2.3.5.1. Đánh giá độc tính cấp dịch chiết toàn phần của dược liệu
36 chuột BALB/c khoẻ mạnh, khối lượng 20-22 gram, không phân biệt giống, nuôi tại hu nuôi động vật của Viện Công nghệ Sinh học, được chia làm 6 lô (6 chuột/lô), và bị bỏ đói hoàn toàn 16 h trước khi cho uống dịch chiết toàn phần cây Bù dẻ tía một lần duy nhất ở các ở nồng độ 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 và 10000 mg/kg thể trọng gP tương ứng với 6 lô thí nghiệm. Cao toàn phần Bù dẻ tía được pha trong dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9% với tỷ lệ 1g/1ml. Sau khi cho uống 1-2 giờ, chuột được nuôi dưỡng bình thường trở lại cho ăn, uống tự do) và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong từng lô và tính giá trị LD50 theo công thức của Abraham [18] và Turner [57].
2.3.5.2. Đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư invitro
Thử nghiệm được tiến hành trên 6 dòng tế bào ung thư mục 2.1. . Mẫu thử là dịch chiết các phân đoạn và các hợp chất tinh hiết phân lập từ dược liệu.
Phương pháp nuôi cấy tế bào invitro
Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).
Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.
Phép thử sinh học xác định mức độ độc tế bào: Phương pháp thử độ độc tế bào invitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chu n nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng ìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991) [20]. Việc xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamin B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó khi lượng tế bào càng nhiều lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
-Chất thử 10 l pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của hay 96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 20 g/ml. Giá trị IC50 của chất thử có hoạt tính được xác định bằng cách pha chất thử ở các nồng độ 20 g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml; 0,16 g/ml.
-Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
-Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào có nồng độ tế bào phù hợp với từng dòng (trong 180 l môi trường) cụ thể như sau: dòng LU-1 (3 x 104
tb/ml) , KB (3 x 104 tb/ml), MDA-BA-321 (2,5 x 104 tb/ml), Hep G2 (3 x 104 tb/ml), SW-480 (3x 104 tb/ml) và MKN7 (3,5 x 104 tb/ml và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.
-Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180 l) s được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ cho tế bào vào đĩa thí nghiệm, đĩa đối chứng ngày 0 s được cố định tế bào bằng TCA (trichloracetic acid) 20% trong 1h ở 4oC.
giếng bằng TCA 20% trong 30 phút ở 4oC, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37oC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% Acid acetic rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.
Cuối cùng, sử dụng 10 mM UTB unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng ức chế sự sống sót của tế bào khi có mặt chất thử s được xác định thông qua công thức sau:
% ức chế = 100% - % sống sót
Các phép thử được lặp lại 3 lần. Ellipticine Sigma được sử dụng làm chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml. DMSO 10% được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc phân đoạn hóa học) hoặc IC50 4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.
% sống sót =
[OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây Bù dẻ tía
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Bù dẻ tía Uvaria grandiflora bằng các phản ứng hóa học đặc trưng được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Bù dẻ tía
Nhóm chất Thuốc thử/Phƣơng pháp Hiện tƣợng Kết quả phản ứng Kết quả định tính Alcaloid
Bouchardat Tủa màu nâu ++
Có
Dragendorff Tủa màu vàng cam ++
Mayer Tủa màu vàng nhạt ++
Anthranoid Bortrager Màu đỏ sim ++ Có
Acid amin Ninhydrin 0,1% Xuất hiện màu tím + Có (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Acid hữu cơ Natri carbonat Sủi bọt khí + Có
Coumarin Mở - đóng vòng lacton
Hai ống nghiệm có tủa
đục sau khi acid hóa - Không
Diazo hóa Xuất hiện màu đỏ -
Flavonoid
Cyanidin Xuất hiện màu hồng hơi
tím ++
Có
Khí amoniac Chuyển màu vàng đậm
hơn ++
Sắt (III) clorua Xuất hiện màu xanh lục ++
Glycosid tim
Khung
steroid Liebermann
Ở mặt tiếp xúc giữ hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ
Vòng lacton
Baljet
Xuất hiện màu đỏ cam -
Legal -
Saponin
Quan sát hiện tượng tạo
bọt Cột bọt bền sau 15 phút - Không
Acid sulfuric đậm đặc Màu tím hồng +
Tanin Sắt (III) clorua 5%
Xuất hiện tủa màu xanh
đen - Không
Gelatin 1% Xuất hiện tủa bông trắng -
Chất béo Hơ nóng trên giấy lọc Vết mờ còn lại trên giấy
lọc ++ Có (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đƣờng khử Fehling Kết tủa màu đỏ gạch ++ Có
Steroid Liebermann
Ở mặt tiếp xúc giữ hai lớp chất lỏng s xuất hiện vòng màu tím đỏ +++ Có Ghi chú: +++ : Phản ứng dương tính rất rõ + : Phản ứng dương tính ++ : Phản ứng dương tính rõ - : Phản ứng âm tính
Nhận xét: Kết quả nghiên cứu định tính cho thấy trong Bù dẻ tía có alcaloid, anthranoid, acid amin, acid hữu cơ, flavonoid, chất béo, đường khử và steroid.
3.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học 3.2.1. Quá trình chiết xuất
Phần trên mặt đất cây Bù dẻ tía được rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy hô ở 50 C - 60 C, sau đó xay thành bột thô và tiến hành chiết xuất, phân lập các hợp chất. Lượng bột thô đem chiết xuất là 5,0 kg.
Chiết xuất cao toàn phần
Toàn bộ lượng bột thô Bù dẻ tía được cho vào bình chiết và làm m bằng methanol tuyệt đối, đậy kín, để yên cho thấm m và trương nở hoàn toàn. Sau
đó thêm methanol tuyệt đối ngập dược liệu và cách bề mặt dược liệu khoảng 3cm rồi ngâm ở nhiệt độ phòng.Tiến hành chiết 3 đợt, mỗi đợt chiết trong 1 tuần. Dịch chiết thu được đem cô quay hút chân hông ở 50oC thu được cắn dạng cao đặc.
Chiết các phân đoạn
Cắn toàn phần Bù dẻ tía được chiết phân đoạn với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần với các dung môi lần lượt là n-hexan, chloroform, ethyl acetat và n-butanol. Phân tán cắn toàn phần trong khoảng 3 lít nước cất, sau đó thêm 3 lít n-hexan, khuấy đều rồi chia hỗn hợp ra 3 bình gạn dung tích 2 lít. Tiến hành lắc các bình gạn để gạn lấy lớp n-hexan. Lớp nước còn lại được cho thêm 3 lít n-hexan rồi tiếp tục tiến hành lắc bình gạn để gạn lấy lớp n-hexan như trên thêm 2 lần nữa. Các dung môi hữu cơ còn lại được tiến hành chiết xuất phân đoạn một cách tương tự. Tiến hành cất thu hồi dung môi các phân đoạn dưới áp suất giảm, thu được các cắn tương ứng, ký hiệu lần lượt là H, C, E và B với khối lượng tương ứng lần lượt là 110g, 310g, 70g và 120g. Phần dịch nước còn lại cô cách thủy đến cạn trong tủ hốt, sau đó cắn được làm khô trong tủ sấy ở 50oC, thu được cắn phân đoạn nước, ký hiệu là N với khối lượng là 150g.
Căn cứ vào kết quả nghiên cứu hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào ung thư của các phân đoạn dịch chiết (H, C, E, B và N) từ cây Bù dẻ tía được trình bày ở mục 3.3.2.1. , phân đoạn chloroform đã thể hiện hoạt tính tốt nhất trong 5 phân đoạn thử nghiệm nên được ưu tiên lựa chọn để tiến hành phân lập các hợp chất tinh khiết.
Tiến hành chiết pha rắn phân đoạn chloroform (phân đoạn C)
Cắn phân đoạn C được hòa tan vào lượng methanol tối thiểu, sau đó t m với silicagel pha thường, tỷ lệ khối lượng 1:1. Khối silicagel m này được
quay cất thu hồi dung môi đến thể chất tơi mịn. Bột hô thu được dùng để chiết pha rắn trong bước tiếp theo.
Chu n bị cột: cột sắc ý được rửa sạch, tráng bằng methanol, để khô tự nhiên. Lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn trên giá. Cho silicagel pha thường lên cột sao cho bề dày lớp silicagel khoảng 1 cm, sau đó đưa lượng chất đã t m silicagel nói trên lên cột, gõ nhẹ để bột phân bố đều.
Triển khai cột với hệ dung môi rửa giải lần lượt là n-hexan 100%, n- hexan : aceton với các tỷ lệ 20:1, 10:1, 5:1, 1:1 và cuối cùng là aceton 100% (1,5 lít cho mỗi hệ). Hứng các phân đoạn, cô quay cất thu hồi dung môi thu được các cắn dạng cao đặc ký hiệu lần lượt từ C1 đến C6.
Sơ đồ quy trình chiết xuất các phân đoạn từ cây Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora được trình bày ở hình 3.1.
Phần nước còn lại Dịch chiết/MeOH Cô quay Lắc phân đoạn Dịch H2O Phân tán/H2O t0, áp suất giảm Ngâm ở nhiệt độ phòng/MeOH n-butanol
chloroform ethyl acetat
H C B N n-hexan E Chiết pha rắn C1 C2 C3 C4 C6 n-hexan 100% HA 20:1 HA 10:1 HA 5:1 aceton 100% Bột dược liệu Cắn C5 HA 1:1
3.2.2. Quá trình phân lập
Quá trình khảo sát bằng SKLM nhận thấy trên sắc ý đồ của phân đoạn C2 và C5 có các cụm vết tách nhau há rõ, hơn nữa, lượng cắn các phân đoạn này thu được khá nhiều. Do đó, hai phân đoạn này được ưu tiên phân lập trước.
Tiến hành phân lập phân đoạn C2
C2 được chiết pha rắn, rửa giải lần lượt bằng các dung môi n-hexan 100%, n-hexan : ethyl acetat với các tỷ lệ 20:1, 10:1, 5:1, 1:1 và ethyl acetat 100% (1 lít cho mỗi hệ), thu được 6 phân đoạn từ C2A đến C2F. Phân đoạn C2B được triển khai bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải methanol : nước (3:1) thu được 7 phân đoạn từ C2B1 đến C2B7. Sau khi khảo sát bằng SKLM, phân đoạn C2B6 được phân lập tiếp bằng sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat : aceton (20:1:0,5 , thu được 5 phân đoạn từ C2B6A đến C2B6E. Trong đó phân đoạn C2B6C trên sắc ý đồ chỉ còn lại 3 vết tách nhau, trong đó có một vết gần như tách hẳn các vết khác. Do đó C2B6C được ưu tiên đưa lên cột sắc ký lọc gel với pha động là methanol 80%, quá trình rửa giải thu được hợp chất 1 (ký hiệu UGC12, khối lượng 25mg). Kiểm tra bằng SKLM với 3 hệ dung môi khác nhau là aceton : nước 2:1 SKLM pha đảo), n-hexan : ethyl acetat : aceton (20:1:0,8), chloroform : methanol (25:1) SKLM pha thường) cho thấy đây là một chất sạch.
Tiến hành phân lập phân đoạn C5
C5 được triển khai trên sắc ký cột pha thường, rửa giải bằng hệ chloroform : methanol 40:1 , thu được 4 phân đoạn từ C5A đến C5D. Trên sắc ý đồ nhận thấy C5A có các cụm vết tách há rõ. Do đó C5A được sắc ký lặp lại bằng cột silicagel pha thường với hệ n-hexan: aceton 5:1 thu được 7 phân đoạn từ C5A1 đến C5A7. Trong đó, 3 phân đoạn C5A2, C5A5 và C5A7 khi kiểm tra bằng SKLM cho thấy khả năng tách chiết tốt nên được ưu tiên để tiến hành phân lập ở bước tiếp theo.
Phân đoạn C5A2 được cho lên cột sắc ý pha đảo, rửa giải bằng hệ aceton : nước : acid formic (3:1:0,1 , thu được 4 phân đoạn từ C5A2A đến
SKC pha đảo C2 Chiết pha rắn C2A C2B C2C C2D C2E C2F HE 20:1 n- hexan 100% ethyl acetat 100% HE 10:1 HE 5:1 HE 1:1 methanol : nước (3:1)
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp chất 1 (UGC12) từ phân đoạn C2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C2B1 1 C2B2 1 C2B3 1 C2B4 1 C2B5 1 C2B6 1 C2B7 1
n-hexan : ethyl acetat : aceton (20:1:0,5) SKC pha thường C2B6A Hợp chất 1 (UGC12) SKC Sephadex LH 20 methanol 80% C2B6B C2B6C C2B6D C2B6E
C5A2D. Phân đoạn C5A2B được phân lập bằng cột sắc ký lọc gel, rửa giải bằng methanol 80% thu được 3 phân đoạn từ C5A2B1 đến C5A2B3. Quan sát phân đoạn C5A2B2 thấy có các tinh thể hình kim xuất hiện. Tiến hành lọc lấy tinh thể, rửa tinh thể bằng methanol nhiều lần, sau đó bay hơi dung môi thu được một hợp chất kết tinh màu vàng nhạt là hợp chất 2 (ký hiệu UGLE1, khối lượng 270mg). Kiểm tra bằng SKLM với 3 hệ dung môi khác nhau là aceton : nước : acid formic (3,5:1:0,1) SKLM pha đảo), n-hexan : aceton (4:1), chloroform : methanol (12:1) SKLM pha thường) cho thấy đây là một chất sạch.
Tinh chế phân đoạn C5A5 bằng cột sắc ký lọc gel, rửa giải bằng dung môi methanol 100%, thu được hợp chất 3 (ký hiệu UGC5, khối lượng 167mg). Kiểm tra hợp chất 3 trên SKLM với các hệ dung môi methanol : nước (3:1), chloroform : methanol (6:1) và n-hexan : ethyl acetat : aceton (4:1,5:1) cho thấy đây là một hợp chất tinh khiết.
Phân đoạn C5A7 xuất hiện tinh thể trắng hi được cô đặc, tiến hành lọc, rửa tinh thể bằng methanol nhiều lần thu được hợp chất 4 (ký hiệu UGC8, khối lượng 12,5mg). Hợp chất 4 được xác nhận là một hợp chất sạch khi kiểm tra bằng SKLM với các hệ dung môi aceton : nước (2:1), n-hexan : aceton (5:2) và chloroform : methanol : acid formic (7:1:0,1).
Các bước tiến hành phân lập các hợp chất 2, 3 và 4 từ phân đoạn C5 được thể hiện ở hình 3.3.
3.2.3. Nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc
3.2.3.1. Hợp chất 1 (UGC12)
Hợp chất 1 (ký hiệu UGC12 được tách ra dưới dạng bột màu vàng, tan trong hỗn hợp chloroform và methanol, Rf = 0,30 trên SKLM pha thường với hệ n-hexan : ethyl acetat : aceton (20:1:0,8)), hiện vết màu vàng tươi với
methanol 100%
methanol 80% SKC Shephadex LH 20
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập hợp chất 2 (UGLE1), hợp chất 3 (UGC5) và hợp chất 4 (UGC8) từ phân đoạn C5
C5
SKC pha thường n-hexan: aceton (5:1) C5A1
SKC pha thường
C5A C5B C5C C5D
chloroform : methanol (40:1)
C5A2 C5A3 C5A4 C5A5 C5A6 C5A7
C5A2A
aceton : nước : acid formic (3:1:0,1) SKC pha đảo
C5A2B C5A2C C5A2D
SKC Shephadex LH 20
C5A2B1 C5A2B2 C5A2B3
Lọc rửa bằng methanol
Hợp chất 2
(UGLE1) Bay hơi dung môi
Lọc rửa bằng methanol
Hợp chất 3 (UGC5)
Hợp chất 4 (UGC8)
thuốc thử H2SO4 10%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phổ 1H-NMR (DMSO-d6) của UGC12 xác nhận sự có mặt của 1 nhóm imin H 10,76 (s); 1 nhóm hydroxy tại H 10,09 (br.s). Hệ spin AMX được quan sát thấy tại H 8,62 (1H, d, 8,5); 7,07 (1H, d, 8,5) và 7,36 (1H, t, 8,5). Ngoài ra, còn có 2 tín hiệu singlet của 2 proton thơm hác tại H 7,84; 7,42 và proton của 2 nhóm methoxy tại H 4,00; 4,04.
Các phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy phân tử có chứa 17 nguyên tử C