thu hồi dung môi ở áp suất giảm thu được chất bột màu trắng. Tiến hành lọc và rửa chất bột trên bằng aceton lạnh bằng hệ thống lọc hút chân không thu được phần không tan màu trắng có khối lượng 25 mg, ký hiệu PE1. PE1 được kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký bản mỏng và sắc ký HPLC.
Kết quả: Sắc ký bản mỏng chất PE1 với hệ dung môi DCM: MeOH: H2O= 5:1: 0,1 chỉ xuất hiện một vết tròn duy nhất. Sắc ký lỏng hiệu năng cao chất PE1 có độ tinh sạch đạt 97,502% (tính theo diện tích pic).
Hình 3.6: Sắc ký đồ của cao EtOAc, phân đoạn II và chất PE1 (hiện màu bằng bằng dd H2SO4 10% trong EtOH)
Hình 3.7: Sơ đồ phân lập chất tinh khiết từ BLMH 3.3.2.3. Biện giải cấu trúc của chất PE1
Kết quả phân tích phổ
Bột kết tinh màu trắng, có giá trị [α]D = -116,3o; UV (MeOH) λmax: 205, IR (KBr): υmax 3429 (-OH), 2935 (C-H), 450 (C=C), 1048 (C-0); MS m/z: 877.3 [M+Na]+ (theo tính toán m/z cho C44H70O16 = 854); Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOH) δH : 5,41 (d, 1H, J=5Hz), 5,3 (d, 1H, J=1Hz), 4,53 (2H, m), 4,41 (1H, m), 2,0 (2H, m), 1,76 (2H, m), 1,93 (m, 3H), 1,27 (d, 3H, J=6.5Hz), 0,99 (d, 3H, J=7Hz), 1,07 (s, 3H), 0,83 (s, 3H); Phổ 13C (500MHz,MeOH&CDCl3): δC 141,46, 122,41, 110,41, 104,15, 102,05, Cao EtOAc (17 g) CC, silica gel DM: DCM: MeOH: H2O (100 % DCM – 1: 1: 0,1) (100% DCM – 1: 1: 0) Pđ I (m = 0,49 g) Pđ II (m = 10,74g) Pđ III (m = 1,34 g) Pđ IV (m = 1,71 g)
YCM, DM: Aceton: Nước (3: 1)
Kết tinh, lọc, rửa tủa bằng aceton
PE1 (m = 25 mg) Lấy 1 g Pđ II1 (m = 0,42 g) Pđ II2 (m = 0,27 g)
100,12, 88,33, 81,92, 78,44, 78,10, 77,62, 77,78, 76,87, 74,67, 73,62, 72,0, 71,66, 71,17, 69,76, 69,54, 67,64, 62,48, 62,28, 57,47, 51,25, 42,57, 41,15, 40,62, 39,03, 38,22, 37,75, 32,91, 32,47, 32,42, 32,13, 31,08, 30,39, 29,53, 21,69, 19,73, 17,91, 17,41, 16,73, 14,78.
Biện luận cấu trúc:
Tinh thể dạng bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 275 - 280°C. UV của PE1 (trong MeOH) có giá trị λmax là 205 nm. Hiện màu hồng sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, hơ nóng. Phổ hồng ngoại của PE-1 có các đỉnh hấp thụ cực đại tại υmax 3429 cm-1 đặc trưng của nhóm OH; υmax 2935 cm-1 đặc trưng của nhóm C-H; υmax 1450 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=C;
υmax 1048 cm-1 đặc trưng của nhóm CO. Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR: δH 5,41 (d, 1H, J=5Hz), 5,3 (d, 1H, J=1Hz), 4,53 (2H, m), 4,41(1H, m), 2,0 (2H, m), các píc 1,93, 1,27, 0,99, 1,07, 0,83 đặc trưng cho 3H của thuộc nhóm CH3 trong đó píc 1,93 đặc trưng cho 3H ở các bon có đính đường. Phổ 13
C-NMR (MeOD&CDCl3) có hai tín hiệu pic 141,46 và 122,41cho thấy sự của liên kết đôi giữa C-5 và C-6 trong cấu trúc của diogenin. 5 píc 63,19, 71,66, 76,87, 71,17 và 104,15 là các píc đặc trưng cho sự xuất hiện của đường arabinose (ký hiệu là C1-C5). Sự có mặt của các píc 100,18, 78,44, 77,79, 81,92, 77,86, 62,48 đặc trưng cho sự có mặt của đường glucose (ký hiệu C1-C6). Các tín hiệu píc: 102,05, 72,01, 73,62, 69,76, 17,91 là các píc đặc trưng cho sự xuất hiện của cấu trúc đường rhamnose (ký hiệu carbon: C1- C6). Các tín hiệu píc còn lại chính carbon của phần aglycon (ký hiệu các bon: C1- C27). Phổ khối của hợp chất PE-1 ghi theo chế độ ESI (+) cho pic phân tử [M+Na]+ ion ở m/z 877,3. Các dữ liệu phổ 13C và ESI-MS cho phép xác định công thức phân tử chất này là C44H70O16, (giá trị phổ khối theo tính toán 854). Từ những dữ liệu phổ thu được kết hợp so sánh với dữ liệu phổ đã công bố về hợp chất polyphyllin D. Như vậy có thể sơ bộ kết luận PE-1 được nhận dạng
là polyphyllin D.
Bảng 3.3: Bảng so sánh phổ của PE1 với phổ của polyphyllin D
STT 1 H(500MHz, MeOH) của PE1 1 H(600MHz, C5D5N) của Polyphyllin D [17] 13 C (125MHz,MeO H& CDCl3) của PE1 13 C (150 MHz,C5D5N) của Polyphyllin D [17] 1 100,18 100,18 2 78,44 81,11 3 77,79 77,69 4 81,92 82,67 5 77,86 77,91 6 62,48 61,42 1 63,19 62,92 2 71,66 72,78 3 76,87 77,46 4 71,17 72,43 5 104,15 109,26 1 102,05 101,9 2 72,01 74,13 3 73,62 76,71 4 74,47 77,12
STT 1 H(500MHz, MeOH) của PE1 1 H(600MHz, C5D5N) của Polyphyllin D [17] 13 C (125MHz,MeO H& CDCl3) của PE1 13 C (150 MHz,C5D5N) của Polyphyllin D [17] 5 69,76 69,47 6 1.93 (m, 3H) 1.74 (d, 3H, J=6.1) 17,91 18,65 1 38,22 37,51 2 30,39 30,17 3 78,1 78,16 4 39,03 38,97 5 141,46 140,81 6 122,41 121,79 7 32,91 32,32 8 32,13 31,71 9 51,25 50,32 10 37,75 37,15 11 21,69 21,12 12 40,62 39,88 13 41,18 40,48 14 57,47 56,66 15 32,42 31,85 16 88,33 86,71 17 67,64 62,51 18 42,57 41,99 19 110,41 109,64
STT 1 H(500MHz, MeOH) của PE1 1 H(600MHz, C5D5N) của Polyphyllin D [17] 13 C (125MHz,MeO H& CDCl3) của PE1 13 C (150 MHz,C5D5N) của Polyphyllin D [17] 20 69,54 66,68 21 31,08 30,61 22 29,53 29,28 23 32,47 32,23 24 1.27 (d, 3H, J=6.5Hz) 1.12 (d, 3H, J=6.9) 19,73 19,41 25 1.07 (s, 3H) 10.4 (s, 3H) 16,73 16,34 26 0.83(s, 3H) 0.68 (d, 3H) 14,78 14,99 27 0.99 (d, 3H, J=7Hz) 0.82(s, 3H) 17,41 17,32
Kết luận: Kết quả so sánh bảng dữ liệu phổ cho thấy chất PE1 phân lập được từ phân đoạn EtOAc chính là polyphyllin D, có tên IUPAC là: Diosgenyl α-L-rhamnopyranosyl-(1-2)-[( α-L-arabinofuranosyl)-1→4)]-β-D- glucopyranosid. PE1 có công thức cấu tạo như hình 3.8.
0 0 O 1' O O O O O HO CH3 HO HO OH CH2-OH HO-H2C HO 3' HO 3'' 1'' 1''' 2''' 5''' 1 4 5 6 18 12 24 23 20 15 27 26 19 9 25 13 5'
Hình 3.8. Công thức cấu tạo của chất PE1. 3.4. Bàn luận
3.4.1. Về việc chọn đề tài và mục tiêu của đề tài
Bảy lá một hoa là cây thuốc quý hiếm của Việt Nam cũng như trên thế giới, được sử dụng trong dân gian để tiêu sưng nhọt, chữa rắn cắn… [4], từ lâu đã được sử dụng ở Trung Quốc để điều trị ung thư. Trên thế giới, đặc biệt là Trung Quốc đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như tác dụng sinh học của dược liệu này [17], [20], [21]. Tuy nhiên,Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như tác dụng sinh học của Paris chinensis Franch. nói riêng cũng như các loài thuộc chi Paris nói chung. Nhu cầu đặt ra là cần có những nghiên cứu có giá trị khoa học để làm sáng tỏ thành phần hoá học, tác dụng sinh học và giá trị sử dụng của cây thuốc này. Vì vậy, trong phạm vi của một khoá luận tốt nghiệp, chúng tôi thực hiện đề tài này với mục tiêu nghiên cứu thành phần hoá học của cây Bảy lá một hoa. Tạo tiền đề cho những nghiên cứu sâu rộng về thành phần hoá học và tác dụng sinh học của cây Bảy lá một hoa sau này.
3.4.2. Về thực vật:
Về tên khoa học: Ở Việt Nam, Bảy lá một hoa là tên gọi chung cho các loài thuộc chi Paris L. Theo Nguyễn Thị Đỏ, ở Việt Nam chi Paris L. có 6 loài: P. delavayi Franch., P. polyphylla Smith, P. dunniana Levl, P.
yunnanensis Franch., P. chinensis Franch., P. fargesii Franch. [6]. Theo đó P.
polyphylla Smith và P. chinensis Franch. là hai loài khác nhau, tuy nhiên theo ―Từ điển cây thuốc Việt Nam‖ [5] thì P. chinensis Franch. có tên đồng nghĩa là P. polyphylla Smith var. chinensis (Franch.) [5] và theo ―Flora of china‖ [19], P. polyphylla Smith var. chinensis là một trong chín thứ của loài P.
polyphylla Smith.
Hiện nay các tài liệu nước ngoài ít dùng tên P. chinensis Franch. mà chủ yếu dùng tên P. polyphylla Smith var. chinensis (Franch.) nên các tài liệu chúng tôi tham khảo chủ yếu là tài liệu về loài P. polyphylla hoặc P.
polyphylla Smith var. chinensis (Franch.).
3.4.3. Về hoá học
+ Về định tính: Sơ bộ xác định các nhóm chất chính có trong phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa bằng phương pháp hoá học [2], [3]. Ưu điểm của phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, cho kết quả nhanh.
Kết quả của đề tài thống nhất với các tài liệu trong và ngoài nước khi chỉ ra sự có mặt của các nhóm chất saponin, sterol, acid amin và đường khử [9], [13], [20].
Qua sơ bộ định tính các nhóm chất ta có thể dự đoán thành phần hoá học trong thân rễ Bảy lá một hoa chủ yếu tập trung trong phân đoạn nước.
+ Về chiết tách, phân lập:
Đây là đề tài đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu phân lập chất tinh khiết từ Bảy lá một hoa. Trước đó Phùng Thị Bảo Vân (2005), khi nghiên cứu về thành phần hoá học của Bảy lá một hoa mới chỉ dừng lại ở định tính sơ bộ các
nhóm chất, và định tính diosgenin trên bản mỏng [7]. Đề tài này đã tiếp bước đề tài trên, đi sâu vào phân lập và nhận dạng các chất tinh khiết.
Chiết cao tổng:
Phương pháp chiết: Chọn phương pháp chiết nóng ở 70oC, vì nhiệt độ cao làm tăng tốc độ chiết, tăng khả năng chiết các hoạt chất.
Dung môi chiết: Sử dụng cồn ethanol 80o, vì ethanol là dung môi có khả năng chiết được hầu hết các hoạt chất trong dược liệu, rẻ tiền, dễ kiếm, ít độc hại với con người và môi trường. Ethanol có nhiệt độ sôi lớn nên có thể chiết ở nhiệt độ cao. Sử dụng ethanol 80o
vừa tăng khả năng chiết các nhóm chất vừa làm đông vón protein, hạn chế các tạp chất.
Kết quả chiết các phân đoạn và phân lập chất từ phần dưới mặt đất của BLMH cho thấy: Hiệu suất chiết cao tổng từ phần dưới mặt đất của BLMH sử dụng dung môi cồn 80o ở 70oC là 37,5%. Hiệu suất chiết cao phân đoạn từ cao tổng là EtOAc 6,9%, cao phân đoạn nước là 88,4%. Ta thấy chất tập trung chủ yếu ở phân đoạn nước, phù hợp với kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất.
Về phân lập chất tinh khiết:
Từ cao phân đoạn EtOAc đã phân lập được polyphyllin D (PD), là một saponin steroid. Phân lập các saponin nói chung từ dược liệu vẫn luôn là một công việc khó khăn và đây cũng là đề tài đầu tiên ở Việt Nam phân lập được saponin (polyphyllin D) từ Bảy lá một hoa. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã phân lập và chỉ ra rằng PD là một thành phần chính trong thân rễ Bảy lá một hoa [18], [9]. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý cho thấy PD có tiềm năng lớn trong điều trị ung thư [14], [16].
Năm 2005, nghiên cứu của Jenny Yuen-Nei Cheung và cộng sự [10] trong môi trường in vitro cho thấy PD có tác dụng trên dòng tế bào HepG2 (dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan) và tác dụng mạnh trên dòng tế bào kháng
thuốc R-HepG2, thể hiện qua nồng độ IC50 đối chiếu với các thuốc chống ung thư khác (bảng 3.4).
Bảng 3.4: So sánh tác dụng của PD và các thuốc chống ung thƣ trên tế bào ung thƣ gan HepG2 và ung thƣ kháng thuốc R-HepG2
Thuốc IC50 (µM) HepG2 R-HepG2 Doxorubicin 4 >200 Cisplatin 50 167 Taxol 20 50 Polyphyllin D 7 5
Năm 2011, Judy Yuet-Wa Chan và CS đã nghiên cứu tác dụng PD in vitro trên dòng tế bào HMEC-1 (dòng tế bào nội mô mao mạch), và in vivo
trên cá ngựa vằn [22], kết quả:
Ở nồng độ 0,1 M và 0,2 M, PD ức chế sự tăng sinh tế bào sau 3 ngày điều trị (p< 0,05); ở nồng độ 0,3 M và 0,4 M, PD đàn áp sự tăng sinh của HMEC-1 sau 2 đến 3 ngày (p< 0,001); ở nồng độ lớn hơn 0,4 M, PD gây độc và làm chết tế bào sau 2 ngày.
70% phôi cá ngựa vằn cho thấy khiếm khuyết khi sử dụng PD tại nồng độ 0,156 M và 0,313 M. Nghiên cứu đã chứng minh tác dụng chống tạo mạch trong sự hình thành khối u của polyphyllin D.
Như vậy kết quả của đề tài đã mở ra những tiền đề quan trọng, định hướng cho những nghiên cứu sâu hơn về thành phần hoá học của Bảy lá một hoa, cũng như các loài cùng chi, từ đó đi sâu nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hoạt chất trong Bảy lá một hoa nói chung và của polyphyllin D nói riêng, mở ra một hướng mới trong nghiên cứu thuốc chống ung thư ở Việt Nam.
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
4.1. KẾT LUẬN
Sau thời gian nghiên cứu về phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa (Paris chinensis Franch.), chúng tôi thu được một số kết quả sau:
+ Chúng tôi đã xác định mẫu cây trồng tại Đà Lạt – Lâm Đồng – Viện dược liệu có tên khoa học là Paris chinensis Franch. thuộc họ Trilliaceae.
+ Kết quả định tính cho thấy phần dưới mặt đất của BLMH thu hái ở Đà Lạt – Lâm Đồng có chứa saponin, sterol, acid amin và đường khử, trong đó chủ yếu là saponin.
+ Từ cao phân đoạn EtOAc, sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, kết tinh, rửa tủa thu được 1 chất tinh khiết, dựa vào dữ liệu phổ xác định chất phân lập được là polyphyllin D có tên IUPAC là: Diosgenyl α-L- rhamnopyranosyl-(1-2)-[( α-L-arabinofuranosyl)-1→4)]-β-D-glucopyranosid.
4.2. ĐỀ XUẤT
- Nghiên cứu quy trình phân lập polyphyllin D với hiệu suất cao từ phân đoạn ethyl acetat.
- Tiến hành thử tác dụng dược lý của polyphyllin D phân lập được.
- Tiếp tục nghiên cứu thành phần hoá học của cây Bảy lá một hoa và tiến hành thử tác dụng dược lý của các chất phân lập được từ Bảy lá một hoa.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2006), Cây Thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập I, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 182 – 184.
2. Bộ môn Dược liệu (2006), Thực tập dược liệu, trường Đại học Dược Hà