Nghiên cứu thành phần hóa học và khả năng cải thiện hội chứng tự kỷ trên thực nghiệm của phân đoạn n butanol từ cao chiết athanol cây rau đắng biển bacopa monnieri (l ) wettst

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI - - NGUYỄN THỊ MAI HƢƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG CẢI THIỆN HỘI CHỨNG TỰ KỶ TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA PHÂN ĐOẠN n-BUTANOL TỪ CAO CHIẾT ETHANOL CÂY RAU ĐẮNG BIỂN Bacopa monnieri (L.) Wettst KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI- 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI - - NGUYỄN THỊ MAI HƢƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG CẢI THIỆN HỘI CHỨNG TỰ KỶ TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA PHÂN ĐOẠN n- BUTANOL TỪ CAO CHIẾT ETHANOL CÂY RAU ĐẮNG BIỂN Bacopa monnieri (L.) Wettst KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: Ths Phạm Thái Hà Văn Ts Phạm Thị Nguyệt Hằng Nơi thực hiện: Bộ môn Dược cổ truyền – trường Đại học Dược Hà Nội Khoa Dược lý - Sinh hóa - Viện Dược Liệu HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu thực khóa luận, tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình từ tập thể cá nhân Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn tới Ths Phạm Thái Hà Văn- giảng viên môn Dược cổ truyền Ts Phạm Thị Nguyệt Hằng- phịng Dược lý- Sinh hóa Viện Dược liệu Những người thầy trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực khóa luận Tôi xin cảm ơn thầy cô trường Đại học Dược nói chung thầy mơn Dược cổ truyền nói riêng tận tình dạy dỗ, tao điều kiện cho bạn sinh viên suốt năm học vừa qua Tôi xin gửi lời cảm ơn tới anh chị phòng Dược lý- Sinh hóa Viện Dược liệu giúp đỡ tơi q trình thực khóa luận Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè người đồng hành, động viên, hết lịng giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Mai Hương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Hội chứng tự kỷ 1.1.1 Khái niệm hội chứng tự kỷ 1.1.2 Dịch tễ 1.1.3 Phân loại 1.1.4 Nguyên nhân 1.1.5 Triệu chứng bệnh 1.1.6 Thuốc điều trị hội chứng tự kỷ 1.2 Cây rau đắng biển 1.2.1 Thành phần hóa học 1.2.2 Tác dụng dược lý 12 2.1 Đối tượng phương tiện nghiên cứu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Nguyên vật liệu trang thiết bị nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 17 2.3.2 Nghiên cứu tác dụng dược lý 18 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 21 Chương THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 22 3.1.1 Định tính saponin phản ứng hóa học 22 3.1.2 Định tính sắc ký lớp mỏng 24 3.2 Nghiên cứu tác dụng dược lý 28 3.2.1 Đánh giá tác dụng khả vận động chuột máy đếm vận động tự nhiên hồng ngoại 28 3.2.2 Đánh giá tác dụng cải thiện tương tác xã hội tập hành vi cộng đồng 30 3.3.Bàn luận 33 3.3.1 Về thành phần hóa học 33 3.3.2 Về tác dụng dược lý 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 Kết luận 35 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO BM DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT cao khô phân đoạn n- butanol từ cao chiết ethanol rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst Cao rau đắng biển cao khô phân đoạn n- butanol từ cao chiết ethanol rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst CAT Catalase CDC Centers for Disease Control and Prevention DSM- IV Centers for disease control and prevention- 4th Edition FDA the U.S Food and Drug Administration GPX Glutathione peroxidase i.p Tiêm phúc mạc ICD International Classification of Diseases SKLM Sắc ký lớp mỏng SOD Superoxide dismutase SSRIs Thuốc ức chế chọn lọc thu hồi serotonin VPA Valproate DANH MỤC CÁC BẢNG STT Trang Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Kết định tính saponin phản ứng hóa học Kết định tính SKLM cao Rau đắng biển Kết đánh giá tương tác xã hội tập hành vi cộng đồng 23 27 31 DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ STT Trang Hình 1.1 Bacosid B Hình 1.2 Bacosid A 10 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế thử nghiệm 19 Hình 3.1 Kết phản ứng phân biệt saponin steroid 24 saponin triterpenoid Hình 3.2 Sắc ký đồ cao rau đắng biển 26 Hình 3.3 Kết đánh giá khả vận động chuột 29 máy đếm vận động tự nhiên hồng ngoại ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng tự kỷ loại khuyết tật rối loạn hệ thần kinh gây ảnh hưởng đến hoạt động não bộ, đặc trưng ba khiếm khuyết giao tiếp, tương tác xã hội hành vi, sở thích, hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp lặp lại Ngày nay, hội chứng tự kỷ phát triển với tốc độ đáng báo động, với tỷ lệ 1/ 88 trẻ em (CDC, 2012), tỷ lệ bé trai mắc bệnh cao gấp lần so với bé gái Tại Mỹ, số trẻ chẩn đoán mắc chứng tự kỷ cao so với tổng số trẻ bệnh ung thư, tiểu đường AIDS cộng lại [40] Hiện nay, y học đại chưa có thuốc đặc hiệu cho hội chứng tự kỷ mà điều trị tổn thương não kèm theo động kinh, tăng động, thiếu tập trung, hành vi bất thường dùng thêm số thuốc dưỡng não Các loại thuốc hay sử dụng cho điều trị hội chứng tự kỷ chủ yếu thuốc tân dược kiểm sốt triệu chứng có nhiều tác dụng khơng mong muốn Vì nhu cầu nghiên cứu phát triển loại thuốc có nguồn gốc từ dược liệu khơng có tác dụng phụ để hỗ trợ điều trị hội chứng tự kỷ cần thiết giới quan tâm Trên giới, từ lâu y học cổ truyền Ấn Độ dùng rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst) loại thuốc bổ thần kinh điều trị rối loạn thần kinh lo lắng, trầm cảm, động kinh, sa sút trí tuệ [15] Ngày nay, nhiều nghiên cứu đại thành phần hóa học dược lý chứng minh hiệu rau đắng biển hệ thần kinh chuột người Ở Việt Nam, có nghiên cứu tác dụng dược lý rau đắng biển [5][22] chưa nhiều, để khẳng định tác dụng hỗ trợ điều trị tự kỷ phát triển thành thuốc thực đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học khả cải thiện hội chứng tự kỷ thực nghiệm phân đoạn n – butanol từ cao chiết ethanol Rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst Với mục tiêu: - Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn n – butanol từ cao chiết ethanol Rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst - Nghiên cứu khả cải thiện hội chứng tự kỷ động vật thực nghiệm phân đoạn n – butanol từ cao chiết ethanol Rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst 29 Hình 3.3: Kết đánh giá khả vận động chuột máy đếm vận động tự nhiên hồng ngoại Nhận xét: Kết thể hình 3.3 cho thấy: lô chứng sinh lý, lôVPA (500 mg/kg) + BM liều 27 mg/kg 54 mg/kg có số lần vận động theo chiều dọc cao so với lô chứng bệnh lý Trong - Lơ chứng sinh lý có số lần vận động theo chiều dọc cao đáng kể (gấp khoảng 2,4 lần) so với lô chứng bệnh lý đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,01 30 - Lô VPA (500 mg/kg) + BM liều 27 mg/kg có số lần vận động theo chiều dọc cao so với lô chứng bệnh lý cao khơng có ý nghĩa thống kê ( p > 0,05) - Lô VPA (500 mg/kg) + BM liều 54 mg/kg có số lần vận động theo chiều dọc cao so với lô chứng sinh lý cao rõ rệt so với lô chứng bệnh lý ( gấp 2,8 lần) đạt ý nghĩa thống kê p < 0,001 Như vậy, cao khô phân đoạn n- butanol từ cao chiết ethanol rau đắng biển liều 54mg/kg có tác dụng cải thiện khả vận động tự nhiên chuột tự kỷ ( p < 0.001) mức liều 27 mg/kg khơng thể tác dụng, nói cách khác cao rau đắng biển có tác dụng cải thiện khả vận động tự nhiên chuột tự kỷ tác dụng phụ thuộc liều 3.2.2 Đánh giá tác dụng cải thiện tương tác xã hội tập hành vi cộng đồng Sau tiến hành thử nghiệm đánh giá khả tương tác xã hội chuột thí nghiệm tập hành vi cộng đồng, kết trình bày bảng 3.3: 31 Bảng 3.3: Kết đánh giá tương tác xã hội tập hành vi cộng đồng Thời gian (giây) Lô thí nghiêm ̣ P so cùng Không tiế p xúc Tiế p xúc với nhóm với ch ̣t cùng ch ̣t cùng giới giới P so với nhóm bênh lý ̣ Sinh lý 295,40 ± 21,95 195,20 ± 19,78 < 0,05 < 0,01 Bênh lý ̣ 159,90 ± 22,23 281,10 ± 43,85 < 0,05 - BM (27 mg/kg) 233,11 ± 36,67 221,44 ± 33,49 > 0,05 > 0,05 BM (54 mg/kg) 299,18 ± 19,25 176,73 ± 25,38 < 0,01 < 0,001 - Nhận xét: Kết thể bảng 3.3 cho thấy : lô chứng sinh lý, lô VPA (500 mg/kg) + BM liều 27 mg/kg 54 mg/kg kéo dài thời gian tiếp xúc với chuột giới rút ngắn thời gian không tiếp xúc với chuột giới so với lô chứng bệnh lý - Lô VPA (500 mg/kg) + BM liều 27 mg/kg: kéo dài thời gian tiếp xúc với chuột giới rút ngắn thời gian không tiếp xúc chuột giới so 32 với lô chứng bệnh lý thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê ( p > 0.05) - Lô VPA (500 mg/kg) + BM liều 54 mg/kg: kéo dài thời gian tiếp xúc với chuột giới rút ngắn thời gian không tiếp xúc chuột giới so với lô chứng bệnh lý đạt ý nghĩa thống kê p 0,05), thay đổi mức liều 54 mg/kg đạt ý nghĩa thống kê p< 0,001 Như vậy, thấy cao rau đắng biển thể tác dụng cải thiện khả tương tác xã hội mức liều 54 mg/kg với mức liều 27 mg/kg tác dụng khơng thể Cao rau đắng biển có tác dụng cải thiện khả tương tác xã hội tác dụng phụ thuộc 35 liều dùng Kết nghiên cứu dược lý đề tài thu phù hợp với số cơng trình nghiên cứu chứng minh tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ rau đắng biển giới[29] Trong nghiên cứu này, sử dụng mơ hình gây tự kỷ cho chuột Valproate (VPA) - Valproate (VPA) sử dụng phổ biến giới để gây mơ hình bệnh tự kỷ động vật[10][29] Mặt khác, dựa nhiều côn trình nghiên cứu chứng minh tác dụng dược lý rau đắng biển chủ yếu hợp chất saponin có lồi thực vật sử dụng phân đoạn n – butanol từ cao chiết ethanol Rau đắng biển nhằm làm giàu hợp chất saponin mẫu nghiên cứu để thử tác dụng sinh học Kết cao khô phân n – butanol từ cao chiết ethanol Rau đắng biển thể tác dụng liều dùng thấp nhiều so với sử dụng cao toàn phần ( liều 54 mg/ kg so với liều 300mg/kg) nghiên cứu Sandhya T cộng [29] Kết phù hợp với mục đích làm giàu hợp chất saponin mẫu nghiên cứu Như vậy, nghiên cứu góp phần chứng minh phân đoạn n – butanol từ cao chiết ethanol Rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst có tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ tác dụng phụ thuộc liều sử dụng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau thời gian nghiên cứu, đề tài thu kết luận sau: 36 Về hóa học - Đã xác định phân đoạn n-butanol từ cao chiết ethanol Rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst phản ứng hóa học sắc ký lớp mỏng có mặt hợp chất saponin triterpenoid sắc ký đồ phân đoạn hệ dung môi ethyl acetat- methanol- nước (7:2:1) có vết Về tác dụng dược lý - Phân đoạn n-butanol từ cao chiết ethanol Rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst có khả cải thiện hội chứng tự kỷ với liều 54mg/kg dựa thử nghiệm đánh giá khả vận động chuột máy đếm vận động tự nhiên hồng ngoại - Phân đoạn n-butanol từ cao chiết ethanol Rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst có khả cải thiện hội chứng tự kỷ với liều 54mg/kg dựa thử nghiệm tập hành vi cộng đồng Kiến nghị Để mở rộng ứng dụng nghiên cứu, xin đưa số đề xuất cho hướng nghiên cứu tiếp theo: - Nghiên cứu độc tính cấp bán trường diễn cao khô phân đoạn nbutanol từ cao chiết ethanol Rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst - Thử lâm sàng cao khô phân đoạn n-butanol từ cao chiết ethanol Rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst để phát triển thành sản phẩm hỗ trợ điều trị hội chứng tự kỷ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ môn Dược liệu- Trường Đại Học Dược Hà Nội ( 2004), Bài giảng Dược liệu Tập I, II Bộ môn Dược liệu- Trường Đại Học Dược Hà Nội ( 2006), Thực tập Dược liệu – Phần hóa học Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu ( 1980), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, NXB Y học Hà Nội Ngô Xuân Điệp (2009), Nghiên cứu nhận thức TTK Thành phố Hồ Chí Minh, Luận án tiến sĩ tâm lý học Nguyễn Thị Thu Hương (2006), Kỷ yếu cơng trình nghiên cứu khoa học cộng nghệ 2001 – 2005,tr.81- 84, NXB ĐHQGHN Hoàng Vũ Quỳnh Trâm, Phan Ngọc Thanh Trà (2008), "Đặc điểm lâm sàng rối loạn phổ tự kỷ đơn vị tâm lý, Bệnh viện Nhi đồng 1", Tài liệu hội thảo Bệnh tự kỷ trẻ em Bệnh viện nhi đồng tổ chức Atlantic Philantroppies, tr 70-73 Viện Dược liệu, thuốc động vật làm thuốc, ( Tập II), Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Thị Hoàng Yến (2012), Tự kỷ - vấn đề lý luận thực tiễn,Nxb Đại học Sư phạm TIẾNG ANH Angley M, Semple S, Hewton C, Paterson F, McKinnon R (2007), “ Children and autism – Part – Management with complementary medicines and dietary interventions”, Aust Fam Physician, 36,827–830 10 Bambini-Junior V , et al ,(2011), “Animal model of autism induced by 38 prenatal exposure to valproate: behavioral changes and liver parameters” , Brian res, 1408, 8-16 11 Bhattacharya SK and Ghoshal S (1998), “Anxiolytic activity of a standardized extract of Bacopa monniera- an experimental study”, Phytomedicine ,5, 77-82 12 Bose KC and Bose NK (1931), “Observations on the actions and uses of Herpestis monniera”, J Ind Med Assoc, 1, 60 13 Campbell M, Overall JE, Small AM, Sokol MS, Spencer EK, Adams P, Foltz RL et al, (1989), “ Naltrexone in autistic children: an acute open dose range tolerance trial” Journal Am Acad Child Adolesc Psychiatry, 28, 200 - 206 14 Chopra RN, Nayar L and Chopra IC (1956), “Glossary of Indian Medicinal Plants”, Council of Scientific and Industrial Research, vol 32, 421- 424 15 Chopra RN (1958), Indigenous Drugs of India, 2nd ed, Calcutta, India: U.N Dhur and Sons, 341 16 Elchaar GM, Maisch NM, Augusto LM, Wehring HJ (2006), “ Efficacy and safety of naltrexone use in pediatric patients with autistic disorder”, Ann Pharmacother, 40, 1086–1095 17 Findling RL (2005), “Pharmacologic treatment of behavioral symptoms in autism and pervasive developmental disorders”, Journal Clin Psychiatry, 66, 26– 31 18 Garai S, Mahato SB, Ohtani K, Yamasaki K (1996), “ Dammarane – type triterpenoid saponins from Bacopa monnieri”, Phytochemistry, 42, 815- 820 19 Garai S , Mahato S, Ohtani K, Yamasaki K (1996) , “ Bacopasaponin D-A pseudojujubogenin glycoside from Bacopa monniera”, Phytochemistry, 43, 447449 39 20 Handen BL, Johnson CR, Lubetsky M (2000), “ Efficacy of methylphenidate among children with autism and symptoms of attention-deficit hyperactivity disorder”, Journal Autism Dev Disord, 30, 245–255 21 Jain P and Kulshreshtha D K ( 1993), phytochemistry, 33,449 22 Le XT, Pham HT, Do PT, Fujiwara H, Tanaka K, Li F, Van Nguyen T, Nguyen KM, Matsumoto K (2013), “ Bacopa monnieri ameliorates memory deficits in olfactory bulbectomized mice: Possible involvement of glutamatergic and cholinergic systems”, Neurochem Res, 38, 2201-2215 23 Limpeanchob N, et al ( 2008), “Neuroprotective effect of Bacopa monnieri on beta-amyloid-induced cell death in primary cortical culture”, Journal of Ethnopharmacology, 112-117 24 Negi K S, et al (2000) “Clinical evaluation of memory enhancing properties of Memory Plus in children with attention deficit hyperactivity disorder”, Indian Journal of Psychiatry, vol.42 25 Paulose CS, Chathu F, Khan SR and Krishnakumar A (2008), “Neuroprotective role of Bacopa monnieri extract in epilepsy and effect of glucose supplementation during hypoxia: glutamate receptor gene expression” Neurochemistry Research, 33 (9), 1663-1671 26 Roodenrys S, Booth D, Bulzomi S, Phipps A, Micallef C, and Smoker J(2002), “Chronic effects of Brahmi (Bacopa monnieri) on human memory”, Neuropsychopharmacology, 27(2), 279-281 27 Russo A, Borrelli F ( 2005),“Bacopa monniera, a reputed nootropic plant: an overview”, Phytomedicine,12, 305-317 28 Rutter M, (2000), “Genetic studies of autism: From the 1970s into the millennium”, Journal of Abnormal Child Psychology, 28(1), 3–14 40 29 Sandhya T, Sowjanya J, Veeresh B(2012), “ Bacopa monniera (L.) Wettst ameliorates behavioral alterations and oxidative markers in sodium valproate induced autism in rats”, Neurochem Res,37, 1121-1131 30 Sastri MS, Dhalla NS and Malhotra CL (1959), “ Chemical investigation of Herpestis monniera Linn (Brahmi)”, Indian Journal Pharmacol,21, 303-304 31 Schultz R (2005), “Developmental deficits in social perception in autism: The role of amygdala and fusiform face area”, International Journal of Developmental Neuroscience,23(2–3), 125–141.3 32 Singh HK and Dhawan BN ( 1982), “Effects of Bacopa monniera Linn (Brahmi) extract on avoidance responses in rat”, Journal of Ethnopharmacology, 5(2), 205- 214 33 Singh RH, Singh L, (1980), “ Studies on the anti-anxiety effect of the Medyha Rasayana drug, Brahmi (Bacopa monniera Wettst.)” – Part 1, Journal Res Ayur Siddha, 1,133-148 34 Steenkamp V, Fernandes AC, and Van Rensburg CEJ (2007), “ Screening of Venda medicinal plants for antifungal activity against Candida albicans”, S Afr J Bot, 73 (2), 256-258 35 Stough C, et al (2011), “The chronic effects of an extract of Bacopa monniera on cognitive function in healthy human”, Psychopharmacology, 1-8 36 Venkata R V (2000), “Effect of Bacopa monniera Linn (brahmi) extract on learning and memory in rats: A behavioral study”, Journal of Veterinary Behavior, 5, 69- 74 37 Volkmar F, Cook EH, Pomeroy J, Realmuto G, Tanguay P (1999), “Practice parameters for the assessment and treatment of children, adolescents, and adults with autism and other pervasive developmental disorders: American Academy of 41 Child and Adolescent Psychiatry Working Group on Quality Issues”, Journal Am Acad Child Adolesc Psychiatry, 38, 32–54 38 Yun Zhou, et al, ( 2007) , “ Triterpene saponins from Bacopa monnieri and their antidepressant effects in two mice models” Journal Natural Product , 70, 652-655 39 Yun Zhou, et al, ( 2009), “ Effect of Triterpenoid Saponins from Bacopa monniera on Scopolamine-Induced Memory Impairment in Mice”, Planta Medica, 75, 568- 574 TÀI LIỆU INTERNET [40] www.cdc.gov 42 ... cao khô ph? ?n đo? ?n n- butanol từ cao chiết ethanol rau đắng bi? ?n Bacopa monnieri (L. ) Wettst Cao rau đắng bi? ?n cao khô ph? ?n đo? ?n n- butanol từ cao chiết ethanol rau đắng bi? ?n Bacopa monnieri (L. ). .. đắng bi? ?n Bacopa monnieri (L. ) Wettst Với mục tiêu: - Nghi? ?n cứu thành ph? ?n hóa học ph? ?n đo? ?n n – butanol từ cao chiết ethanol Rau đắng bi? ?n Bacopa monnieri (L. ) Wettst - Nghi? ?n cứu khả cải thi? ?n. .. Sinh hóa Vi? ?n Dược Việt Nam 2.2 N? ??i dung nghi? ?n cứu - Nghi? ?n cứu thành ph? ?n hóa học ph? ?n đo? ?n n- butanol từ cao chiết ethanol Rau đắng bi? ?n Bacopa monnieri (L. ) Wettst - Nghi? ?n cứu khả cải thiện