Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây bù dẻ tía uvaria grandiflora roxb ex hornem annnonaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ BÍCH HIỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY BÙ DẺ TÍA UVARIA GRANDIFLORA ROXB... BỘ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ BÍCH HIỀN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA

CÂY BÙ DẺ TÍA UVARIA GRANDIFLORA

ROXB EX HORNEM – ANNONACEAE

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ BÍCH HIỀN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA

CÂY BÙ DẺ TÍA UVARIA GRANDIFLORA

ROXB EX HORNEM – ANNONACEAE

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Sau Đại học, các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu, Dược học cổ truyền và Thực vật Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tiếp theo tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Y Dược Huế, cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo, đồng nghiệp, các em sinh viên trong nhóm nghiên cứu ở Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược Huế, nơi đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS Nguyễn Thị Hoài, người đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo, luôn quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Phan Văn Kiệm, TS

Nguyễn Thế Cường, TS Đỗ Thị Thảo, ThS Hồ Việt Đức đã giúp đỡ tôi hoàn

thành luận văn này

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc nhất, tôi muốn gửi tới gia đình, bạn bè, những người luôn ủng hộ và động viên tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống

Một lần nữa, tôi xin cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Huế, tháng 8 năm 2013

Lê Thị Bích Hiền

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1.Tổng quan về cây Bù dẻ tía 3

1.1.1.Vị trí phân loại 3

1.1.2.Vài nét về họ Na 3

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Bù dẻ 4

1.1.4 Đặc điểm thực vật cây Bù dẻ tía 6

1.1.5 Phân bố sinh thái của Bù dẻ tía 6

1.2 Thành phần hóa học chi Uvaria và cây Bù dẻ tía 7

1.2.1 Thành phần hóa học chi Uvaria 7

1.2.2 Thành phần hóa học của cây Bù dẻ tía 10

1.3 Tác dụng sinh học và công dụng của chi Uvaria 12

1.3.1 Tác dụng sinh học của chi Uvaria 12

1.3.2 Công dụng của chi Uvaria 14

1.4 Tác dụng sinh học và công dụng của cây Bù dẻ tía 15

1.4.1 Tác dụng sinh học của cây Bù dẻ tía 15

1.4.2 Công dụng của cây Bù dẻ tía 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Hóa chất và máy móc – thiết bị 18

2.2.1 Hóa chất 18

2.2.2 Máy móc thiết bị 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Định tính một số nhóm chất hữu cơ trong dược liệu 19

2.3.2 Phương pháp chiết xuất 19

2.3.3 Phương pháp phân lập 20

2.3.4 Phương pháp xác định cấu trúc 20

2.3.5 Nghiên cứu hoạt tính sinh học 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 Đính tính các nhóm chất hữu cơ trong cây Bù dẻ tía 24

3.2 Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học 25

3.2.1 Quá trình chiết xuất 25

3.2.2 Quá trình phân lập 27

3.2.3 Nhận dạng cấu trúc các chất phân lập được 31

3.3 Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học 42

3.3.1 Kết quả thử độc tính cấp 42

3.3.2 Kết quả nghiên cứu hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư 43 CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 46

4.1 Về quy trình, phương pháp chiết xuất và phân lập 47

4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng tác dụng sinh học 48

4.3 Về độc tính cấp của dịch chiết toàn phần dược liệu 49

4.4 Về tác dụng sinh học của dịch chiết các phân đoạn 50

4.5 Về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các hợp chất phân lập được 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

COSY : Correlation spectroscopy

DEPT : Distortionless enhancement by polarization transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide

FBS : Fetal bovine serum

HepG2 : Tế bào ung thư gan

HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation

HSQC : Heteronuclear single quantum correlation

IC50 : Inhibition concentration at 50%

KB : Tế bào ung thư biểu mô

LU-1 : Tế bào ung thư phổi

MDA-BA-321 : Tế bào ung thư vú

MKN7 : Tế bào ung thư dạ dày

MS : Mass spectometry

NMR : Nuclear magnetic resonance

NOESY : Nuclear overhauser effect spectroscopy

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 1.1 Các nhóm chất alcaloid, flavonoid, dẫn xuất của cyclohexen trong

chi Uvaria 7

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của cây Bù dẻ tía 10

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Bù dẻ tía 24

Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất UGC12 33

Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR của hợp chất UGLE1 và chất tham khảo 35

Bảng 3.4 Dữ kiện phổ NMR của hợp chất UGC5 36

Bảng 3.5 Dữ kiện phổ NMR của hợp chất UGC5 và Zeylenon 38

Bảng 3.6 Dữ kiện phổ NMR của hợp chất UGC8 và PIPOXID 41

Bảng 3.7 Kết quả nghiên cứu độc tính cấp 42

Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào các dịch chiết phân đoạn trên 2 dòng tế bào MDA-BA-321 và MKN7 43

Bảng 3.9 Kết quả xác định giá trị IC50 của các hợp chất phân lập được trên dòng tế bào LU-1 44

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 2.1 Hoa của cây Bù dẻ tía 18

Hình 2.2 Quả của cây Bù dẻ tía 18

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ cây Bù dẻ tía 27

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất 1 (UGC12) từ phân đoạn C2 29

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất 2 (UGLE1), hợp chất 3 (UGC5) và hợp chất 4 (UGC8) từ phân đoạn C5 31

Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất UGC12 32

Hình 3.5 Cấu trúc hoá học của hợp chất UGLE1 35

Hình 3.6 Tương tác HMBC và H,H- COSY chọn lọc của hợp chất UGC5 37

Hình 3.7 Tương tác H,H-NOESY chọn lọc của hợp chất UGC5 38

Hình 3.8 Cấu trúc hóa học của hợp chất UGC5 39

Hình 3.9 Tương tác HMBC và H,H- COSY chọn lọc của hợp chất UGC8 40

Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của hợp chất UGC8 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một quốc gia phong phú về các dạng địa hình và khí hậu, có nguồn tài nguyên thuận lợi cho sự phát triển của ngành công nghiệp sản xuất thuốc từ dược liệu Theo thống kê, Việt Nam có mức độ đa dạng sinh học cao thứ 16 trên thế giới về các loài động, thực vật và vi sinh vật Trong 13.894 loài thực vật, có 3948 loài được sử dụng làm thuốc [3 Phần lớn các loài được sử dụng theo inh nghiệm truyền h u trong nhân dân và được lưu giữ lại từ nhiều đời Hơn nữa, cộng đồng các dân tộc Việt Nam vốn có nhiều kinh nghiệm độc đáo trong việc sử dụng cây cỏ làm thuốc Tuy nhiên, hiện nay số loài được đưa vào để chiết xuất hợp chất làm thuốc còn rất hạn chế [17] Do vậy, nghiên cứu những cây thuốc mới dựa trên tri thức bản địa đang là một hướng đi đầy tiềm năng, đóng góp vào việc tạo nguồn dược liệu tương lai hướng đến giải quyết các vấn đề sức khỏe và bệnh tật

Theo kết quả sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư một số cây thuốc của đồng bào Pako, Vân Kiều ở Quảng Trị mà chúng tôi đã hảo sát, 10 cây thuốc chữa bệnh liên quan đến tác dụng chống khối u đã được đưa vào sàng lọc hoạt

tính gây độc tế bào invitro Trong đó Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora Roxb ex

Hornem – Annonaceae đã thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển các tế bào ung thư tốt nhất, tác dụng mạnh và hướng đích trên cả 6 dòng tế bào ung thư thử nghiệm [9 Tuy nhiên, cho đến nay ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của loài này Làm sáng tỏ thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Bù dẻ tía để chứng minh kinh nghiệm sử dụng của người dân là cần thiết Đó chính là cơ sở khoa học

cho việc thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác

dụng sinh học của cây Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem –

Annonaceae)” Đề tài được thực hiện với hai mục tiêu:

1 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Bù dẻ tía theo định hướng tác dụng sinh học ức chế tế bào ung thư

2 Thử độc tính cấp của dịch chiết toàn phần từ dược liệu và xác định hoạt tính ức chế tế bào ung thư của các phân đoạn và các hợp chất phân lập được

Lá của các cây thuộc họ Na thường không có lá kèm, mọc cách, đơn, mép

lá nguyên, gân lông chim Gân chính nổi rõ ở mặt dưới và thường lõm ở mặt

trên Ở các chi Artabotrys, Cyathocalyx, Stelechocerpus… gân chính lồi rõ cả 2

mặt Gân bên (gân thứ cấp hoặc gân cấp II thường rõ ở mặt dưới, chúng có thể song song hoặc cong hình cung Lá có lông hình sao (nhất là trong giai đoạn

non) gặp ở đại diện thuộc các chi Anomianthus, Cyathostemma, Ellipeiopsis, Melodorum, Neouvaria, Uvaria…[1]

Hoa thường mọc riêng lẻ ở ngọn hay nách lá, kiểu vòng xoắn, đều, lưỡng tính, ít hi đơn tính Đế hoa lồi Bao hoa thường gồm 3 vòng, mỗi vòng có 3

bộ phận, vòng ngoài là lá đài, 2 vòng trong là cánh hoa Đài có thể rời hay dính Cánh hoa to, dày và mềm, đôi hi hoa chỉ có 3 cánh Ô phấn hẹp, mở

bằng một đường nứt dọc, hướng ngoài Bộ nhụy gồm nhiều lá noãn rời xếp hít nhau, nhưng đôi hi giảm còn 3 hoặc 1 lá noãn Vòi nhụy ngắn Bộ nhị gồm nhiều nhị rời xếp theo một đường xoắn ốc Chỉ nhị rất ngắn Trong họ Annonaceae có 2 kiểu nhị chính [4]:

+ Kiểu Uvarioid: Trung đới há dày và dài vượt quá bao phấn để tạo

thành mào trung đới

+ Kiểu Milliusoid: Trung đới mỏng và hẹp, làm cho bao phấn lồi lên so

với trung đới

Quả thường theo 2 kiểu [4]:

+ Kiểu Annona: Quả tụ, mỗi lá noãn cho một quả mọng riêng biệt và tất

cả các quả này dính vào nhau

+ Kiểu Cananga: Mỗi lá noãn cho một quả mọng có cuống và mỗi hoa

cho một chùm quả mọng Mỗi quả mọng mang 2 hàng hạt Ở cây Gié nam

(Unona cochinchinensis Lour.), mỗi lá noãn cho ra một chuỗi hạt thắt lại

thành nhiều khúc, mỗi húc đựng một hạt

Hạt có vỏ cứng, láng Nội nhũ to, xếp nếp [4]

Ở Việt Nam, họ Annonaceae có 29 chi, bao gồm: Alphonsea, Anaxagorea, Annona, Anomianthus, Artabotrys, Cananga (Canangium), Cyathocalyx, Cyathostemma, Dasymaschalon, Desmos (Unona), Drepananthus, Enicosanthella, Enicosanthum, Fissistigma, Friesodielsia (Oxymitra), Goniothalamus (Becariodendron), Meiogyne, Melodorum (Rauwenhoffia), Miliusa (Saccopetalum),Mitrella,Mitrephora,Orophea, Phaeanthus, Polyalthia, Popowia, Pseuduvaria, Sageraea, Uvaria (Uvariella)

và Xylopia với gần 179 loài [4]

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Bù dẻ (Uvaria L.)

1.1.3.1 Đặc điểm thực vật

Phần lớn các loài trong chi Uvaria là dây leo thân gỗ hay bụi trườn Phần

non của cây có lông hình sao Lá thường có gân bên khá rõ ở mặt dưới Trong các tế bào biểu bì lá có tinh thể hợp thành khối nhỏ Hoa lưỡng tính, thường

đối diện với lá, mọc đơn độc hoặc hợp thành cụm hoa dạng xim Lá đài 3, xếp van, thường hợp ở gốc thành đấu Cánh hoa thường 6, phần lớn rời nhau, xếp lợp thành 2 vòng, rất ít khi cánh hoa 9 và xếp thành 3 vòng Các cánh hoa xòe

ra khi hoa nở và gần giống nhau về hình dạng và ích thước Nhị nhiều, có

trung đới dày (dạng Uvarioid , mào trung đới hình đĩa hay gần hình cầu (lớn

hơn bao phấn) hoặc hình lưỡi nhỏ (hẹp hơn bao phấn) Bao phấn hướng ngoài Hạt phấn từ trung bình đến lớn (cỡ 40 - 80 µm), gần hình cầu, đơn độc, thường đối xứng tỏa tròn hoặc đối xứng 2 bên, vỏ ngoài lồi lõm Lá noãn nhiều, không có vòi Núm nhụy hình móng ngựa Noãn thường nhiều (5 - 30), đính thành 2 hàng dọc theo đường nối bụng Phân quả dạng mọng, thường có cuống rõ, đôi hi cuống rất dài [1]

Năm 1999, Phạm Hoàng Hộ [10] đã miêu tả 15 loài thuộc chi Uvaria có

mặt ở Việt Nam, bao gồm:

 Uvaria boniana Fin & Gagn Bồ quả Bon

 Uvaria calamistrata Hance (Bồ quả nhãn, Bồ quả men

 Uvaria cordata (Dun.) Wall ex Alston (Bồ quả lá to

 Uvaria dac Pierre ex Fin & Gagn (Bồ quả Đac

 Uvaria fauveliana Pierre ex Ast (Bồ quả Ast

 Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem Bù dẻ tía

 Uvaria flexuosa Ast Bồ quả cong quẹo

 Uvaria hamiltonii Hook.f & Thoms (Bồ quả Hamilton

 Uvaria lurida Hook.f & Thoms (Bồ quả tái

 Uvaria micrantha Hook.f & Thoms (Bồ quả bông nhỏ

 Uvaria microcarpa Champ ex Benth & Hoo f Bồ quả trái nhỏ

 Uvaria pachychila Merr Bồ quả phiến dày

 Uvaria plagioneuron Diels (Bồ quả Petelot

 Uvaria pierrei Fin & Gagn Bồ quả Pierre

 Uvaria rufa BI Bồ quả hoe

Sau đó vào năm 2000, Nguyễn Tiến Bân [1 đã miêu tả 17 loài thuộc chi

Uvaria có mặt ở Việt Nam, bao gồm 15 loài mà Phạm Hoàng Hộ đã mô tả và thêm 2 loài là Uvaria sphenocarpa Hoo f & Thoms Bù dẻ gai và Uvaria varaigneana Pierre ex Fin & Gagnep Bù dẻ varaigne

1.1.5 Phân bố sinh thái của Bù dẻ tía [1]

Bù dẻ tía mọc rải rác trong rừng thứ sinh, ở độ cao dưới 300 m, phân bố

tự nhiên ở Thanh Hóa, Quảng Bình (Bố Trạch, Ba Rền), Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế (Phú Lộc, Sông Hai Nhánh , Đà Nẵng, Quảng Nam (Cù Lao Chàm , Khánh Hòa Hòn Tre và Đồng Nai (Biên Hòa)

Ngoài ra, cây còn phân bố ở Ấn Độ (Calcutta), Mianma, Trung Quốc (Quảng Tây, Hồng Kông, Hải Nam), Xrilanka, Malaysia và Indonesia (Java)

1.2 Thành phần hóa học chi Uvaria và cây Bù dẻ tía

1.2.1 Thành phần hóa học chi Uvaria

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Uvaria đã phát triển trong

2 thập kỷ qua, nghiên cứu đầu tiên được công bố vào năm 1968 Từ đó đến nay, các nghiên cứu về chi này liên tục phát triển Sự có mặt các nhóm chất

chính như alcaloid, flavonoid và dẫn xuất của cyclohexen trong chi Uvaria

[22] Demethoxymatteucinol

U afzelii

2’- hydroxymatteucinol

Uvafzelin Vafzelin 2,5-dihydroxy-7- methoxyflavanon U rufa Isouvaretin U chamae, U angolensis, U

Kweichowenol A, B

Kweichowenol C, D Pipoxid U catocarpa, U ferruginea

[22] Senepoxid U grandiflora

phân lập từ các loài thuộc chi Uvaria Ngoài ra ở chi Uvaria còn có các nhóm

chất như acetogenin, steroid, terpenoid, dẫn chất của lacton và một số nhóm chất có cấu trúc hác

 Nhóm Acetogenin

Acetogenin là dãy các hợp chất thiên nhiên C-35/C-37 đi từ các acid béo C-32/C-34 kết hợp với một đơn vị propan-2-ol Chúng được đặc trưng bằng mạch hydrocacbon no dài gắn với một vòng methyl-, - không no-

lacton ở cuối mạch Ngoài ra, còn có 1, 2 hoặc 3 vòng tetrahydrofuran phân

bố dọc theo mạch hydrocacbon và một số nhóm chứa oxy như hydroxy,

acetyl, ceton, epoxy hoặc các liên kết bội Lớp chất này đặc trưng cho họ Annonaceae và được xem là một trong những lớp chất tự nhiên phát triển nhanh nhất hiện nay [47]

Các hợp chất Acetogenin được tìm thấy ở một số loài thuộc chi Uvaria như U calamistrata, U chamae, U tonkinensis…Ví dụ: Từ loài U calamistrata người ta đã tách được hợp chất Calamistrin A; từ loài U chamae

đã phân lập được Chamuvarinin, Tripoxyrollin, Diepoxyrollin,

Dieporeticanin-1, Dieporeticanin-2 và Dieporeticenin [27], [28]; từ loài U tonkinensis đã phân lập được Tonkinelin [23]; từ loài U narum đã tách được

2 hợp chất Squamocin-28-on và Panalicin [30]

 Nhóm steroid

Các dẫn xuất oxy hóa hung steroid cũng được tìm thấy ở một số loài

thuộc chi Uvaria Chẳng hạn như từ loài U kurzii đã phân lập được

Beta-acetylsitosterol, Stigmasterol và Stigmasterol hexadecanoate; từ

U.microcarpa đã phân lập được Daucosterol, daucosterol,

Beta-sitosterol và Stigmasterol-3-O-beta-D-glucopyranoside Bên cạnh đó, Stigmasterol và 6b-hydroxystigmasta-4,22-dien-3-one cũng đã được phân lập

từ loài U hamiltonii [34], [52], [66]

 Nhóm terpenoid

Các chất có hung terpenoid được phát hiện ở một số ít loài thuộc chi

Uvaria, ví dụ: hợp chất Tanzanene được phân lập từ rễ của loài U tanzaniae; hợp chất Uvariasesquiterpene A, B, C được phân lập từ phần trên mặt đất loài

U angolensis [22]

 Dẫn chất của lacton

Một số dẫn chất của lacton như Squamocin được phân lập từ U narum [30], Desacetyluvaricin và Uvaricin được phân lập từ U accuminata [22]

 Nhóm chất có cấu trúc khác

Ngoài những nhóm hợp chất đã nêu trên, một số hợp chất có cấu trúc

hác cũng được tách từ các loài thuộc chi Uvaria Ví dụ: Emorydone, Acid uvafzelic và Acid syncarpic được phân lập từ U afzelii; hợp chất Zeylena được phân lập từ U zeylanica; hai hợp chất Syncarpurea và 7-methyl juglone được phân lập từ U kirkii [22]

1.2.2 Thành phần hóa học của cây Bù dẻ tía

 Trên thế giới

Nghiên cứu định tính sơ bộ về thành phần hóa học của lá và vỏ thân

Uvaria grandiflora cho thấy sự có mặt của alcaloid, flavonoid và steroid

Dẫn chất

thơm

2-methoxybenzyl benzoat Benzyl benzoat

Benzyl-2-hydroxybenzoat Benzyl-2-methoxybenzoat Benzyl-2,6-dihydroxybenzoat Benzyl-2-hydroxy-6-methoxy benzoat Benzyl-2,6-dimethoxybenzoat

Benzyl-2-hydroxy-5-methoxy benzoat Benzyl-2,5-dimethoxybenzoat

Rễ Thái

Lan [36]

Grandiuvarone A Grandiuvarin A Grandiuvarin B Grandiuvarin C

Vỏ thân Nigeria [54]

Dẫn chất

Polyoxygenated

cyclohexen

2-acetoxyzeylenon 6-methoxyzeylenol Zeylenol

Zeylenon

Lõi gỗ Trung

Quốc [56]

1-epizeylenol Uvarigranol G Uvarigranol H Uvarigranol I 2-zeylenyl 2,6-diacetat

Rễ Trung

Quốc [46]

Grandifloron Grandifloracin Zeylenon

Thân,

lá

Trung Quốc [37] 2-O-acetyl-6-O-methylzeylenol

2-O-benzoyl-3-O-debenzoylzeylenon 3-O-debenzoylzeylenon

Trung Quốc [46] Nhóm chất

Acetogenin

Uvarigrin

Trung Quốc [47]

Triterpen Suberosol

Lupeol

Phần trên mặt đất

Trung Quốc [65]

Qua bảng 1.2., có thể thấy thành phần hóa học của cây Bù dẻ tía gồm các dẫn chất thơm, dẫn chất Polyoxygenated cyclohexen, dẫn chất triterpen, nhóm chất Acetogenin Đặc biệt, trong đó nhóm chất Polyoxygenated cyclohexen có

số lượng hợp chất nhiều đáng ể so với các nhóm đã biết khác

 Ở Việt Nam

Năm 2010, GS Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự xác định được hàm lượng tinh dầu trong lá Bù dẻ tía thu hái ở tỉnh Hà Tĩnh là 0,1% theo nguyên liệu tươi Hơn 50 hợp chất đã được phân tích từ tinh dầu lá của dược liệu này,

trong đó 33 hợp chất đã được xác định (chiếm 94,2% tổng lượng tinh dầu) Thành phần chính của tinh dầu gồm Bicyclogermacren 35,7% , β-caryophyllen (13,9%), (Z)-β-ocimen (10,7%) và một số hợp chất hàm lượng ít hơn bao gồm β-elemen, Germacren D, α-humulen… [6 Đây là nghiên cứu

về hóa học đầu tiên của loài Bù dẻ tía mọc ở Việt Nam

1.3 Tác dụng sinh học và công dụng của chi Uvaria

1.3.1 Tác dụng sinh học của chi Uvaria

Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của chi Uvaria đã cho thấy nhiều

hợp chất được phân lập từ các loài thuộc chi này có một số hoạt tính sinh học đáng lưu ý như háng u và ung thư, kháng nấm, kháng khu n, ức chế vận chuyển nucleosid… Dưới đây là một số tác dụng sinh học điển hình

 Hoạt tính kháng u và ung thƣ

Hoạt tính háng u và ung thư là một trong những hoạt tính nổi bật của

các loài thuộc chi Uvaria, đã được nghiên cứu trong nhiều công trình trên thế giới Chẳng hạn như dịch chiết ethanol từ vỏ rễ U chamae có khả năng diệt tế

bào ung thư bạch cầu dòng lympho P-388 ở chuột và diệt tế bào ung thư vòm họng ở người [52] Các hợp chất có khung pyrenedion như 2-hydroxy-1,8-

pyrenedion, 2-methoxy-1,8-pyrenedion từ loài U lucida có tác dụng ức chế

mạnh dòng tế bào HL-60 ung thư bạch cầu) với giá trị IC50 tương ứng là 0,070 và 1,044 g/ml so với chất đối chứng là Etoposide (IC50 = 0,060 g/ml) [38] Theo kết quả của một nhóm nghiên cứu người Trung Quốc, hai dẫn chất cyclohexen- Kweichowenol A và Kweichowenol B, được phân lập từ lá của

loài U kweichowensis, đã thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào

ung thư biểu mô phế quản [51] Hợp chất Uvaricin, phân lập được từ rễ loài

U accumitana, có khả năng diệt tế bào ung thư bạch cầu lympho P-388 ở

chuột [40]

Gần đây, các hợp chất Acetogenin từ họ Annonaceae đã được chứng minh là chất ức chế hiệu lực với NADH oxydase của màng tế bào ung thư, dẫn đến sự tự chết của tế bào Acetogenin còn có tác dụng ức chế các tế bào ung thư đa háng [47]

 Hoạt tính kháng khuẩn

Bên cạnh hoạt tính chống khối u, các loài thuộc chi Uvaria cũng thể hiện

hoạt tính kháng khu n trên nhiều dòng vi khu n khác nhau Các thử nghiệm

invitro đã chứng minh dịch chiết dichloromethan và methanol của một số loài như U dependens, U faulknearae, U kirkii, U laptocladon, U scheffleri, U lucida và U tanzaniae có tác dụng chống lại sự đa háng thuốc K1 của dòng Plasmodium falciparum Trong đó dịch chiết từ thân và vỏ rễ của U lucida và

vỏ rễ của U scheffleri có tác dụng mạnh nhất [49] Dịch chiết của U afzelii

có tác dụng chống lại các vi khu n Gram âm và vi khu n kháng acid [12],

[49] Dịch chiết toàn phần và các phân đoạn từ U rufa cho thấy tác dụng ức chế vi khu n lao - Mycobacterium tuberculosis H37Rv, hiệu lực ức chế càng

tăng ở những phân đoạn sạch với giá trị MIC lên tới 23 µg/mL [20] Dịch

chiết rễ cây U angolensis cũng thể hiện hoạt tính kháng khu n và gây độc tế

bào [31]

 Hoạt tính kháng nấm

Nhiều loài thuộc chi Uvaria chứa các alcaloid benzylisoquinolin có hoạt tính kháng khu n, kháng nấm mạnh như các loài U rufa Blume, U cordata (Dun.) Wall ex Alston [12], [49] U elliotiana là một trong những cây thuốc

ở Châu Phi có khả năng tiêu diệt một số loại nấm [49] Schefflone, một hợp

chất thuộc nhóm Acetogenin được phân lập từ vỏ thân và rễ của loài U scheffleri, đã thể hiện khả năng tiêu diệt các loài nấm như Fusarium solani, Botryodiplodia theobromae, Asperillus niger và Aspergillus flavus [43]

 Hoạt tính chống oxy hóa

Dịch chiết methanol từ rễ và vỏ thân loài U chamae có tác dụng chống

oxy hóa thông qua khả năng chống lại các tổn thương gan do acetaminophen

gây ra [49 Trong hi đó, theo một nghiên cứu tại Ấn Độ, dịch chiết

methanol và tinh dầu chiết từ lá của loài U narum Dunal Wall đã thể hiện

hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhờ khả năng thu gọn gốc tự do DPPH [44]

 Hoạt tính ức chế sự tạo thành các sản phẩm glycat hóa protein

(Advanced Glycation End-products - AGEs)

Glycat hóa protein là sự gắn kết của một phân tử glucose với một protein

mà không cần enzym Khi glucose kết hợp với protein s làm thay đổi cấu trúc

và chức năng của các protein Đường huyết càng tăng và sự tiếp xúc giữa đường

và protein càng lâu thì quá trình này càng lan rộng Quá trình glycat hoá sinh ra các gốc tự do và các sản ph m gọi chung là AGEs AGEs có vai trò rất quan trọng trong cơ chế bệnh sinh các biến chứng mạn của bệnh đái tháo đường Các thử nghiệm cho thấy hợp chất Isoquercitrin [Quercetin 3-O--D-glucopyranoside] và Isoquercitrin-6-acetate [Quercetin 3-(6''-O-acetyl)--D-

glucopyranoside] từ lá cây Uvaria rufa có tác dụng ức chế sự tạo thành AGEs

trong albumin huyết thanh bò với giá trị IC50 lần lượt là 8,4 và 6,9 mol/l so với đối chứng dương Quercetin (IC50 = 10,9 mol/l) [35]

1.3.2 Công dụng của chi Uvaria

Trong dân gian, nhiều loài thuộc chi Uvaria được sử dụng làm thuốc

chữa bệnh ở nhiều nơi trên thế giới Ở phía đông Châu Phi, người ta uống

nước sắc từ rễ loài U chamae để giảm đau bụng, làm thuốc xổ và hạ sốt Ở Kenya, U lucida là một loài cây thuốc quan trọng Rễ của loài này được

dùng để chữa đau dạ dày và đường ruột, đặc biệt trong trường hợp tiêu chảy

và nôn mửa Loài U welwitschii cũng được sử dụng để chữa rối loạn dạ dày

ở Kenya [38] U kweichowensis là một loài thảo mộc được người dân ở vùng

tây nam Trung Quốc sử dụng với tác dụng chống viêm và chống hối u [50]

Ở Ấn Độ, rễ U cordata có tác dụng trừ phong thấp, bổ gân cốt, lá có tác dụng

tán ứ tiêu thũng, ngừng ho [49]

Các loài thuộc chi Uvaria từ lâu cũng đã được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền của nhân dân ta Rễ U rufa dùng nấu nước cho phụ nữ sau khi sinh uống như là thuốc bổ dưỡng để hồi phục sức khoẻ Rễ và lá U microcarpa dùng để trị tiêu hóa ém, đầy bụng, ỉa chảy, đau lưng Vỏ cây U micrantha dùng làm thuốc bổ, giúp tiêu hoá, thường dùng chữa chứng đầy bụng, khó tiêu và chữa đau lưng nhức mỏi Nước sắc của vỏ cây U narum

được dùng để giảm đau cho thai phụ trong khi sinh Ngoài ra, nó còn có tác

dụng điều trị thấp khớp, đau ruột và eczema Lá của U narum được dùng trong bệnh vàng da, đau mật, sốt [12] Cây Bù dẻ lá lớn (U cordata ) từ lâu

đã được nhân dân ta sử dụng để trị chứng hó tiêu, đầy bụng, ỉa chảy, phong thấp, lưng gối mỏi, chấn thương Rễ được sử dụng làm thuốc an thần, ngừng nôn mữa, thấp khớp Lá được sử dụng để làm giảm đau, giảm sưng [12]

1.4 Tác dụng sinh học và công dụng của cây Bù dẻ tía

1.4.1 Tác dụng sinh học của cây Bù dẻ tía

Các công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của Bù dẻ tía cho thấy dược liệu này có một số tác dụng dược lý đáng lưu ý như háng u và ung thư,

kháng viêm, kháng khu n, chống oxy hóa…

 Hoạt tính kháng u và ung thƣ

Tác dụng dược lý của cây Bù dẻ tía đã được chứng minh ở một số công trình trên thế giới, trong đó nổi bật là hoạt tính ức chế sự phát triển của khối u

và tế bào ung thư Theo một nghiên cứu ở Malaysia, dịch chiết từ các phân

đoạn n-hexan, chloroform, ethanol từ thân U grandiflora có khả năng ức chế

sự phát triển dòng tế bào ung thư ruột kết HTC 116 Hoạt tính này được dự đoán là do nhóm chất Acetogenin hoặc dẫn xuất Polyoxygenated cyclohexen gây ra [19]

Các hợp chất tinh khiết phân lập từ U grandiflora cũng thể hiện khả năng gây độc tế bào ung thư Zeylenon được phân lập từ thân và lá U grandiflora, đã được chứng minh là một chất ức chế vận chuyển nucleosid,

đặc biệt trong các tế bào ung thư Ehrlich và có hả năng gây độc tế bào ung

thư nuôi cấy [37] Hợp chất Uvarigrin phân lập từ rễ cho thấy khả năng gây

độc tế bào đối với dòng tế bào khối u HCT-8 ung thư ruột kết), Bel 7402 (ung thư gan và A 2780 ung thư buồng trứng) [47] Ở Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoài và cộng sự năm 2012 [9 đã cho thấy khả năng ức chế

tế bào ung thư rất mạnh của dịch chiết toàn phần cây Bù dẻ tía trên thử

nghiệm invitro, với 6 dòng tế bào bao gồm LU-1 ung thư phổi người), KB

ung thư biểu mô), MDA-BA-321 ung thư vú , Hep G2 ung thư gan người), SW-480 ung thư ruột kết và MKN7 ung thư dạ dày) ở các giá trị IC50 từ 0,62 - 7,51 µg/ml Những kết quả trên cho thấy tính cấp thiết trong việc tiến hành các nghiên cứu về Bù dẻ tía để định hướng sử dụng dược liệu này trong tương lai

 Hoạt tính kháng viêm và kháng khuẩn

Một nghiên cứu ở Thái Lan cho thấy dịch chiết phân đoạn ethyl atetat từ

loài U grandiflora thể hiện hoạt tính kháng khu n trên 2 dòng vi khu n Escherichia coli và Vibrio cholera, trong hi đó dịch chiết phân đoạn aceton

có khả năng ức chế 4 dòng vi khu n Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Staphylococcus typhinurium và Enterobacter cloacae [24] Cũng theo

nghiên cứu này, hợp chất Zeylenol, phân lập được từ phân đoạn ethyl acetat

của loài U grandiflora, thể hiện hoạt tính kháng viêm trong thử nghiệm làm phù tai chuột và hoạt tính kháng khu n trên 4 dòng vi khu n là S typhi, S aureus và 2 dòng E coli với cùng giá trị MIC 1,00 μg/mL

 Hoạt tính chống oxy hóa

Nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa của vỏ thân U grandiflora cho

thấy dịch chiết ethanol có hàm lượng flavonoid cao nhất, biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất [42]

1.4.2 Công dụng của cây Bù dẻ tía

Theo kinh nghiệm dân gian ở Malaysia, lá U grandiflora được nấu chín

uống để điều trị đau thắt lưng, đau dạ dày, đầy hơi, làm dịu đau bụng và hỗ

trợ trong phục hồi cho phụ nữ sau khi sinh [61] Ngoài ra người dân Malaysia

còn thường dùng lá và thân U grandiflora để điều trị một số bệnh như bong

gân, đau lưng, bệnh thấp khớp, giải độc ngộ độc thực ph m, ong chích hoặc phòng chống ngộ độc rượu [53] Ở Việt Nam, cây Bù dẻ tía được các thầy lang đồng bào dân tộc Pako Vân Kiều sử dụng để chữa các bệnh liên quan đến khối u cho thấy hiệu quả tốt [9]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem - Annonaceae) Mẫu thu tại huyện Đa rông

tỉnh Quảng Trị vào tháng 9 năm 2011 Tên hoa học được xác định bởi TS Nguyễn Thế Cường - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy hô ở 50ºC- 60 C, sau đó xay thành bột thô và bảo quản ở nơi hô thoáng

Hình 2.1 Hoa của cây Bù dẻ tía Hình 2.2 Quả của cây Bù dẻ tía

- Các dòng tế bào ung thư thử nghiệm: LU-1 ung thư phổi người ,

KB ung thư biểu mô , MDA-BA-321 ung thư vú , Hep G2 ung thư gan người , SW-480 (ung thư ruột ết và MKN7 ung thư dạ dày Các dòng tế bào do GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp

2.2 Hoá chất và máy móc - thiết bị

2.2.1 Hoá chất

Dung môi được sử dụng: methanol, ethanol, n-butanol, ethyl acetat, chloroform, n-hexan, aceton, toluen, acid formic, amoniac, dichloromethan,

nước cất, acid acetic… Thuốc thử: dung dịch H2SO4 10% /Ethanol tuyệt đối, dung dịch NH3 đậm đặc, thuốc thử Magic, thuốc thử Dragendoff

Chất nhồi cột sắc ký: silicagel pha thường (silicagel 60, 0,040 – 0,063mm (230-400 mesh ASTM , Merc và pha đảo (YMC, 30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.); Sephadex LH-20, Dianion HP-20 Bản sắc ký lớp mỏng pha thường (TLC-silicagel 60 F254, Merc và pha đảo (RP18, F254, Merck)

Các hoá chất và thuốc thử đạt tiêu chu n phân tích theo quy định của Dược Điển Việt Nam IV [5]

2.2.2 Máy móc - thiết bị

Các dụng cụ thủy tinh: cột sắc ký, cốc có mỏ nhiều thể tích, đũa thủy tinh, bình cầu hai cổ nhám, ống sinh hàn, bình tam giác, bình gạn, bình chạy sắc ký, pipette

Cân phân tích hiện số Mettler Toledo AB204-S, độ chính xác 0,0001 g Micropipette 100, 200, 500 µl (Human), micropipette 50 µl (Excel monopette 8000) Bếp điện, tủ sấy Memmert, máy cô quay Yamato, bình chiết, máy lọc hút chân không Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500 FT-NMR, máy đo phổ khối phun mù điện tử AGILENT 6310 Ion Trap, máy

đo phổ UV Jacob, máy đo mật độ quang OD Microplate Reader.

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Định tính một số nhóm chất hữu cơ trong dược liệu

Định tính các nhóm chất hữu cơ theo phương pháp phân tích các nhóm hợp chất thiên nhiên có trong cây bằng phản ứng hóa học đặc trưng và sắc ý lớp mỏng [2], [7 Dự iến định tính các nhóm chất: alcaloid, anthranoid, acid hữu cơ, coumarin, flavonoid, tanin, saponin, glycosid tim, acid amin, chất

béo, đường hử, steroid…

2.3.2 Phương pháp chiết xuất

Phương pháp chiết xuất được sử dụng là phương pháp ngâm Bột dược liệu được tiến hành ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi methanol Thời gian chiết xuất: chiết 3 đợt, mỗi đợt chiết trong 1 tuần Gộp dịch chiết, bốc hơi

dung môi dưới áp suất giảm để thu được cao toàn phần

2.3.3 Phương pháp phân lập

Quá trình phân lập sử dụng phương pháp sắc ký cột với các cơ chế cột hấp phụ, cột trao đổi ion và cột lọc qua gel Sắc ký lớp mỏng được sử dụng để theo dõi quá trình rửa giải

2.3.3.1 Sắc ký cột hấp phụ

Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các

cấu tử trong hỗn hợp với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất lỏng chảy qua pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh Nhờ vậy mà có thể khai triển dung môi liên tục với nhiều hệ dung môi hác nhau có độ phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh [5], [7]

Chất nhồi cột là silicagel pha thường (silicagel 60, 0,040 - 0,063mm (230-400 mesh ASTM), Merc ; silicagel pha đảo YMC (silicagel 30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.)

2.3.3.2 Sắc ký lọc qua gel

Sử dụng chất nhồi cột là Sephadex LH-20

Nguyên tắc: Sắc ký lọc qua gel là phương pháp phân tách các phân tử

trong dung dịch dựa trên ích thước của chúng thông qua sự trao đổi lặp đi lặp lại các phân tử chất tan giữa dung môi pha động và cùng dung môi đó được pha tĩnh giữ trong các lỗ xốp của gel Khoảng ích thước lỗ của gel xác định khoảng ích thước phân tử được phân tách qua quá trình sắc ký [5] Phương pháp nhồi cột ướt được thực hiện đối với tất cả các loại sắc ký cột đã sử dụng [7]

2.3.4 Phương pháp xác định cấu trúc

Xác định cấu trúc của hợp chất tinh hiết được thực hiện thông qua phân tích dữ liệu phổ hối lượng MS , phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Kết quả biện luận được hẳng định sau hi giải phổ và so sánh với số liệu phổ trong các nghiên cứu đã được công bố trước đó

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo gồm có NMR một chiều 1

H-NMR,

C-NMR, DEPT và hai chiều HMBC, HSQC, COSY, NOESY Thực hiện trên máy Bruker Avance AM500 FT-NMR tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với chất chu n nội là tetramethyl silan (TMS) Phổ hối phun mù điện tử ESI-MS được đo trên máy AGILENT

6310 Ion Trap tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên  Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3.5 Nghiên cứu hoạt tính sinh học

2.3.5.1 Đánh giá độc tính cấp dịch chiết toàn phần của dược liệu

36 chuột BALB/c khoẻ mạnh, khối lượng 20-22 gram, không phân biệt giống, nuôi tại hu nuôi động vật của Viện Công nghệ Sinh học, được chia làm 6 lô (6 chuột/lô), và bị bỏ đói hoàn toàn 16 h trước khi cho uống dịch chiết toàn phần cây Bù dẻ tía một lần duy nhất ở các ở nồng độ 5000, 6000,

7000, 8000, 9000 và 10000 mg/kg thể trọng gP tương ứng với 6 lô thí nghiệm Cao toàn phần Bù dẻ tía được pha trong dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9% với tỷ lệ 1g/1ml Sau khi cho uống 1-2 giờ, chuột được nuôi dưỡng bình thường trở lại cho ăn, uống tự do) và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong từng lô và tính giá trị LD50 theo công thức của Abraham [18] và Turner [57]

2.3.5.2 Đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư invitro

Thử nghiệm được tiến hành trên 6 dòng tế bào ung thư mục 2.1 Mẫu thử

là dịch chiết các phân đoạn và các hợp chất tinh hiết phân lập từ dược liệu

Phương pháp nuôi cấy tế bào invitro

Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10

mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO)

Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm

CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2

Phép thử sinh học xác định mức độ độc tế bào: Phương pháp thử độ

độc tế bào invitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer

Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chu n nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng ìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991) [20] Việc xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamin B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó khi lượng tế bào càng nhiều lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Chất thử 10 l pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của hay 96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 20 g/ml Giá trị IC50 của chất thử có hoạt tính được xác định bằng cách pha chất thử ở các nồng độ 20 g/ml; 4

- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180 l) s được sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ cho tế bào vào đĩa thí nghiệm, đĩa đối chứng ngày 0 s được cố định tế bào bằng TCA (trichloracetic acid) 20% trong 1h ở 4oC

- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy

giếng bằng TCA 20% trong 30 phút ở 4oC, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37oC Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% Acid acetic rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng

Cuối cùng, sử dụng 10 mM UTB unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad để đọc kết quả

về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515

nm Khả năng ức chế sự sống sót của tế bào khi có mặt chất thử s được xác định thông qua công thức sau:

% ức chế = 100% - % sống sót

Các phép thử được lặp lại 3 lần Ellipticine Sigma được sử dụng làm chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml DMSO 10% được sử dụng như đối chứng âm Giá trị

IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc phân đoạn hóa học) hoặc IC50  4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư

% sống sót =

[OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100

OD đối chứng âm DMSO 10%) - OD(ngày 0)

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây Bù dẻ tía

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Bù dẻ

tía Uvaria grandiflora bằng các phản ứng hóa học đặc trưng được trình bày ở

bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ

từ phần trên mặt đất cây Bù dẻ tía

Nhóm chất Thuốc thử/Phương

Kết quả phản ứng

Kết quả định tính

Alcaloid

Có

Acid amin Ninhydrin 0,1% Xuất hiện màu tím + Có

Ở mặt tiếp xúc giữ hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ

+++ Không

Vòng lacton

Acid sulfuric đậm đặc Màu tím hồng +

Tanin Sắt (III) clorua 5%

Xuất hiện tủa màu xanh

Gelatin 1% Xuất hiện tủa bông trắng -

Chất béo Hơ nóng trên giấy lọc Vết mờ còn lại trên giấy

+++ Có

Ghi chú:

+++ : Phản ứng dương tính rất rõ + : Phản ứng dương tính ++ : Phản ứng dương tính rõ - : Phản ứng âm tính

Nhận xét: Kết quả nghiên cứu định tính cho thấy trong Bù dẻ tía có

alcaloid, anthranoid, acid amin, acid hữu cơ, flavonoid, chất béo, đường khử

và steroid

3.2 Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học

3.2.1 Quá trình chiết xuất

Phần trên mặt đất cây Bù dẻ tía được rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy hô ở

50 C - 60 C, sau đó xay thành bột thô và tiến hành chiết xuất, phân lập các hợp chất Lượng bột thô đem chiết xuất là 5,0 kg

 Chiết xuất cao toàn phần

Toàn bộ lượng bột thô Bù dẻ tía được cho vào bình chiết và làm m bằng methanol tuyệt đối, đậy kín, để yên cho thấm m và trương nở hoàn toàn Sau

đó thêm methanol tuyệt đối ngập dược liệu và cách bề mặt dược liệu khoảng 3cm rồi ngâm ở nhiệt độ phòng.Tiến hành chiết 3 đợt, mỗi đợt chiết trong 1 tuần Dịch chiết thu được đem cô quay hút chân hông ở 50oC thu được cắn dạng cao đặc

 Chiết các phân đoạn

Cắn toàn phần Bù dẻ tía được chiết phân đoạn với các dung môi hữu cơ

có độ phân cực tăng dần với các dung môi lần lượt là n-hexan, chloroform, ethyl acetat và n-butanol Phân tán cắn toàn phần trong khoảng 3 lít nước cất, sau đó thêm 3 lít n-hexan, khuấy đều rồi chia hỗn hợp ra 3 bình gạn dung tích

2 lít Tiến hành lắc các bình gạn để gạn lấy lớp n-hexan Lớp nước còn lại được cho thêm 3 lít n-hexan rồi tiếp tục tiến hành lắc bình gạn để gạn lấy lớp n-hexan như trên thêm 2 lần nữa Các dung môi hữu cơ còn lại được tiến hành chiết xuất phân đoạn một cách tương tự Tiến hành cất thu hồi dung môi các phân đoạn dưới áp suất giảm, thu được các cắn tương ứng, ký hiệu lần lượt là

H, C, E và B với khối lượng tương ứng lần lượt là 110g, 310g, 70g và 120g Phần dịch nước còn lại cô cách thủy đến cạn trong tủ hốt, sau đó cắn được làm khô trong tủ sấy ở 50oC, thu được cắn phân đoạn nước, ký hiệu là N với khối lượng là 150g

Căn cứ vào kết quả nghiên cứu hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào ung thư của các phân đoạn dịch chiết (H, C, E, B và N) từ cây Bù dẻ tía được trình bày ở mục 3.3.2.1 , phân đoạn chloroform đã thể hiện hoạt tính tốt nhất trong 5 phân đoạn thử nghiệm nên được ưu tiên lựa chọn để tiến hành phân lập các hợp chất tinh khiết

 Tiến hành chiết pha rắn phân đoạn chloroform (phân đoạn C)

Cắn phân đoạn C được hòa tan vào lượng methanol tối thiểu, sau đó t m với silicagel pha thường, tỷ lệ khối lượng 1:1 Khối silicagel m này được

quay cất thu hồi dung môi đến thể chất tơi mịn Bột hô thu được dùng để chiết pha rắn trong bước tiếp theo

Chu n bị cột: cột sắc ý được rửa sạch, tráng bằng methanol, để khô tự nhiên Lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn trên giá Cho silicagel pha thường lên cột sao cho bề dày lớp silicagel khoảng 1 cm, sau đó đưa lượng chất đã t m silicagel nói trên lên cột, gõ nhẹ để bột phân bố đều

Triển khai cột với hệ dung môi rửa giải lần lượt là hexan 100%, hexan : aceton với các tỷ lệ 20:1, 10:1, 5:1, 1:1 và cuối cùng là aceton 100% (1,5 lít cho mỗi hệ) Hứng các phân đoạn, cô quay cất thu hồi dung môi thu được các cắn dạng cao đặc ký hiệu lần lượt từ C1 đến C6

n-Sơ đồ quy trình chiết xuất các phân đoạn từ cây Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora được trình bày ở hình 3.1

Phần nước còn lại

Dịch chiết/MeOH

Cô quay

Lắc phân đoạn Dịch H2O

Phân tán/H2O

t0, áp suất giảm

Ngâm ở nhiệt độ phòng/MeOH

n-butanol chloroform ethyl acetat

n-hexan

E Chiết pha rắn

n-hexan

100% HA 20:1 HA 10:1 HA 5:1

aceton 100%

Bột dược liệu

Cắn

C5

HA 1:1

3.2.2 Quá trình phân lập

Quá trình khảo sát bằng SKLM nhận thấy trên sắc ý đồ của phân đoạn C2 và C5 có các cụm vết tách nhau há rõ, hơn nữa, lượng cắn các phân đoạn này thu được khá nhiều Do đó, hai phân đoạn này được ưu tiên phân lập trước

 Tiến hành phân lập phân đoạn C2

C2 được chiết pha rắn, rửa giải lần lượt bằng các dung môi n-hexan 100%, n-hexan : ethyl acetat với các tỷ lệ 20:1, 10:1, 5:1, 1:1 và ethyl acetat 100% (1 lít cho mỗi hệ), thu được 6 phân đoạn từ C2A đến C2F Phân đoạn C2B được triển khai bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải methanol : nước (3:1) thu được 7 phân đoạn từ C2B1 đến C2B7 Sau khi khảo sát bằng SKLM, phân đoạn C2B6 được phân lập tiếp bằng sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat : aceton (20:1:0,5 , thu được 5 phân đoạn từ C2B6A đến C2B6E Trong đó phân đoạn C2B6C trên sắc ý đồ chỉ còn lại 3 vết tách nhau, trong đó có một vết gần như tách hẳn các vết khác

Do đó C2B6C được ưu tiên đưa lên cột sắc ký lọc gel với pha động là

methanol 80%, quá trình rửa giải thu được hợp chất 1 (ký hiệu UGC12, khối

lượng 25mg) Kiểm tra bằng SKLM với 3 hệ dung môi khác nhau là aceton : nước 2:1 SKLM pha đảo), n-hexan : ethyl acetat : aceton (20:1:0,8), chloroform : methanol (25:1) SKLM pha thường) cho thấy đây là một chất sạch

Quá trình phân lập hợp chất 1 từ C2 được thể hiện ở hình 3.2

 Tiến hành phân lập phân đoạn C5

C5 được triển khai trên sắc ký cột pha thường, rửa giải bằng hệ chloroform : methanol 40:1 , thu được 4 phân đoạn từ C5A đến C5D Trên sắc ý đồ nhận thấy C5A có các cụm vết tách há rõ Do đó C5A được sắc ký lặp lại bằng cột silicagel pha thường với hệ n-hexan: aceton 5:1 thu được 7 phân đoạn từ C5A1 đến C5A7 Trong đó, 3 phân đoạn C5A2, C5A5 và C5A7 khi kiểm tra bằng SKLM cho thấy khả năng tách chiết tốt nên được ưu tiên để tiến hành phân lập ở bước tiếp theo

Phân đoạn C5A2 được cho lên cột sắc ý pha đảo, rửa giải bằng hệ aceton : nước : acid formic (3:1:0,1 , thu được 4 phân đoạn từ C5A2A đến

SKC pha đảo

C2 Chiết pha rắn

C2B3 1

C2B4 1

C2B5 1

C2B6 1

C2B7 1 n-hexan : ethyl acetat : aceton (20:1:0,5) SKC pha thường

C2B6A

Hợp chất 1 (UGC12)

SKC Sephadex LH 20 methanol 80%

C5A2D Phân đoạn C5A2B được phân lập bằng cột sắc ký lọc gel, rửa giải bằng methanol 80% thu được 3 phân đoạn từ C5A2B1 đến C5A2B3 Quan sát phân đoạn C5A2B2 thấy có các tinh thể hình kim xuất hiện Tiến hành lọc lấy tinh thể, rửa tinh thể bằng methanol nhiều lần, sau đó bay hơi dung môi thu

được một hợp chất kết tinh màu vàng nhạt là hợp chất 2 (ký hiệu UGLE1,

khối lượng 270mg) Kiểm tra bằng SKLM với 3 hệ dung môi khác nhau là aceton : nước : acid formic (3,5:1:0,1) SKLM pha đảo), n-hexan : aceton (4:1), chloroform : methanol (12:1) SKLM pha thường) cho thấy đây là một chất sạch

Tinh chế phân đoạn C5A5 bằng cột sắc ký lọc gel, rửa giải bằng dung

môi methanol 100%, thu được hợp chất 3 (ký hiệu UGC5, khối lượng 167mg) Kiểm tra hợp chất 3 trên SKLM với các hệ dung môi methanol :

nước (3:1), chloroform : methanol (6:1) và n-hexan : ethyl acetat : aceton (4:1,5:1) cho thấy đây là một hợp chất tinh khiết

Phân đoạn C5A7 xuất hiện tinh thể trắng hi được cô đặc, tiến hành lọc,

rửa tinh thể bằng methanol nhiều lần thu được hợp chất 4 (ký hiệu UGC8, khối lượng 12,5mg) Hợp chất 4 được xác nhận là một hợp chất sạch khi

kiểm tra bằng SKLM với các hệ dung môi aceton : nước (2:1), n-hexan : aceton (5:2) và chloroform : methanol : acid formic (7:1:0,1)

Các bước tiến hành phân lập các hợp chất 2, 3 và 4 từ phân đoạn C5

được thể hiện ở hình 3.3

3.2.3 Nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc

3.2.3.1 Hợp chất 1 (UGC12)

Hợp chất 1 (ký hiệu UGC12 được tách ra dưới dạng bột màu vàng, tan

trong hỗn hợp chloroform và methanol, Rf = 0,30 trên SKLM pha thường với

hệ n-hexan : ethyl acetat : aceton (20:1:0,8)), hiện vết màu vàng tươi với

methanol 100%

methanol 80% SKC Shephadex LH 20

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất 2 (UGLE1), hợp chất 3 (UGC5) và

hợp chất 4 (UGC8) từ phân đoạn C5

Hợp chất 4 (UGC8)

thuốc thử H2SO4 10%

Phổ 1H-NMR (DMSO-d6) của UGC12 xác nhận sự có mặt của 1 nhóm

imin H 10,76 (s); 1 nhóm hydroxy tại H 10,09 (br.s) Hệ spin AMX được

quan sát thấy tại H 8,62 (1H, d, 8,5); 7,07 (1H, d, 8,5) và 7,36 (1H, t, 8,5)

Ngoài ra, còn có 2 tín hiệu singlet của 2 proton thơm hác tại H 7,84; 7,42 và proton của 2 nhóm methoxy tại H 4,00; 4,04

Các phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy phân tử có chứa 17 nguyên tử C gồm 2 nhóm methoxy tại C 56,9; 59,8; 5 nhóm methin thơm và 10 cacbon không liên kết H Các tín hiệu tại C 150,5 (C-3); 153,7 (C-8); 154,1 (C-4) thuộc về các nguyên tử cacbon của nhân thơm gắn với oxy Tín hiệu tại C

168,3 (s) thuộc về cacbon của nhóm -CO-NH-

Tương tác HMBC của 3-OMe/C-3, 8-OMe/C-8 cho phép định vị 2 nhóm methoxy vào C-3, C-4 Vị trí của nhóm -CO-NH- trong phân tử được khẳng định qua tương tác HMBC của proton của nhóm NH (H 10,76) với C-1, 9,

10, 10a, 11 Ngoài ra, các tương tác vinylic của các proton thơm với cacbon của hệ vòng thơm H-2/C-4, 10a, 11; H-5/C-4a, 7, 8a; H-6/C-4b, 8; H-7/C-5,

8a và H-9/C-4b, 8, 10a cho phép thiết lập bộ khung phenanthren của UGC12

Dựa vào các dữ kiện phổ, hợp chất UGC12 được xác định là

10-amino-4-hydroxy-3,8-dimethoxyphenanthrene-1-cacboxylic lactam còn được gọi là Uvarilactam, Griffithinam, Gonioffithine Cấu trúc hóa học và dữ liệu phổ

NMR của UGC12 được trình bày trong hình 3.4 và bảng 3.2

Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất UGC12