Quá trình khảo sát bằng SKLM nhận thấy trên sắc ý đồ của phân đoạn C2 và C5 có các cụm vết tách nhau há rõ, hơn nữa, lượng cắn các phân đoạn này thu được khá nhiều. Do đó, hai phân đoạn này được ưu tiên phân lập trước.
Tiến hành phân lập phân đoạn C2
C2 được chiết pha rắn, rửa giải lần lượt bằng các dung môi n-hexan 100%, n-hexan : ethyl acetat với các tỷ lệ 20:1, 10:1, 5:1, 1:1 và ethyl acetat 100% (1 lít cho mỗi hệ), thu được 6 phân đoạn từ C2A đến C2F. Phân đoạn C2B được triển khai bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải methanol : nước (3:1) thu được 7 phân đoạn từ C2B1 đến C2B7. Sau khi khảo sát bằng SKLM, phân đoạn C2B6 được phân lập tiếp bằng sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat : aceton (20:1:0,5 , thu được 5 phân đoạn từ C2B6A đến C2B6E. Trong đó phân đoạn C2B6C trên sắc ý đồ chỉ còn lại 3 vết tách nhau, trong đó có một vết gần như tách hẳn các vết khác. Do đó C2B6C được ưu tiên đưa lên cột sắc ký lọc gel với pha động là methanol 80%, quá trình rửa giải thu được hợp chất 1 (ký hiệu UGC12, khối lượng 25mg). Kiểm tra bằng SKLM với 3 hệ dung môi khác nhau là aceton : nước 2:1 SKLM pha đảo), n-hexan : ethyl acetat : aceton (20:1:0,8), chloroform : methanol (25:1) SKLM pha thường) cho thấy đây là một chất sạch.
Tiến hành phân lập phân đoạn C5
C5 được triển khai trên sắc ký cột pha thường, rửa giải bằng hệ chloroform : methanol 40:1 , thu được 4 phân đoạn từ C5A đến C5D. Trên sắc ý đồ nhận thấy C5A có các cụm vết tách há rõ. Do đó C5A được sắc ký lặp lại bằng cột silicagel pha thường với hệ n-hexan: aceton 5:1 thu được 7 phân đoạn từ C5A1 đến C5A7. Trong đó, 3 phân đoạn C5A2, C5A5 và C5A7 khi kiểm tra bằng SKLM cho thấy khả năng tách chiết tốt nên được ưu tiên để tiến hành phân lập ở bước tiếp theo.
Phân đoạn C5A2 được cho lên cột sắc ý pha đảo, rửa giải bằng hệ aceton : nước : acid formic (3:1:0,1 , thu được 4 phân đoạn từ C5A2A đến
SKC pha đảo C2 Chiết pha rắn C2A C2B C2C C2D C2E C2F HE 20:1 n- hexan 100% ethyl acetat 100% HE 10:1 HE 5:1 HE 1:1 methanol : nước (3:1)
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp chất 1 (UGC12) từ phân đoạn C2
C2B1 1 C2B2 1 C2B3 1 C2B4 1 C2B5 1 C2B6 1 C2B7 1
n-hexan : ethyl acetat : aceton (20:1:0,5) SKC pha thường C2B6A Hợp chất 1 (UGC12) SKC Sephadex LH 20 methanol 80% C2B6B C2B6C C2B6D C2B6E
C5A2D. Phân đoạn C5A2B được phân lập bằng cột sắc ký lọc gel, rửa giải bằng methanol 80% thu được 3 phân đoạn từ C5A2B1 đến C5A2B3. Quan sát phân đoạn C5A2B2 thấy có các tinh thể hình kim xuất hiện. Tiến hành lọc lấy tinh thể, rửa tinh thể bằng methanol nhiều lần, sau đó bay hơi dung môi thu được một hợp chất kết tinh màu vàng nhạt là hợp chất 2 (ký hiệu UGLE1, khối lượng 270mg). Kiểm tra bằng SKLM với 3 hệ dung môi khác nhau là aceton : nước : acid formic (3,5:1:0,1) SKLM pha đảo), n-hexan : aceton (4:1), chloroform : methanol (12:1) SKLM pha thường) cho thấy đây là một chất sạch.
Tinh chế phân đoạn C5A5 bằng cột sắc ký lọc gel, rửa giải bằng dung môi methanol 100%, thu được hợp chất 3 (ký hiệu UGC5, khối lượng 167mg). Kiểm tra hợp chất 3 trên SKLM với các hệ dung môi methanol : nước (3:1), chloroform : methanol (6:1) và n-hexan : ethyl acetat : aceton (4:1,5:1) cho thấy đây là một hợp chất tinh khiết.
Phân đoạn C5A7 xuất hiện tinh thể trắng hi được cô đặc, tiến hành lọc, rửa tinh thể bằng methanol nhiều lần thu được hợp chất 4 (ký hiệu UGC8, khối lượng 12,5mg). Hợp chất 4 được xác nhận là một hợp chất sạch khi kiểm tra bằng SKLM với các hệ dung môi aceton : nước (2:1), n-hexan : aceton (5:2) và chloroform : methanol : acid formic (7:1:0,1).
Các bước tiến hành phân lập các hợp chất 2, 3 và 4 từ phân đoạn C5 được thể hiện ở hình 3.3.
3.2.3. Nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc
3.2.3.1. Hợp chất 1 (UGC12)
Hợp chất 1 (ký hiệu UGC12 được tách ra dưới dạng bột màu vàng, tan trong hỗn hợp chloroform và methanol, Rf = 0,30 trên SKLM pha thường với hệ n-hexan : ethyl acetat : aceton (20:1:0,8)), hiện vết màu vàng tươi với
methanol 100%
methanol 80% SKC Shephadex LH 20
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập hợp chất 2 (UGLE1), hợp chất 3 (UGC5) và hợp chất 4 (UGC8) từ phân đoạn C5
C5
SKC pha thường n-hexan: aceton (5:1) C5A1
SKC pha thường
C5A C5B C5C C5D
chloroform : methanol (40:1)
C5A2 C5A3 C5A4 C5A5 C5A6 C5A7
C5A2A
aceton : nước : acid formic (3:1:0,1) SKC pha đảo
C5A2B C5A2C C5A2D
SKC Shephadex LH 20
C5A2B1 C5A2B2 C5A2B3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lọc rửa bằng methanol
Hợp chất 2
(UGLE1) Bay hơi dung môi
Lọc rửa bằng methanol
Hợp chất 3 (UGC5)
Hợp chất 4 (UGC8)
thuốc thử H2SO4 10%.
Phổ 1H-NMR (DMSO-d6) của UGC12 xác nhận sự có mặt của 1 nhóm imin H 10,76 (s); 1 nhóm hydroxy tại H 10,09 (br.s). Hệ spin AMX được quan sát thấy tại H 8,62 (1H, d, 8,5); 7,07 (1H, d, 8,5) và 7,36 (1H, t, 8,5). Ngoài ra, còn có 2 tín hiệu singlet của 2 proton thơm hác tại H 7,84; 7,42 và proton của 2 nhóm methoxy tại H 4,00; 4,04.
Các phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy phân tử có chứa 17 nguyên tử C gồm 2 nhóm methoxy tại C 56,9; 59,8; 5 nhóm methin thơm và 10 cacbon không liên kết H. Các tín hiệu tại C 150,5 (C-3); 153,7 (C-8); 154,1 (C-4) thuộc về các nguyên tử cacbon của nhân thơm gắn với oxy. Tín hiệu tại C
168,3 (s) thuộc về cacbon của nhóm -CO-NH-.
Tương tác HMBC của 3-OMe/C-3, 8-OMe/C-8 cho phép định vị 2 nhóm methoxy vào C-3, C-4. Vị trí của nhóm -CO-NH- trong phân tử được khẳng định qua tương tác HMBC của proton của nhóm NH (H 10,76) với C-1, 9, 10, 10a, 11. Ngoài ra, các tương tác vinylic của các proton thơm với cacbon của hệ vòng thơm H-2/C-4, 10a, 11; H-5/C-4a, 7, 8a; H-6/C-4b, 8; H-7/C-5, 8a và H-9/C-4b, 8, 10a cho phép thiết lập bộ khung phenanthren của UGC12.
Dựa vào các dữ kiện phổ, hợp chất UGC12 được xác định là 10-amino- 4-hydroxy-3,8-dimethoxyphenanthrene-1-cacboxylic lactam còn được gọi là
Uvarilactam, Griffithinam, Gonioffithine. Cấu trúc hóa học và dữ liệu phổ NMR của UGC12 được trình bày trong hình 3.4. và bảng 3.2.
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất UGC12 C δC δH HMBC (HC) 1 121,5 (s) 2 109,9 (d) 7,84 (1H, s) C-1, 3, 4, 10a, 11 3 150,5 (s) 3-OCH3 59,8 (q) 4,00 (3H, s) C-3 4 154,1 (s) 4-OH 10,09 (1H, br.s) C-10a 4a 120,1 (s) 4b 127,0 (s) 5 117,9 (d) 8,62 (1H, d, 8,5 Hz) C-4a, 7, 8a 6 125,7 (d) 7,36 (1H, t, 8,5 Hz) C-4b, 8 7 112,1 (d) 7,07 (1H, d, 8,5 Hz) C-5, 8, 8a 8 153,7 (s) 8a 123,9 (s) 8-OCH3 56,9 (q) 4,04 (3H, s) C-8 9 98,6 (d) 7,42 (1H, s) C-4b, 8, 10a 10 133,8 (s) 10a 123,3 (s) 11 168,3 (s) CONH 10,76 (1H, s) C-1, 10, 10a, 11 1
H (500 MHz), 13C (125 MHz) đo trong DMSO-d6, dùng TMS làm chất chuẩn nội.
3.2.3.2. Hợp chất 2 (UGLE1)
Hợp chất 2 (ký hiệu UGLE1 được tách ra dưới dạng bột màu vàng nhạt, tan trong các dung môi chloroform, aceton và methanol, Rf = 0,50 (trên SKLM pha đảo với hệ aceton : nước : acid formic (3,5:1:0,1)).
Phổ ESI-MS (-) của UGLE1 cho pic ion giả phân tử tại m/z 313,4 [M- H+2H2O]-(100%). Kết hợp với phổ 13C, DEPT cho phép xác định công thức phân tử của UGLE1 là C14H14O6 (M = 278,3 g/mol).
Phổ 1H-NMR chỉ ra tín hiệu của 5 proton thơm thuộc nhóm benzoyloxy tại H 7,46 (2H, ddd, 1,0, 8,5, 8,5 Hz); 7,60 (1H, tt, 1,0, 8,5 Hz); 7,94 (2H, dd, 1,0, 8,5 Hz). Tín hiệu của 2 cis proton olefinic tại H 6,07 (1H, dd, 10,5, 2,5 Hz); 7,00 (1H, dd, 10,5, 2,5 Hz) và 4 proton gắn với các nguyên tử cacbon liên kết oxy tại H 3,99-4,69.
Phổ 13C-NMR, DEPT cho biết phân tử có 14 nguyên tử cacbon gồm 1 nhóm methylen, 9 nhóm methin và 4 nguyên tử cacbon không liên kết với H. Trong đó tín hiệu cacbon của nhóm benzoyloxy tại C 129,5 (C-3’, 5’ ; 130,4 (C-2’, 6’ ; 131,1 C-1’ ; 134,3 C-4’ và 167,2 C-7’ . Cacbon của nhóm cacbonyl cộng hưởng tại C 197,5 (C-6); 2 cacbon olefinic tại C 127,6 (C-5); 153,0 (C-4) và 4 nguyên tử cacbon sp3 gắn với oxy tại C 63,3 (C-7); 70,2 (C- 3); 75,7 (C-2); 77,2 (C-1).
Các tương tác COSY giữa H-2/H-3, H-3/H-4, H-4/H-5 và các tương tác HMBC giữa H-2/C-6, H-2/C-4, H-4/C-2, H-4/C-6, H-5/C-1, H-5/C-3 cho phép thiết lập vòng 6 cạnh với nối đôi tại vị trí 4,5 và nhóm oxo ở vị trí 6. Tương tác HMBC của H-7/C-1, H-7/C-2, H-7/C-6, H-7/C-7’ chứng tỏ nhóm C-7 nối với C-1 và với nhóm benzoyloxy.
Cấu hình tương đối của UGLE1 được xác định dựa vào việc phân tích hằng số tương tác J và các dữ kiện phổ NOESY. Tương tác H-2/H-3 có giá trị
J2,3 = 7,5 Hz cho phép suy ra mối quan hệ trans diaxial giữa H-2, H-3. Tương tác allylic giữa H-3, H-4 có J3,4 = 2,5 Hz tương tác allylic hoảng 4 Hz cho định hướng equatorial; 1,9-2,6 Hz cho định hướng axial [33], [37] ; tương tác W giữa H-3, H-5 có J3,5 = 2,5 Hz cũng góp phần khẳng định H-3 định hướng axial. Các tương tác NOESY H-7a/H-2, H-7b/H-2, H-2’/H-2, H-6’/H-2 chứng tỏ quan hệ cis-vicinal giữa C1-OH, C2-OH (hình 3.7.).
Các dữ kiện phổ NMR, MS của UGLE1 chứng tỏ hợp chất này có cấu trúc tương tự với hợp chất 3-O-debenzoylzeylenon tách ra từ loài Uvaria purpurea trước đây [63] (bảng 3.3.). Khác biệt giữa hai hợp chất này là ở dấu
của năng suất quay cực ([]D). Theo tài liệu [39], 3-O-debenzoylzeylenon có []D = +12,5 (c = 0,4 trong CHCl3 trong hi đó hợp chất UGLE1 có []D = - 12,0 (c = 0,4 trong CHCl3). Điều này chứng tỏ UGLE1 là một đối quang của 3-O-debenzoylzeylenon. Cấu trúc UGLE1 được xác định là ()-3-O- debenzoylzeylenon (hình 3.5.). Các số liệu phổ của UGLE1 và chất tham khảo được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất UGLE1 và chất tham khảo
UGLE1a 3-O-Debenzoylzeylenoneb [63] C H C H 1 77,2 76,3 2 75,7 3,99 (1H, d, 7,5 Hz) 74,0 3,97 (1H, d, 2,2 Hz) 3 70,2 4,62 (1H, ddd, 7,5, 2,5, 2,5 Hz) 68,0 4,70 (1H, m) 4 153,0 7,00 (1H, dd, 10,5, 2,5 Hz) 147,9 6,92 (1H, d, 10,2 Hz) 5 127,6 6,07 (1H, dd, 10,5, 2,5 Hz) 129,0 6,18 (1H, d, 10,2 Hz) 6 197,5 195,2 7 63,3 4,50 (1H, d, 10,5 Hz) (H-7a) 4,69 (1H, d, 10,5 Hz) (H-7b) 64,1 4,59 (1H, d, 11,8 Hz) 4,80 (1H, d, 11,8 Hz) 1’ 131,1 126,9 2’, 6’ 130,4 7,94 (2H, dd, 1,0, 8,5 Hz) 129,9 7,42-8,00 (5H, m) 3’, 5’ 129,5 7,46 (2H, ddd, 1,0, 8,5, 8,5 Hz) 128,5 4’ 134,3 7,60 (1H, tt, 1,0, 8,5 Hz) 133,6 7’ 167,2 166,9 a 1
H (500 MHz), 13C (125 MHz) đo trong CD3OD; b 1H (500 MHz), 13C (125 MHz) đo
trong CDCl3
()-3-O-debenzoylzeylenon (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.3.3. Hợp chất 3 (UGC5)
Hợp chất 3 ý hiệu UGC5) được tách ra dưới dạng bột màu trắng, tan tốt trong aceton, methanol, nhiệt độ nóng chảy 155-156 0
C, Rf = 0,40 (trên SKLM pha thường với hệ n-hexan : aceton (2:1)).
Phổ 1
H-NMR của UGC5 chỉ ra tín hiệu của 10 proton aromatic trong hoảng 7,51-8,08 bao gồm 2 doublet J = 8,0 Hz và 2 multiplet tương ứng với tín hiệu trong vùng 128,7-165,6 trong phổ 13
C-NMR. Điều này chứng tỏ sự tồn tại của 2 nhóm bezoyloxy trong phân tử.
Các phổ 1D-NMR cũng chỉ ra tín hiệu của 2 proton cis-olefinic ở 7,07 và 6,17 (J4,5 = 10,5 Hz); 1 nhóm methylenoxy ở 4,57 và 4,36; 2 proton của nhóm methinoxy (>CH-O- . Sự có mặt của 1 nhóm cacbonyl trong phân tử được thể hiện rõ qua tín hiệu ở C 195,1.
Phổ H,H-COSY chỉ ra các tương tác của H-2/H-3, H-3/H-4, H-4/H-5. Phổ HMBC cho thấy H-7 tương tác với C-1, C-2, C-6, C-7’ chứng tỏ có 1 nhóm benzoyloxy gắn vào vị trí C-7. Nhóm benzoyloxy còn lại định vị vào C- 3 do có tương tác giữa H-3/C-7’’ trên phổ HMBC. Các dữ kiện phổ của
UGC5 được trình bày ở bảng 3.4. và các tương tác chọn lọc HMBC; H,H- COSY của hợp chất này được thể hiện trên hình 3.6.
Bảng 3.4. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất UGC5 Vị trí δC (ppm) δH (ppm) 1 76.1 (s) 1-OH 6.33 (1H, s) 2 71.3 (d) 4.26 (1H, dd, 7.5 Hz) 2-OH 6.03 (1H, d, 6.5 Hz) 3 72.3 (d) 5.98 (1H, ddd, 2.0, 2.5, 8.5 Hz) 4 147.4 (d) 7.07 (1H, dd, 2.0, 10.5 Hz) 5 127.9 (d) 6.17 (1H, dd, 2.5, 10.5 Hz) 6 195.1 (s) 7 61.4 (t) 4.57 (1H, d, 10.0 Hz) (7a) 4.36 (1H, d, 10.0 Hz) (7b)
3,7-Dibenzoyl 1’ 129.4 (s) 1’’ 2’; 6’ 129.1 (d) 7.90 (2H, d, 8.0 Hz) 2’’; 6’’ 129.5 (d) 8.08 (2H, d, 8.0 Hz) 3’; 5’ 128.7 (d) 7.51-7.56 (4H, m) 3’’; 5’’ 4’ 133.4* (d) 7.64-7.70 (2H, m) 4’’ 133.5** (d) 7’ 165.0 (s) 7’’ 165.6 (s) 1
H (500 MHz), 13C (125 MHz) đo trong DMSO-d6, dùng TMS làm chất chuẩn nội.
Tín hiệu (*) và (**) có thể thay đổi chỗ cho nhau.
Hình 3.6. Tương tác HMBC ( ); H,H-COSY ( ) chọn lọc của hợp chất UGC5
Hóa lập thể tương đối của UGC5 được thiết lập thông qua việc phân tích hằng số tương tác và dữ kiện phổ NOESY. Tương tác H-2/H-3 có giá trị J
khoảng 8,5 Hz chứng tỏ H-2, H-3 phải ở vị trí trans-diaxial so với nhau. Tương tác H-3/H-4 tương tác allylic), H-3/H-5 tương tác W) có giá trị J lần lượt là 2,0 Hz và 2,5 Hz cũng cho phép hẳng định H-3 chiếm vị trí axial. Ngoài ra, H-2 có tương tác NOESY với H-7b nên H-2 và H-7 phải nằm về cùng một phía so với mặt phẳng vòng cyclohexenon. Tương tác NOESY của
2-OH/H-2, 1-OH/2-OH góp phần xác nhận lại cấu trúc này. Các tương tác H,H-NOESY chọn lọc của UGC5 được thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7. Tương tác H,H-NOESY ( ) chọn lọc của hợp chất UGC5
Dữ kiện phổ của UGC5 có sự phù hợp với Zeylenon đã được tách ra từ loài Uvaria grandiflora trước đó [37] (bảng 3.5.).
Bảng 3.5. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất UGC5 và Zeylenon [37], [64]
Vị trí
UGC5* ZEYLENON** [37] ZEYLENON*** [64] δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) 1 76.1 (s) 77.2 (s) 77.4 (s) 2 71.3 (d) 4.26 (1H, dd, 7.5 Hz) 71.7 (d) 4.36 (1H, ddd, 4.2, 2.7, 1.2 Hz) 79.3 (d) 4.35 (1H, d, 9.0 Hz) 3 72.3 (d) 5.98 (1H, ddd, 2.0, 2.5, 8.5 Hz) 69.4 (d) 5.94 (1H, td, 4.2, 1.0 Hz) 61.8 (d) 6.11 (1H, dd, 9.0, 2.4 Hz) 4 147.4 (d) 7.07 (1H, dd, 2.0, 10.5 Hz) 142.7 (d) 6.93 (1H, ddd, 10.0, 4.2, 1.2Hz) 146.4 (d) 6.92 (1H, dd, 10.5, 2.4 Hz) 5 127.9 (d) 6.17 (1H, dd, 2.5, 10.5 Hz) 128.6 (d) 6.30 (1H, dd, 10.0, 1.0Hz) 128.0 (d) 6.31 (1H, dd, 10.5, 2.4 Hz) 6 195.1 (s) 196.6 (s) 197.3 (s) 7 61.4 (t) 4.57 (1H, d, 10.0 Hz) (7a) 65.3 (t) 4.82 (1H, d, 11.6 Hz) (7a) 64.3 (t) 4.75 (1H, d, 11.4 Hz) (7a) 4.36 (1H, d, 10.0 Hz) (7b) 4.58 (1H, d, 11.6 Hz) (7b) 4.67 (1H, d, 11.4 Hz) (7b) (*) 1
H (500 MHz), 13C (125 MHz) đo trong DMSO-d6, dùng TMS làm chất chuẩn nội.
(**) (***) 1
Nghiên cứu tổng hợp toàn phần zeylenon từ acid shi imic đã chứng minh được rằng zeylenon từ nguồn tự nhiên có cấu hình tuyệt đối là (1S, 2S, 3R , còn được gọi là (-)-zeylenon [64].
Từ tất cả các phân tích nêu trên và sự phù hợp về số liệu phổ NMR của
UGC5 với các số liệu đã được công bố [37], cho phép khẳng định cấu trúc hóa học của UGC5 là Zeylenon hay còn gọi là Tonkinenin A. Cấu trúc hóa học của UGC5 được thể hiện ở hình 3.8.
Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất UGC5
3.2.3.4. Hợp chất 4 (UGC8)
Hợp chất 4 ý hiệu UGC8) được tách ra dưới dạng bột màu trắng, tan tốt trong aceton, Rf = 0,30 (trên SKLM pha đảo với hệ aceton/nước : 2/1 , Rf (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
= 0,40 (trên SKLM pha thường với hệ n-hexan/aceton : 5/2). Trên phổ 1
H-NMR của UGC8 có sự hiện diện của 3 cụm tín hiệu multiplet ứng với 10 proton thuộc vòng thơm trong hoảng 7,49 - 8,10; 2 cis proton olefinic ở 5,91 và 6,14 (J = 10 Hz); 2 proton của nhóm methylenoxy (-CH2O- ở 4,91 và 4,57 với Jgem = 12,0 Hz; 3 proton của các nhóm methinoxy (>CH-O- ở hoảng 3,66 - 5,63.
Phổ 13
C-NMR, DEPT 90, 135 cũng chỉ ra sự có mặt của 2 nhóm benzoyloxy với các nguyên tử C của vòng thơm ở 129,6 - 134,5 cùng với 2 nguyên tử C nằm trong nhóm cacboxyl ở 167,5 và 167,7. Tín hiệu của các
nguyên tử C gắn với O được thấy ở hoảng 55,1 - 75,8 gồm 1 nhóm -CH2O- ở 63,7 và 3 nhóm >CH-O- ở 55,1, 71,1, 75,8 và 1 nguyên tử C bậc IV ở