3.3.2.1. Của dịch chiết các phân đoạn
Dịch chiết các phân đoạn H, C, E, B và N phương pháp chiết được trình bày ở mục 3.2.1. được đưa thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng tế bào MDA-BA-321 ung thư vú và MKN7 ung thư dạ dày . Kết quả được thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào các dịch chiết phân đoạn trên 2 dòng tế bào MDA-BA-321 và MKN7
Nồng độ (µg/ml) Phân đoạn H (% ức chế) Phân đoạn C (% ức chế) Phân đoạn E (% ức chế) MDA- BA-321 MKN7 MDA- BA-321 MKN7 MDA- BA-321 MKN7 100 104,47 100,56 99,12 97,89 98,59 98,05 20 93,68 91,42 97,72 96,92 79,65 80,37 4 37,72 39,09 94,83 74,84 31,32 32,82 0,8 24,12 22,34 36,49 38,13 18,33 21,77 IC50 3,27 3,42 0,971 1,305 8,44 8,08 Nồng độ (µg/ml) Phân đoạn B (% ức chế) Phân đoạn N (% ức chế) Ellipticine (% ức chế) MDA- BA-321 MKN7 MDA- BA-321 MKN7 MDA- BA-321 MKN7 100 95,70 97,35 74,91 76,55 90,77 99,78 20 48,16 51,21 29,47 32,08 59,72 65,72 4 27,19 30,02 21,84 23,49 19,76 33,33 0,8 21,14 20,46 14,47 17,82 -0,54 5,76 IC50 22,72 18,77 60,92 52,48 1,249 0,935
Ghi chú: Nồng độ thử nghiệm của Ellipticine lần lượt là 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4
Kết quả trên cho thấy, dịch chiết các phân đoạn chloroform, n-hexan và ethyl acetat đều có hoạt tính ức chế hai dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Phân đoạn n- butanol có hoạt tính gây độc dòng tế bào MKN7 nhưng hông có hoạt tính trên dòng MDA-BA-321. Phân đoạn nước được xem là không có khả năng ức chế hai dòng tế bào thử nghiệm. Trong đó, phân đoạn chloroform cho hoạt tính tốt nhất trên cả hai dòng tế bào MDA-BA-321 và MKN7 với giá trị IC50 thấp nhất lần lượt là 0,971 và 1,305 µg/ml. Hai phân đoạn ethyl acetat và n-hexan cũng được xem là có hoạt tính tốt, trong đó phân đoạn n-hexan có hoạt tính tốt hơn so với phân đoạn ethyl acetat. Giá trị IC50 trên hai dòng tế bào thử nghiệm của phân đoạn n-hexan là 3,27 và 3,42 µg/ml, so với của phân đoạn ethyl acetat là 8,44 và 8,08 µg/ml.
Căn cứ vào kết quả trên, trong 5 phân đoạn dịch chiết đem thử nghiệm, phân đoạn chloroform thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư mạnh nhất nên được ưu tiên lựa chọn để tiến hành phân lập các hợp chất tinh khiết.
3.3.2.2. Của các hợp chất tinh khiết phân lập được
Các hợp chất phân lập (hợp chất 1, 2, 3 và 4 được thử nghiệm khả năng gây độc tế bào trên dòng tế bào LU-1. Kết quả sàng lọc cho thấy cả 4 hợp chất này đều có hả năng ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư ở nồng độ 100 g/ml nên được tiếp tục xác định giá trị IC50. Kết quả của thử nghiệm xác định giá trị IC50 được thể hiện trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả xác định giá trị IC50 của các hợp chất phân lập được trên dòng tế bào LU-1
Nồng độ (µg/ml) % Ức chế Hợp chất 1 Hợp chất 2 Hợp chất 3 Hợp chất 4 Ellipticine 100 97,94 111,17 108,41 106,48 86,66 20 53,52 107,54 37,46 48,44 76,23 4 41,23 82,73 22,99 35,70 30,31 0,8 28,65 31,74 13,12 25,92 13,12 IC50 16,66 1,30 37,63 26,19 0,67
Ghi chú: Nồng độ thử nghiệm của Ellipticine lần lượt là 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4
Cả 4 hợp chất phân lập được đều có hoạt tính gây độc dòng tế bào LU-1, trong đó hợp chất 2 có hoạt tính mạnh nhất với giá trị IC50 thấp nhất là 1,30 g/ml (< 4 g/ml . Do đó đây được xác định là hợp chất có tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư dòng LU-1. Ba hợp chất còn lại thể hiện hoạt tính ở các mức độ hác nhau. Trong đó hợp chất 1 có hoạt tính mạnh hơn hợp chất 4 và hợp chất 3 có hoạt tính yếu nhất. Giá trị IC50 trên dòng tế bào thử nghiệm của hợp chất 1 là 16,66 g/ml, so với của hợp chất 4 là 26,19 g/ml và của hợp chất 3 là 37,63 g/ml.
Chƣơng 4
BÀN LUẬN
Trong quá trình nghiên cứu thuốc mới từ cây cỏ, kiến thức y học dân tộc bản địa có vai trò cực kỳ quan trọng trong các định hướng nghiên cứu ban đầu, qua đó tiết kiệm được rất nhiều thời gian, công sức và tiền của. Việc tìm hiểu, nghiên cứu tri thức bản địa, sàng lọc tìm kiếm các hoạt chất có tác dụng làm thuốc từ dược liệu luôn là hướng đi được ưu tiên và mang lại nhiều triển vọng cho công cuộc tìm kiếm thuốc mới của nhân loại. Nước ta có nhiều dân tộc sinh sống, mỗi dân tộc có bản sắc văn hoá riêng, một trong số đó là truyền thống sử dụng cây cỏ làm thuốc của cộng đồng các dân tộc thiểu số. Tri thức đó là ết quả quá trình đấu tranh sinh tồn của con người, là những kiến thức đã được tích luỹ hàng trăm năm và được lưu truyền qua nhiều thế hệ. Cây thuốc dân tộc và tri thức bản địa về sử dụng cây cỏ làm thuốc của các dân tộc ở Việt Nam là một nguồn tài nguyên quý giá, có giá trị khoa học và có ý nghĩa thực tiễn to lớn.
Sự gia tăng nhanh chóng căn bệnh ung thư đang là một sức ép lớn cho sức khỏe cộng đồng và hệ thống y tế trên toàn thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Tại các nước phát triển, ung thư là nguyên nhân gây tử vong thứ hai sau tim mạch. Ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng 10,9 triệu ca ung thư mới mắc và khoảng 6,7 triệu người chết vì ung thư. Tại Việt Nam, hàng năm có hoảng 100.000 - 150.000 trường hợp mới mắc ung thư và hoảng 70.000 người chết do ung thư [11]. Cho đến nay, ung thư vẫn là căn bệnh hiểm nghèo và điều trị ung thư đang là thách thức lớn cho các nhà khoa học. Có nhiều phương pháp điều trị bệnh ung thư và hiện nay các thuốc điều trị dùng trên lâm sàng thường gây ra nhiều tác dụng phụ, độc với cơ thể. Vì vậy xu hướng hiện nay của khoa học là nghiên cứu, tìm kiếm các thuốc, các sản ph m có nguồn gốc tự nhiên đáp ứng trong điều trị và an toàn hơn với cơ thể.
Đồng bào Pako Vân Kiều ở huyện Đa rông, tỉnh Quảng Trị là một trong những dân tộc ít người có nhiều kinh nghiệm trong việc sử dụng cây thuốc để phòng và chữa bệnh. Năm 2005, nghiên cứu của một nhóm ở Đại học Y Hà Nội cho thấy, có 31 bài thuốc theo kinh nghiệm của người Vân Kiều, cấu thành từ 88 vị thuốc có sẵn tại địa phương để chữa 14 bệnh thông thường. Trong đó, có 7 bài thuốc có giá trị sử dụng cao dùng để chữa một số bệnh như viêm gan cấp, viêm dạ dày, viêm đường tiết niệu, sỏi thận... [14]. Bù dẻ tía là một trong những cây thuốc được các thầy lang của đồng bào Pako, Vân Kiều dùng để chữa một số bệnh liên quan đến khối u. Qua nghiên cứu của đề tài, lần đầu tiên Bù dẻ tía được đưa vào thử nghiệm hoạt tính ức chế tế bào ung thư. Và ết quả nghiên cứu đã cho thấy dược liệu này có hoạt tính ức chế mạnh cả 6 dòng tế bào thử nghiệm gồm LU-1 ung thư phổi người), KB (ung thư biểu mô), MDA-BA-321 ung thư vú , Hep G2 ung thư gan người), SW- 480 ung thư ruột kết và MKN7 ung thư dạ dày) với giá trị IC50 thấp từ 0,62 - 7,51 µg/ml, trong đó hoạt tính mạnh nhất trên 2 dòng MDA-BA-321 và MKN7 [11]. Do đó 2 dòng tế bào này được lựa chọn cho nghiên cứu tác dụng sinh học của dịch chiết các phân đoạn.
Tuy nhiên theo các tài liệu thu thập được cho đến nay, các nghiên cứu về Bù dẻ tía ở Việt Nam còn rất ít. Do vậy, việc nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học theo hướng ức chế tế bào ung thư của Bù dẻ tía là cần thiết. Từ đó có thể góp phần quan trọng giải thích tri thức làm thuốc của đồng bào dân tộc Pako Vân Kiều ở Quảng Trị và đề xuất cơ sở cho việc sử dụng dược liệu này trong tương lai.
4.1. Về quy trình, phƣơng pháp chiết xuất và phân lập
Phần trên mặt đất của cây Bù dẻ tía được sấy khô, xay thành bột thô và chiết xuất bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi là methanol tuyệt đối. Methanol được xem là một dung môi có thể hòa tan được hầu hết các nhóm hợp chất. Methanol có khả năng thấm xuyên qua màng tế
bào thực vật, cũng như có thể tạo cầu nối hydrogen liên phân tử với các nhóm phân cực khác nên nó có thể chiết được cả các hợp chất có độ phân cực mạnh, vừa và yếu [13].
Trong nghiên cứu này, quá trình phân lập đã sử dụng phối ết hợp nhiều phương pháp chiết xuất và sắc ý như chiết xuất phân đoạn lỏng - lỏng với độ phân cực của dung môi tăng dần để tách tốt các phân đoạn, chiết pha rắn, sắc ý cột với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo, sắc ý cột Sephadex LH 20, sắc ý lớp mỏng pha thường, pha đảo... Đây là các phương pháp sắc ý thường quy và inh điển được sử dụng trong phòng thí nghiệm. Cho đến nay, đây cũng là các phương pháp được sử dụng hiệu quả trong nghiên cứu chiết tách các hợp chất từ thiên nhiên.
Sau một thời gian nghiên cứu, qua rất nhiều công đoạn đã phân lập được 4 hợp chất tinh hiết từ Bù dẻ tía. Các hợp chất tinh hiết được xác định cấu trúc thông qua dữ liệu vật lý màu sắc, nhiệt độ nóng chảy , các số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY, NOESY và phổ hối lượng MS. Hiện nay, đây là các phương pháp hiện đại thường được sử dụng để xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ thiên nhiên, cho ết quả với độ tin cậy cao [8].
4.2. Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hƣớng tác dụng sinh học
Trong quá trình thực hiện, đề tài đã nghiên cứu thành phần hóa học của Bù dẻ tía theo định hướng lấy tác dụng sinh học để dẫn đường. Cụ thể là từ dịch chiết toàn phần có hoạt tính đã tạo dịch chiết 5 phân đoạn và đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư của các phân đoạn với mục đích lựa chọn ra được phân đoạn có hoạt tính tốt nhất để tiếp tục nghiên cứu về thành phần hóa học. Từ kết quả đó, phân đoạn chloroform đã được chọn để tiến hành phân lập các hợp chất tinh khiết.
đã mang lại kết quả như mong đợi. Đó là đã phân lập được 4 hợp chất có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ở các mức độ khác nhau. Theo định hướng của phương pháp thì cần phải thử nghiệm hoạt tính tiếp ở các phân đoạn đã được phân cắt nhỏ hơn từ dịch chiết chloroform để dẫn đường cho quá trình phân lập. Tuy nhiên với điều kiện còn hạn chế về thời gian và inh phí nên đề tài đã chiết tách phân lập trực tiếp theo định hướng chiết tách các hợp chất chính (phân lập các hợp chất có hàm lượng lớn thông qua định tính trên bản mỏng sắc ký) từ các phân đoạn này. Với 4 hợp chất phân lập được có hoạt tính ức chế tế bào ung thư ở các mức độ hác nhau đặc biệt là 1 hợp chất có hoạt tính rất tốt), kết quả của đề tài đã mở ra triển vọng tìm kiếm hợp chất làm thuốc điều trị ung thư từ dược liệu Bù dẻ tía. Hiện nay việc lấy tác dụng sinh học dẫn đường cho nghiên cứu thành phần hóa học là một hướng đi đúng cho quá trình tìm iếm các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học theo định hướng mong muốn.
4.3. Về độc tính cấp của dịch chiết toàn phần dƣợc liệu
Trong dân gian, một số cây thuộc họ Na thường cho quả ăn được, ví dụ như quả của loài mãng cầu ta - Annona squamosa, mãng cầu xiêm - Annona muricata, bình bát - Annona reticulata… Tuy nhiên, một số bộ phận khác lại có độc tính. Kinh nghiệm dân gian cho rằng hạt mãng cầu chứa chất độc và dùng hạt giã nhỏ lấy nước làm thuốc sát trùng ngoài da, diệt côn trùng; dịch chiết lá cây bình bát nước – Annona glabra L. cũng có độc tính, dùng để trừ chấy, rận [68]; Ở Peru, hạt của loài Annona cherimolia có thể gây loét giác mạc và mù mắt, nhựa mủ loài Annona chrysophylla Bojer gây kích ứng da [67 … Dưới góc độ khoa học, trong thành phần hóa học các loài thuộc họ Na thường chứa alcaloid. Đây là một nhóm chất có tác dụng sinh học mạnh nhưng độc tính cũng há cao. Trên thế giới, một số loài thuộc họ Na đã được nghiên cứu về độc tính. Chẳng hạn như người ta đã xác định liều LD50 của dịch chiết phân đoạn ethanol từ vỏ rễ loài U. chamae là 166mg/kg thể trọng
chuột [54], của dịch chiết nước từ lá loài Annona muricata là 155 ± 20 mg/kg thể trọng chuột [55]. Một nghiên cứu ở Ấn Độ đã xác định liều an toàn trên chuột của dịch chiết từ hạt Annona squamosa là 300mg/kg thể trọng, đồng thời chỉ ra rằng dịch chiết hạt A. squamosa độc gấp 7 lần so với dịch chiết hạt
Pongamia pinnata cây Đậu dầu- họ Đậu) [21 . Như vậy có thể thấy một số loài thuộc họ Na có độc tính ở một mức độ nhất định.
Tuy nhiên, theo kết quả của đề tài, dịch chiết toàn phần phần trên mặt đất cây Bù dẻ tía không thể hiện độc tính cấp ở các mức liều đã nghiên cứu và với liều lớn nhất có thể cho chuột uống được 10000 mg/kg chuột tương đương 62,5g dược liệu/ kg chuột) chưa xác định được giá trị LD50. Liều này tương đương với liều dùng ở người là 5,2g dược liệu/kg, liều này cao gấp 43 lần so với liều dùng Bù dẻ tía trên thực tế của đồng bào dân tộc bản địa là 6g/ người/ ngày 0,12g dược liệu/kg). Kết quả này cho thấy Bù dẻ tía là một dược liệu khá an toàn về mặt đánh giá độc tính cấp.
4.4. Về tác dụng sinh học của dịch chiết các phân đoạn
Trong quá trình nghiên cứu, hi xác định hoạt tính gây độc tế bào của 5 phân đoạn dịch chiết H, C, E, B và N trên 2 dòng tế bào MDA-BA-321 và MKN7 đã nhận thấy một điều đáng lưu ý là giá trị IC50 của dịch chiết các phân đoạn trên 2 dòng tế bào thử nghiệm là xấp xỉ như nhau. Điều này gợi lên một giả thuyết tác dụng của dịch chiết các phân đoạn trên các dòng tế bào ung thư có sự tương đồng. Do đó trong thời gian tiếp theo, các phân đoạn có hoạt tính tốt nên được thử hoạt tính gây độc tế bào trên nhiều dòng khác nữa để có một cái nhìn toàn diện và đầy đủ hơn về tác dụng sinh học của các phân đoạn đó.
Việc tìm ra phân đoạn chloroform có tác dụng tốt nhất không những có ý nghĩa trong việc định hướng cho quá trình chiết tách và phân lập mà điều này còn hướng đến sử dụng dịch chiết phân đoạn trong quá trình phát triển thành
thuốc. Việc sử dụng cao chiết có một số thành phần xác định s thuận lợi cho công tác tiêu chu n hóa cao dược liệu. Điều quan trọng hơn nữa là cao chiết chloroform có tác dụng gần như tương đương với cao toàn phần trong khi khối lượng chỉ bằng khoảng 1/6 so với khối lượng của cao toàn phần. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình nghiên cứu thuốc từ dược liệu. Vì như chúng ta biết, hó hăn trong việc phát triển thuốc dân tộc cổ truyền