Theo kinh nghiệm dân gian ở Malaysia, lá U. grandiflora được nấu chín uống để điều trị đau thắt lưng, đau dạ dày, đầy hơi, làm dịu đau bụng và hỗ trợ trong phục hồi cho phụ nữ sau khi sinh [61].Ngoài ra người dân Malaysia còn thường dùng lá và thân U. grandiflora để điều trị một số bệnh như bong gân, đau lưng, bệnh thấp khớp, giải độc ngộ độc thực ph m, ong chích hoặc phòng chống ngộ độc rượu [53]. Ở Việt Nam, cây Bù dẻ tía được các thầy lang đồng bào dân tộc Pako Vân Kiều sử dụng để chữa các bệnh liên quan đến khối u cho thấy hiệu quả tốt [9].
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora Roxb. ex Hornem - Annonaceae). Mẫu thu tại huyện Đa rông tỉnh Quảng Trị vào tháng 9 năm 2011. Tên hoa học được xác định bởi TS. Nguyễn Thế Cường - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam. Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy hô ở 50ºC- 60 C, sau đó xay thành bột thô và bảo quản ở nơi hô thoáng.
Hình 2.1. Hoa của cây Bù dẻ tía Hình 2.2. Quả của cây Bù dẻ tía
- Các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm: LU-1 ung thư phổi người , KB ung thư biểu mô , MDA-BA-321 ung thư vú , Hep G2 ung thư gan người , SW-480 (ung thư ruột ết và MKN7 ung thư dạ dày . Các dòng tế bào do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.
2.2. Hoá chất và máy móc - thiết bị 2.2.1. Hoá chất
Dung môi được sử dụng: methanol, ethanol, n-butanol, ethyl acetat, chloroform, n-hexan, aceton, toluen, acid formic, amoniac, dichloromethan,
nước cất, acid acetic… Thuốc thử: dung dịch H2SO4 10% /Ethanol tuyệt đối, dung dịch NH3 đậm đặc, thuốc thử Magic, thuốc thử Dragendoff...
Chất nhồi cột sắc ký: silicagel pha thường (silicagel 60, 0,040 – 0,063mm (230-400 mesh ASTM , Merc và pha đảo (YMC, 30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.); Sephadex LH-20, Dianion HP-20. Bản sắc ký lớp mỏng pha thường (TLC-silicagel 60 F254, Merc và pha đảo (RP18, F254, Merck).
Các hoá chất và thuốc thử đạt tiêu chu n phân tích theo quy định của Dược Điển Việt Nam IV [5].
2.2.2. Máy móc - thiết bị
Các dụng cụ thủy tinh: cột sắc ký, cốc có mỏ nhiều thể tích, đũa thủy tinh, bình cầu hai cổ nhám, ống sinh hàn, bình tam giác, bình gạn, bình chạy sắc ký, pipette...
Cân phân tích hiện số Mettler Toledo AB204-S, độ chính xác 0,0001 g. Micropipette 100, 200, 500 µl (Human), micropipette 50 µl (Excel monopette 8000). Bếp điện, tủ sấy Memmert, máy cô quay Yamato, bình chiết, máy lọc hút chân không. Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500 FT-NMR, máy đo phổ khối phun mù điện tử AGILENT 6310 Ion Trap, máy đo phổ UV Jacob, máy đo mật độ quang OD Microplate Reader.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Định tính một số nhóm chất hữu cơ trong dƣợc liệu
Định tính các nhóm chất hữu cơ theo phương pháp phân tích các nhóm hợp chất thiên nhiên có trong cây bằng phản ứng hóa học đặc trưng và sắc ý lớp mỏng [2], [7 . Dự iến định tính các nhóm chất: alcaloid, anthranoid, acid hữu cơ, coumarin, flavonoid, tanin, saponin, glycosid tim, acid amin, chất béo, đường hử, steroid…
2.3.2. Phƣơng pháp chiết xuất
Phương pháp chiết xuất được sử dụng là phương pháp ngâm. Bột dược liệu được tiến hành ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi methanol. Thời gian chiết xuất: chiết 3 đợt, mỗi đợt chiết trong 1 tuần. Gộp dịch chiết, bốc hơi
dung môi dưới áp suất giảm để thu được cao toàn phần.
2.3.3. Phƣơng pháp phân lập
Quá trình phân lập sử dụng phương pháp sắc ký cột với các cơ chế cột hấp phụ, cột trao đổi ion và cột lọc qua gel. Sắc ký lớp mỏng được sử dụng để theo dõi quá trình rửa giải.
2.3.3.1.Sắc ký cột hấp phụ
Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất lỏng chảy qua pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh. Nhờ vậy mà có thể khai triển dung môi liên tục với nhiều hệ dung môi hác nhau có độ phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh [5], [7].
Chất nhồi cột là silicagel pha thường (silicagel 60, 0,040 - 0,063mm (230-400 mesh ASTM), Merc ; silicagel pha đảo YMC (silicagel 30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.).
2.3.3.2.Sắc ký lọc qua gel
Sử dụng chất nhồi cột là Sephadex LH-20.
Nguyên tắc: Sắc ký lọc qua gel là phương pháp phân tách các phân tử trong dung dịch dựa trên ích thước của chúng thông qua sự trao đổi lặp đi lặp lại các phân tử chất tan giữa dung môi pha động và cùng dung môi đó được pha tĩnh giữ trong các lỗ xốp của gel. Khoảng ích thước lỗ của gel xác định khoảng ích thước phân tử được phân tách qua quá trình sắc ký [5].
Phương pháp nhồi cột ướt được thực hiện đối với tất cả các loại sắc ký cột đã sử dụng [7].
2.3.4. Phƣơng pháp xác định cấu trúc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xác định cấu trúc của hợp chất tinh hiết được thực hiện thông qua phân tích dữ liệu phổ hối lượng MS , phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR . Kết quả biện luận được hẳng định sau hi giải phổ và so sánh với số liệu phổ trong các nghiên cứu đã được công bố trước đó.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo gồm có NMR một chiều 1
13
C-NMR, DEPT và hai chiều HMBC, HSQC, COSY, NOESY . Thực hiện trên máy Bruker Avance AM500 FT-NMR tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với chất chu n nội là tetramethyl silan (TMS). Phổ hối phun mù điện tử ESI-MS được đo trên máy AGILENT 6310 Ion Trap tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.5. Nghiên cứu hoạt tính sinh học
2.3.5.1. Đánh giá độc tính cấp dịch chiết toàn phần của dược liệu
36 chuột BALB/c khoẻ mạnh, khối lượng 20-22 gram, không phân biệt giống, nuôi tại hu nuôi động vật của Viện Công nghệ Sinh học, được chia làm 6 lô (6 chuột/lô), và bị bỏ đói hoàn toàn 16 h trước khi cho uống dịch chiết toàn phần cây Bù dẻ tía một lần duy nhất ở các ở nồng độ 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 và 10000 mg/kg thể trọng gP tương ứng với 6 lô thí nghiệm. Cao toàn phần Bù dẻ tía được pha trong dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9% với tỷ lệ 1g/1ml. Sau khi cho uống 1-2 giờ, chuột được nuôi dưỡng bình thường trở lại cho ăn, uống tự do) và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong từng lô và tính giá trị LD50 theo công thức của Abraham [18] và Turner [57].
2.3.5.2. Đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư invitro
Thử nghiệm được tiến hành trên 6 dòng tế bào ung thư mục 2.1. . Mẫu thử là dịch chiết các phân đoạn và các hợp chất tinh hiết phân lập từ dược liệu.
Phương pháp nuôi cấy tế bào invitro
Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).
Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.
Phép thử sinh học xác định mức độ độc tế bào: Phương pháp thử độ độc tế bào invitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chu n nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng ìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991) [20]. Việc xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamin B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó khi lượng tế bào càng nhiều lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
-Chất thử 10 l pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của hay 96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 20 g/ml. Giá trị IC50 của chất thử có hoạt tính được xác định bằng cách pha chất thử ở các nồng độ 20 g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml; 0,16 g/ml.
-Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
-Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào có nồng độ tế bào phù hợp với từng dòng (trong 180 l môi trường) cụ thể như sau: dòng LU-1 (3 x 104
tb/ml) , KB (3 x 104 tb/ml), MDA-BA-321 (2,5 x 104 tb/ml), Hep G2 (3 x 104 tb/ml), SW-480 (3x 104 tb/ml) và MKN7 (3,5 x 104 tb/ml và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.
-Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180 l) s được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ cho tế bào vào đĩa thí nghiệm, đĩa đối chứng ngày 0 s được cố định tế bào bằng TCA (trichloracetic acid) 20% trong 1h ở 4oC.
giếng bằng TCA 20% trong 30 phút ở 4oC, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37oC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% Acid acetic rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.
Cuối cùng, sử dụng 10 mM UTB unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng ức chế sự sống sót của tế bào khi có mặt chất thử s được xác định thông qua công thức sau:
% ức chế = 100% - % sống sót
Các phép thử được lặp lại 3 lần. Ellipticine Sigma được sử dụng làm chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml. DMSO 10% được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc phân đoạn hóa học) hoặc IC50 4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.
% sống sót =
[OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây Bù dẻ tía
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Bù dẻ tía Uvaria grandiflora bằng các phản ứng hóa học đặc trưng được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Bù dẻ tía
Nhóm chất Thuốc thử/Phƣơng pháp Hiện tƣợng Kết quả phản ứng Kết quả định tính Alcaloid (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bouchardat Tủa màu nâu ++
Có
Dragendorff Tủa màu vàng cam ++
Mayer Tủa màu vàng nhạt ++
Anthranoid Bortrager Màu đỏ sim ++ Có
Acid amin Ninhydrin 0,1% Xuất hiện màu tím + Có
Acid hữu cơ Natri carbonat Sủi bọt khí + Có
Coumarin Mở - đóng vòng lacton
Hai ống nghiệm có tủa
đục sau khi acid hóa - Không
Diazo hóa Xuất hiện màu đỏ -
Flavonoid
Cyanidin Xuất hiện màu hồng hơi
tím ++
Có
Khí amoniac Chuyển màu vàng đậm
hơn ++
Sắt (III) clorua Xuất hiện màu xanh lục ++
Glycosid tim
Khung
steroid Liebermann
Ở mặt tiếp xúc giữ hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ
Vòng lacton
Baljet
Xuất hiện màu đỏ cam -
Legal -
Saponin
Quan sát hiện tượng tạo
bọt Cột bọt bền sau 15 phút - Không
Acid sulfuric đậm đặc Màu tím hồng + (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tanin Sắt (III) clorua 5%
Xuất hiện tủa màu xanh
đen - Không
Gelatin 1% Xuất hiện tủa bông trắng -
Chất béo Hơ nóng trên giấy lọc Vết mờ còn lại trên giấy
lọc ++ Có
Đƣờng khử Fehling Kết tủa màu đỏ gạch ++ Có
Steroid Liebermann
Ở mặt tiếp xúc giữ hai lớp chất lỏng s xuất hiện vòng màu tím đỏ +++ Có Ghi chú: +++ : Phản ứng dương tính rất rõ + : Phản ứng dương tính ++ : Phản ứng dương tính rõ - : Phản ứng âm tính
Nhận xét: Kết quả nghiên cứu định tính cho thấy trong Bù dẻ tía có alcaloid, anthranoid, acid amin, acid hữu cơ, flavonoid, chất béo, đường khử và steroid.
3.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học 3.2.1. Quá trình chiết xuất
Phần trên mặt đất cây Bù dẻ tía được rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy hô ở 50 C - 60 C, sau đó xay thành bột thô và tiến hành chiết xuất, phân lập các hợp chất. Lượng bột thô đem chiết xuất là 5,0 kg.
Chiết xuất cao toàn phần
Toàn bộ lượng bột thô Bù dẻ tía được cho vào bình chiết và làm m bằng methanol tuyệt đối, đậy kín, để yên cho thấm m và trương nở hoàn toàn. Sau
đó thêm methanol tuyệt đối ngập dược liệu và cách bề mặt dược liệu khoảng 3cm rồi ngâm ở nhiệt độ phòng.Tiến hành chiết 3 đợt, mỗi đợt chiết trong 1 tuần. Dịch chiết thu được đem cô quay hút chân hông ở 50oC thu được cắn dạng cao đặc.
Chiết các phân đoạn
Cắn toàn phần Bù dẻ tía được chiết phân đoạn với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần với các dung môi lần lượt là n-hexan, chloroform, ethyl acetat và n-butanol. Phân tán cắn toàn phần trong khoảng 3 lít nước cất, sau đó thêm 3 lít n-hexan, khuấy đều rồi chia hỗn hợp ra 3 bình gạn dung tích 2 lít. Tiến hành lắc các bình gạn để gạn lấy lớp n-hexan. Lớp nước còn lại được cho thêm 3 lít n-hexan rồi tiếp tục tiến hành lắc bình gạn để gạn lấy lớp n-hexan như trên thêm 2 lần nữa. Các dung môi hữu cơ còn lại được tiến hành chiết xuất phân đoạn một cách tương tự. Tiến hành cất thu hồi dung môi các phân đoạn dưới áp suất giảm, thu được các cắn tương ứng, ký hiệu lần lượt là H, C, E và B với khối lượng tương ứng lần lượt là 110g, 310g, 70g và 120g. Phần dịch nước còn lại cô cách thủy đến cạn trong tủ hốt, sau đó cắn được làm khô trong tủ sấy ở 50oC, thu được cắn phân đoạn nước, ký hiệu là N với khối lượng là 150g.
Căn cứ vào kết quả nghiên cứu hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào ung thư của các phân đoạn dịch chiết (H, C, E, B và N) từ cây Bù dẻ tía được trình bày ở mục 3.3.2.1. , phân đoạn chloroform đã thể hiện hoạt tính tốt nhất trong 5 phân đoạn thử nghiệm nên được ưu tiên lựa chọn để tiến hành phân lập các hợp chất tinh khiết.
Tiến hành chiết pha rắn phân đoạn chloroform (phân đoạn C)
Cắn phân đoạn C được hòa tan vào lượng methanol tối thiểu, sau đó t m với silicagel pha thường, tỷ lệ khối lượng 1:1. Khối silicagel m này được
quay cất thu hồi dung môi đến thể chất tơi mịn. Bột hô thu được dùng để chiết pha rắn trong bước tiếp theo.
Chu n bị cột: cột sắc ý được rửa sạch, tráng bằng methanol, để khô tự nhiên. Lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn trên giá. Cho silicagel pha thường lên cột sao cho bề dày lớp silicagel khoảng 1 cm, sau đó đưa lượng