Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đường ruột của cây xuân hoa

Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đường ruột của cây xuân hoa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT CỦA

CÂY XUÂN HOA

(Pseuderanthemum palatiferum)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005

Sinh viên thực hiện: TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS PHAN PHƯỚC HIỀN TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN ThS MAI ĐÌNH TRỊ

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005

iii

LỜI CẢM ƠN

Thành kính khắc ghi công ơn cha mẹ sinh thành, đã nuôi dưỡng và giáo dục con nên người

Em xin gửi lòng biết ơn đến:

- Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

- Ban giám đốc Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Hóa Sinh - Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

- Ban chủ nhiệm, Thầy và Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học

đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài

Em xin trân trọng biết ơn: - TS Phan Phước Hiền - ThS Mai Đình Trị

đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt cho em những kinh nghiệm, kiến thức quí báu, tạo mọi điều kiện tốt cho em hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cám ơn đến:

- ThS Huỳnh Kim Diệu, Trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quí báu cho luận văn

- Cô Nguyễn Thị Huyên, phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường – Khoa Công Nghệ Môi Trường đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn này

- Ths Lê Tiến Dũng, Phân Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên đã giúp đỡ em trong suốt thời gian làm luận văn

Chân thành cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Trần Kim Hùng Nguyên

iv

TÓM TẮT

TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 3/2005 "KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA

(Pseuderanthemum palatiferum)"

Đề tài được tiến hành tại

- Phòng Hóa Lý - Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh ĐH Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh và Phòng Hóa Lý-Phân Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên

- Phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường - Khoa Công Nghệ Môi Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Giáo viên hướng dẫn: TS PHAN PHƯỚC HIỀN ThS MAI ĐÌNH TRỊ

Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) là

một cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam và đã được dùng trong dân gian từ những năm 80 Theo kinh nghiệm dân gian, cây được sử dụng chữa nhiều bệnh như: trĩ nội, chảy máu, suy nhược thần kinh và thông dụng nhất là dùng để chữa những rối loạn do nhiễm khuẩn đường tiêu hóa… Nhằm khẳng định một phần những công dụng dân gian trên một cách có khoa học và tìm kiếm những cây thuốc có thể thay thế kháng sinh trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, chúng tôi tiến hành khảo sát thành

phần hóa học và khả năng kháng họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) của cây Xuân Hoa với hai chủng vi sinh vật đại diện là E coli ATCC 25922 và Salmonella

typhimurium

Những kết quả đạt được:

- Tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật cho thấy trong lá cây Xuân Hoa chứa chủ yếu các chất hữu cơ: phytosterol, polyphenol, đường khử, hợp chất uronic và saponin…

- Lá Xuân Hoa được chiết tách bằng 4 loại dung môi: etthanol, chloroform, ete dầu hỏa và n-butanol Sau khi chiết tách tiến hành loại dung môi, thu được 4 loại cao tương ứng với bốn loại dung môi

- Sau khi thu được các loại cao, tiến hành thử nghiệm khả năng kháng hai

chủng vi sinh vật E coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium Kết quả

thu cho thấy chỉ có cao chloroform có khả năng kháng hai chủng vi sinh vật thử nghiệm với nồng độ ức chế tối thiểu lần lượt là

MICSalmonella = 340 μg/ml MICE coli = 330 μg/ml

- Cao ete dầu hỏa sau khi tiến hành chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng thu được hợp chất S là hỗn hợp của hai chất β-Sitosterol và Stigmasterol

Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) 3

2.2 Vi khuẩn đường ruột 9

2.2.1.Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột 9

2.3.2.2 Cơ chế gây bệnh thương hàn 17

2.3.2.3 Nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn 18

vii

2.4.1.4 Sức đề kháng 22

2.4.1.5 Cấu tạo kháng nguyên 22

2.4.1.6 Phân loại 23

2.4.2 Khả năng và cơ chế gây bệnh 23

2.4.3 Chuẩn đoán vi sinh vật 24

2.4.3.1 Chuẩn đoán trực tiếp 24

2.4.3.2 Chuẩn đoán gián tiếp 24

3.4 Phương pháp cô lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa 34

3.4.1 Điều chế các loại cao 34

3.4.1.1 Điều chế cao ete dầu hỏa 34

3.4.1.2 Điều chế cao CHCl3 34

3.4.1.3 Điều chế cao n-Butanol 34

3.4.1.4 Điều chế cao nước 34

3.4.2 Cô lập một số hợp chất trong cao ete dầu hỏa 36

3.4.3 Xác định cấu trúc của hợp chất đã cô lập được 36

viii

3.5 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn 36

3.5.1 Chuẩn bị môi trường 36

3.5.2 Pha loãng cao Xuân Hoa 36

3.5.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ đục 38

4.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 41

4.3 Cô lập một số hợp chất từ cây Xuân Hoa 43

4.3.1 Điều chế các loại cao 43

4.3.1.1.Điều chế cao ete dầu hỏa 43

4.3.1.2 Điều chế cao CHCl3 43

4.3.1.3 Điều chế cao n-butanol 43

4.3.1.4 Điều chế cao nước 43

4.3.2 Cô lập một số hợp chất từ cao ete dầu hỏa 44

4.3.3 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất S 47

Phụ lục 4: Phổ 13C của hợp chất S 55

Phụ lục 5: So sánh phổ 13C-NMR của S với β-sitosterol và stigmasterol 56

ix

CÁC TỪ VIẾT TẮT

NMR : Nuclear Magnetic Resonnance, cộng hưởng từ hạt nhân DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Tranfer IR : Infrared, hồng ngoại

MS : Mass Spectrometry, khối phổ J : Hằng số ghép cặp

s : Singlet, mũi đơn

d : Doublet, mũi đôi

t : Triplet, mũi ba

q : Quartet, mũi bốn m : Multiplet, mũi đa

SGOT : Glutamic oxalacetic transaminase SGPT : Glutamic pyruvic transaminase

LD50 : Lethal dose - 50, liều gây chết 50% số cá thể

ở liều 0,5 ml/kg thể trọng 7 Bảng 2.5: Hàm lượng men gan của nhóm chuột bị gây độc

ở liều 0,5ml/kg thể trọng 7 Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chửa trị bệnh tiêu chảy của bột Xuân Hoa

với hai loại kháng sinh Coli-norgen và Cotrimxazol 8 Bảng 4.1: Tóm tắt kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học

lá cây Xuân Hoa 43 Bảng 4.2: Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi 43 Bảng 4.3: Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa (3g) 45 Bảng 4.4: Kết quả thử nghiệm các loại cao trong khoảng nồng độ

100-600 μg/ml 49 Bảng 4.5: Kết quả thử nghiệm cao CHCl3 trong khoảng nồng độ

300-400 μg/ml 50 Bảng 4.6: Kết luận 50

Hình 3.2: Các ống nghiệm đã cấy huyền dịch vi khuẩn vào 40

Hình 4.1: Sắc ký bản mỏng cao ete dầu và hợp chất S 47

Hình 4.2: Cấu trúc hóa học của β-Sitosterol và Stigmasterol 48

Hình 4.3: Các ống nghiệm nồng độ trong khoảng 300 - 400 μg/ml trước khi đem ủ 49

Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm trên E coli 50

Hình 4.5: Kết quả thử nghiệm trên Salmonella 50

xii

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Phân loại họ vi khuẩn đường ruột 13

Sơ đồ 3.1: Qui trình tổng quát phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 33

Sơ đồ 3.2: Sơ đồ điều chế các loại cao thô từ lá Xuân Hoa 35

Sơ đồ 4.1: Tóm tắt quá trình sắc ký cột 3 g cao ete dầu hỏa 46

Biểu đồ 4.1: Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi 44

Phần I MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) là

một cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam và đã được dùng trong dân gian từ những năm 80 Theo kinh nghiệm dân gian, cây được sử dụng chữa nhiều bệnh như: trĩ nội, chảy máu, suy nhược thần kinh và thông dụng nhất là dùng để chữa những rối loạn do nhiễm khuẩn đường tiêu hóa… Ở Trung Quốc người ta sử dụng rễ của cây này để chữa vết thương

Nguyễn Thị Lan Oanh và công sự đã thử nghiệm dịch chiết lá Xuân Hoa cho thấy lá Xuân Hoa không độc với cá chọi Trần Công Khánh và cộng sự đã thử độc tính cấp diễn trên chuột cho thấy trên độc tính cấp, cao toàn phần lá Xuân Hoa không thể hiện độc tính, không có LD50

Hiện nay nhiễm khuẩn đường tiêu hóa diễn ra rất phổ biến Phương pháp chữa trị chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng sinh Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh dẫn đến nhiều rủi ro do hiện tượng kháng thuốc ở vi sinh vật gây ra Do đó tìm ra một nguồn vật liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn sẽ cho ta một phương pháp điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nói chung và nhiễm khuẩn đường tiêu hoá nói riêng an toàn và hiệu quả hơn

Xuất phát từ yêu cầu trên chúng tôi thực hiện đề tài: "Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đường ruột của cây Xuân

Hoa (Pseuderanthemum palatiferum)"

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục đích

- Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật các cấu tử hữu cơ có trong lá Xuân Hoa

- Chiết tách hợp chất hữu cơ từ lá Xuân Hoa bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký bản mỏng

- Khảo sát khả năng kháng hai chủng vi sinh vật E coli ATCC 25922 và

Salmonella typhimurium của lá cây Xuân Hoa

Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum)

Đây là một loài cây bụi, sống đa niên, thân non màu xanh lục, phần già hóa gỗ

màu nâu, phân nhiều cành mảnh

Lá mọc đối, có cuống, phiến lá hình lưỡi mác, hai đầu nhọn, dài 12-17 cm, rộng 3,5 - 5 cm, gốc lá hơi men xuống

Cụm hoa dài 10 - 16 cm, ở kẽ lá hoặc đàu cành, gồm các xim ngắn ở các mấu Hoa lưỡng tính, không đều, 5 lá đài rời tồn tại đến khi tràng hợp, màu trắng, ống tràng hẹp và dài khoảng 2,5 cm, có 5 thùy chia làm hai môi, môi trên gồm hai thùy nhỏ dính liền nhau đến nữa chiều dài của thuỳ, môi dướigồm 3 thùy to, thùy giữa của môi dưới có các chấm màu tím Hai nhị sinh sản với chỉ nghị ngắn đính trên họng tràng, bao phấn đính gốc, mầu tím, hai nhị lép Hai chỉ nhị bầu trên nhẵn dài khoảng 1,5 cm, hai lá noãn liền nhau tạo thành bầu hai ô; vòi nhị dài khoảng 2,5 – 2,7 cm, nửa dưới của vòi có lông, 2/3 của vòi trên có màu tím nhạt Quả nang, hai ô, mỗi ô chứa hai hạt Cây ra hoa từ tháng 4 – 5 Cây mọc hoang ra hoa gần như quanh năm

Cây được trồng nhiêu nơi như một cây thuốc gia đình

Hình 2.1: Cây Xuân Hoa

2.1.3.Thành phần hoá học[1],[9],[13],[17],[19]

Bằng các phản ứng định tính hoá học, đã sơ bộ xác định trong lá cây Xuân Hoa có

chứa: acid hữu cơ, carotenoid, coumarin, đường tự do, phytosterol, flavonoid, saponin

Ngoài ra lá Xuân Hoa còn chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu với hàm lượng tổng số khá cao (751 – 1365 mg%) Đặc biệt hàm lượng isoleucin và leucin rất cao (25 – 150 mg% và 46 – 85 mg%) Đó là các acid amin giữ vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp protein cơ bắp và chống mỏi mệt cơ thể Thiếu chúng cơ thể sụt cân nhanh Lá Xuân Hoa còn giàu valin (29 – 1001 mg%) Thiếu acid amin này, sự phối hợp các chuyển động của bắp thịt bị rối loạn và yếu đi Valin còn ảnh hưởng đến hoạt động của tuyến tụy, một tuyến tiêu hóa quan trọng

Các nguyên tố đa lượng và vi lượng trong lá cây Xuân Hoa khá cao so với các loại cây khác Không phát hiện các nguyên tố kim loại nặng như Cd, Pd, As, Cr Đáng chú ý là hàm lượng vanađi khá cao (3,75 mg/100 g lá tươi)

Bảng 2.1: Hàm lượng một số nguyên tố đa vi lượng trong lá Xuân Hoa

2.1.4.Tính chất dƣợc lý

2.1.4.1.Theo kinh nghiệm dân gian[8],[10]

Ở Trung Quốc người ta dùng rễ của cây Xuân Hoa để chữa vết thương, đau loét dạ dày, suy nhược thần kinh

Ở Việt Nam cây Xuân Hoa đã được dùng trong dân gian từ những năm 80 Theo tài liệu truyền tay thì cây Xuân Hoa có một số tác dụng sau:

- Khôi phục sức khoẻ cho người ốm yếu, suy nhược thần kinh, làm việc quá sức

- Chữa rối loạn tiêu hoá, tiêu chảy, lỵ, táo bón, đau bụng không rõ nguyên nhân - Chấn thương chảy máu, dập gãy cơ thể, chấn thương sọ não

- Chữa đau dạ dày, loét thành tá tràng, chảy máu đường ruột, viêm loét đại tràng, trĩ nội

- Viêm thận cấp và mãn, suy thận, đái ra máu, đái buốt, đái rắt

- Chữa các bệnh u ở phổi, u xơ tuyến tiền liệt, đau gan, xơ gan cổ trướng, làm giảm đau khi bị ung thư gan giai đoạn phát bệnh

- Điều chỉnh huyết áp cho người bị huyết áp cao hoặc thấp

Lá Xuân Hoa không có mùi, không vị, hơi nhớt Người ta thường dùng lá tươi rửa sạch, nhai với mấy hạt muối rồi uống với nước, giã nát lấy nước uống hoặc nấu ăn Liều lượng phụ thuộc vào từng bệnh, từng người; thông thường ăn từ 3 – 7 lá một ngày chia làm hai lần Thời gian điều trị tùy thuộc vào bệnh, như khi bị rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, lỵ chỉ ăn 7 – 14 lá là khỏi; đái rắt, đái buốt, đái ra máu thì ăn 14 – 20 lá; viêm đại tràng co thắt thì ăn kết hợp với lá mơ lông trong bữa ăn, từ 1 – 2 tháng

Ngoài ra, lá Xuân Hoa còn được dùng để chữa bệnh cho gia súc như chữa bệnh cho gà rù, chó cảnh sau khi đẻ cho ăn 1 – 2 lá, gà chọi sau khi chọi cho ăn 1 – 3 lá là hồi phục ngay

+ Kết quả:

Ở các liều: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg trọng lượng chuột, sau khi uống thuốc và suốt qua trình thí nghiệm chuột thuốc không thay đổi trạng thái hoạt động Chuột vẫn bò tới, bò lui, leo trèo, chùi râu, liếm đuôi, rữa mặt…

Các liều cao hơn: 5,56 g/kg; 9,19 g/kg và 11,5 g/kg thể trọng, chuột sau khi uống thuốc chuột có giảm hoạt động, nhưng sau 1 giờ trở lại bình thường, chuột nằm rúc vào nhau, mắt lim dim, thở nhẹ nhàng Qua đêm, rải rác chuột có đi phân nát Tất cả chuột ở các liều trên đều không chết Chuột sống hoàn toàn khỏe mạnh sau 24 giờ

Sau 24 giờ giết ngẫu nhiên 3 chuột ở các liều: 0,83 g/kg; 9,19 g/kg và 11,5 g/kg thể trọng chuột, quan sát đại thể cho thấy các phủ tạng hoàn toàn bình thường

Quan sát vi thể cho kết quả trình bày ở bảng II.2

Bảng 2.2: Kết quả xét nghiệm sinh thiết của chuột được cho uống cao Xuân Hoa

Cơ quan

0,83 g/kg

Cơ tim bình thường

Các tĩnh mạch xoang và tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ xung huyết

Quản cầu và các ống thận bình

thường

Niêm mạc dạ dày và các tuyến bình thường

Niêm mạc ruột và các tuyến bình thường

Không có tổn thương thực thể ở các tạng

9,19 g/kg

Cơ tim bình thường

Tế bào gan hơi to, nguyên sinh chất có thoái hoá nhẹ

Quản cầu xung huyết, các ống thận bình

thường

Niêm mạc dạ dày và các tuyến bình thường

Niêm mạc ruột và các tuyến bình thường

Có thoái hoá nhẹ ở gan

11,5 g/kg

Cơ tim bình thường

Tế bào gan hơi to, nguyên sinh chất có thoái hoá nhẹ, tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ xung huyết

Nang Bowmann rộng ra, tế bào thành ống teo nhỏ

Niêm mạc dạ dày và các tuyến bình thường

Niêm mạc ruột và các tuyến bình thường

Có tổn thương nhẹ ở gan và thận

+ Kết luận: Cao toàn phần lá Xuân Hoa không gây chết chuột ở tất cả các liều

Chuột sống hoàn toàn qua 48 giờ Như vậy trên độc tính cấp, cao toàn phần lá Xuân Hoa không thể hiện độc tính, không có LD50.

 Thử tác dụng bảo vệ tế bào gan

Tiến hành gây ngộ độc gan chuột nhắc bằng carbon tetrachloride (CCl4) với liều: 1 ml CCl4/kg thể trọng và 0,5 ml CCl4/kg thể trọng Sau đó tiến hành xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid thông qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyde (MDA), một sản phẩm tạo ra bởi quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào theo phương pháp của E.A.Makarova, 1989; J.Robak và cộng sự

Sản phẩm MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thu cực đại ở 530 – 532 nm Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ MDA

Hàm lượng MDA tính theo công thức: X = E x 30,8

Trong đó: X = hàm lượng MDA; E = độ hấp thu ở 532 nm;

30,8 = hệ số tắt phân tử

Kết quả: Kết quả đo MDA trong gan chuột được trình bày ở bảng II.3

Bảng 2.3: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 1 ml/kg thể trọng

2 Gây mô hình viêm gan, không

dùng thuốc Xuân Hoa 12 0,458 14,1156 3 Gây mô hình viêm gan, có dùng

Như vậy ở lô uống cao toàn phần Xuân Hoa hàm lượng MDA có giảm so với mô gây mô hình (giảm từ 14,1156 xuống còn 10,7091)

+ Hàm lượng men gan quá cao (AST, ALT), không đo được trên máy

+ Xét nghiệm vi thể: chưa thấy dấu hiệu bình phục của tế bào gan do tác dụng điều trị của thuốc

Bảng 2.4: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5 ml/kg thể trọng

2 Gây mô hình viêm gan, không dùng

3 Gây mô hình viêm gan, có dùng thuốc

Bảng 2.5: Hàm lượng men gan của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5 ml/kg thể trọng:

Hàm lượng men gan có giảm nhưng chưa đáng kể

Xét nghiệm vi thể: lô chuột được uống cao toàn phần lá Xuân Hoa và gây mô hình, nhận thấy vùng hoại tử xung quanh tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ vẫn tồn tại, các tế bào ở các vùng thoái hóa đã bắt đầu thu nhỏ và có xu hướng hồi phục

Kết luận: ở liều gây ngộ độc gan 1 ml CCl4/kg thể trọng, gan chuột bị hoại tử nặng, các giá trị AST, ALT tăng lên quá cao, không đọc được trên máy, nhưng hàm lượng MDA có giảm rõ rệt từ 14,1156 xuống còn 10,7091 và chưa thấy có dấu hiệu bình phục của tế bào gan Với liều gây độc 0,5 ml/kg thể trọng, hàm lượng MDA cũng giảm rất rõ rệt, từ 11,574 xuống còn 6,2463, hàm lượng men gan cũng giảm nhưng không đáng kể, có dấu hiệu bình phục của gan

Như vậy có thể sơ bộ kết luận: cao đặc toàn phần lá cây Xuân Hoa có tác dung ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, nghĩa là có xu hướng bảo vệ tế bào gan trên thực nghiệm

Năm 2004, Huỳnh Kim Diệu và Trần Văn Hòa đã tiến hành thử nghiệm khả năng trị bệnh tiêu chảy trên heo con và heo mẹ, so sánh với hai loại kháng sinh đang được sử dụng trị bệnh tiêu chảy heo con rất hiệu quả: Coli-norgen và Cotrimxazol Sau 3 ngày điều trị tỉ lệ khỏi bệnh của heo lần lượt: Bột Xuân Hoa 92,86 %; Coli- norgen 90,48 %; Cotrimxazol 83,33 % Tỉ lệ tái phát theo thứ tự là: 7,14 %; 9,52 %; 14,29 %

Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chửa trị bệnh tiêu chảy của bột Xuân Hoa với 2 loại kháng

sinh Coli-nogen và Cotrimxazol

Loại thuốc Số heo thử nghiệm

Số luợng heo khỏi bệnh sau khi điều trị Ngày thứ nhất Ngày thứ hai Ngày thứ ba

Kết quả phân lập vi khuẩn từ phân heo bệnh sau khi điều trị cho thấy tác nhân

gây bệnh là E coli, không tìm thấy tác nhân gây bệnh khác như: Salmonella, Proteus và Pseudomonas

Ngoài ra Huỳnh Kim Diệu và cộng sự còn tiến hành thử nghiệm độc tính của cây Xuân Hoa trên chuột cho thấy:

Không xác định được LD50: kết luận lá Xuân Hoa không có độc tính cấp diễn Thử độc tính bán trường diễn: Sau 60 ngày tác động thuốc các chỉ tiêu sinh lý máu: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu bình thường Và các chỉ số sinh hoá của gan và thận: SGOT, SGPT, Bilirubin toàn phần, Creatinin không khác biệt so với lô đối chứng Tiến hành giải phẩu bệnh lý chức năng gan và thận: khảo sát vi thể nhận thấy mô gan và thận bình thường, không có hiện tượng hủy hoại tế bào gan và thận Như vậy lá Xuân Hoa không gây độc tính bán cấp

2.2 Vi khuẩn đường ruột[3],[12]

2.2.1.Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột 2.2.1.1 Định nghĩa

Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn Gram âm,

hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi; không có men oxidase; len men đường glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không; khử nitrat thành nitrit; có thể di động hoặc không, nhưng nếu di động thì có nhiều lông ở xung quanh thân; không sinh nha bào

2.2.1.2 Hình thể

Tất cả các vi khuẩn thuộc họ này đều là trực khuẩn Gram (-) Kích thước trung bình 2 - 4 μm x 0,4 - 0,6 μm Một số loài hình thể không ổn định,có thể xuất hiện dạng sợi Những vi khuẩn di động thì có nhiều lông phân bố ở khắp xung quanh tế bào Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không bao giờ sinh nha bào Một số có vỏ, có thể quan sát được bằng kính hiển vi thông thường

2.2.1.3.Tính chất nuôi cấy

Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có thể mọc được trên môi trường nuôi cấy thông thường Trong môi trường lỏng, có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trường; có thể phát triển thành váng trên bề mặt; nhưng cũng có thể vừa làm đục môi trường vừa có cặn ở dưới đáy ống

Trên môi trường đặc có 3 dạng khuẩn lạc:

- Sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đường

- Có hay không có một số enzym Hai enzym thường được xác định nhất là urease và tryptophanase

- Khả năng sinh ra sunfua hydro (H2S) khi dị hoá protein, acid amin hoặc các dẫn chất có lưu huỳnh

- Phát triển được hay không phát triển được trên một số môi trường tổng hợp, ví dụ khả năng sử dụng citrat là nguồn cung cấp cacbon duy nhất có trong môi trường Simmons

Dựa vào tính chất chung của họ vi khuẩn đường ruột, ta có thể loại trừ hoặc xếp một vi khuẩn nào đó vào họ này Ngoài các tính chất đó, nhiều tính chất sinh vật hóa

học khác cũng được dùng để phân loại Enterobateriaceae

2.2.1.5 Sức đề kháng

Vì không có khả năng sinh nha bào nên các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không có sức đề kháng cao với những điều kiện hoá lý đặc biệt của môi trường Chúng dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sôi 1000C và bởi các hóa chất sát khuẩn thông thường Tuy nhiên nhiều loài vi khuẩn đường ruột có khả năng sống nhiều ngày đến nhiều tuần, thậm chí một vài tháng ngoài môi trường Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh lan truyền

2.2.1.6 Độc tố

Hầu hết các vi khuẩn đường ruột đều có nội độc tố Bản chất hóa học của nội độc tố là lipopolysaccharid (LPS) của vách tế bào Nội độc tố chỉ được giải phóng khi tế bào bị li giải

Nội độc tố có khối lượng phân tử từ 100.000 đến 500.000 dalton Nội độc tố tuy tính độc không cao bằng ngoại độc tố nhưng cũng rất độc (chỉ cần 0,05 mg nội độc tố đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ) Nội độc tố có thể gây ra tình trạng sốc, nếu không được điều trị tích cực kịp thời, dể chuyển thành sốc không hồi phục dẫn đến tử vong Nội độc tố không bị mất tính độc ở 1000C trong 30 phút Nội độc tố là chất có khả năng gây sốt

Một số thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh ngọai độc tố như

S.shiga, E.coli loại ETEC (enterotoxigenic E.coli) Ngoại độc tố của S.shiga làm cho

bệnh lỵ nặng hơn rất nhiều; ngoại độc tố LT (Labile Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn này

Kháng nguyên O không bị phá hủy ở 1000C trong hai giờ hoặc trong cồn 50% nhưng bị mất tính kháng nguyên khi xử lý bằng formol 0,5%

Ở những vi khuẩn không có vỏ hoặc màng bọc (không có kháng nguyên K) thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngoài cùng Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tương ứng sẻ xãy ra phản ứng ngưng kết, gọi là “hiện tượng ngưng kết O” với các hạt ngưng kết nhỏ, lắc khó tan

Ở những vi khuẩn có kháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết O có thể bị che lấp bởi kháng nguyên này Kháng nguyên O có tính đặc hiệu cao, nó thường được dùng để

phân loại vi khuẩn Dựa vào kháng nguyên O người ta có thể chia một loài vi khuẩn thành nhiều typ huyết thanh

Kháng nguyên O và kháng nguyên H có thể được sản xuất riêng để phát hiện riêng biệt các kháng thể tương ứng Để có kháng nguyên O, người ta cho vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng nguyên H sẽ bị phá huỷ, kháng nguyên O vẫn tồn tại Để có kháng nguyên H người ta cho vi khuẩn vào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá hủy, kháng nguyên H vẫn còn nguyên vẹn

- Kháng nguyên K:

Kháng nguyên K là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt kháng nguyên K nằm bên ngoài kháng nguyên thân

Nó có thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được bằng kính hiển vi quang học

thông thường (như ở Klebsiella) hoặc dưới dạng một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử (như ở S.typhy)

Kháng nguyên K, nếu che phủ hoàn toàn kháng nguyên O sẽ ngăn cách không cho kháng thể O gắn với kháng nguyên O làm cho phản ứng ngưng kết không xảy ra Trong trường hợp này cần phải phá hủy kháng nguyên K hoặc vi khuẩn phải được nuôi cấy trong điều kiện không sinh ra được khang nguyên này

2.2.1.8 Phân loại

Vấn đề phân loại của Enterobacteriaceae đã từng được tranh luận rất nhiều

ngoài cách phân loại của Bergey có ba cách phân loại khác:

Cách phân loại của tiểu ban về Enterobacteriaceae thuộc Hội Vi sinh học quốc

tế, năm 1958, chia họ này thành 12 giống

Cách phân loại của Kauffmann, năm 1966, chia Enterobateriaceae thành 3 tộc và

12 giống

Cách phân loại của Ewing, năm 1986, chia Enterobacteriaceae thành 8 tộc và 14

giống.Nhiều tác giả cho rằng cách phân loại của Ewing là hợp lý hơn vì nó giúp ích nhiều trong chuẩn đoán vi sinh vật và trong nghiên cứu dịch tể học Dưới đây là sơ đồ

phân loại họ Enterobacteriaceae của Ewing

Sơ đồ 2.1: Phân loại họ vi khuẩn đường ruột Tộc I: Escherichieae

Giống I: Escherichia Giống II: Shigella

2.2.1.9 Khả năng gây bệnh

Nói về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, trước hết phải đề cập đến các nhiễm khuẩn đường tiêu hóa Họ vi khuẩn đường ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy Cơ chế gây bệnh, vị trí gây tổn thương ở bộ máy tiêu hóa rất khác nhau tùy theo từng giống, từng loài

Ngoài đường tiêu hóa, các vi khuẩn đường ruột còn có khả năng gây bệnh ở nhiểu cơ quan khác như tiết niệu, thần kinh, hô hấp… Các thành viên của họ này đứng đầu trong các vi khuẩn gây viêm đường tiết niệu, bỏ xa các vi khuẩn khác Chúng cũng đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết Có thể nói khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào cũng có thể gặp thành viên của họ vi khuẩn đường ruột

Bệnh lý ở các mô, các cơ quan khác nhau có thể là hậu quả của bệnh lý đường tiêu hoá, có thể song hành với bệnh lý ở đường tiêu hóa, nhưng cũng có thể chỉ biểu

hiện bệnh lý ở một cơ quan nào đó trong khi đường tiêu hóa vẫn hoàn toàn bình thường

2.3 Salmonella[3],[12],[27]

Mặc dù hiện nay người ta đã biết đến mấy chục loài đến hàng nghìn typ huyết

thanh khác nhau thuộc giống Salmonella, S.typhi vẫn là loài được quan tâm nhiều nhất

không những bởi vai trò gây bệnh của nó mà vì nó gắn liền với những mốc lịch sử

quan trọng trong quá trình nghiên cứu về Salmonella nói chung và bệnh thương hàn

S.typhi vào năm 1884

Năm 1896, Widal chứng minh rằng huyết thanh của bệnh nhân thương hàn có

khả năng ngưng kết S.typi Đây là cơ sở cho phương pháp chuẩn đoán huyết thanh học

Năm 1917, Felix đã mô tả kháng nguyên thân và kháng nguyên lông của

Salmonella, đặt cơ sở cho phương pháp phân tích kháng nguyên của vi khuẩn

Năm 1935, Reilly đã nghiên cứu về cơ chế gây bệnh của bệnh thương hàn Ông chứng minh rằng hệ thần kinh thực vật có vai trò trong việc gây ra những tổn thương ở ruột

2.3.1 Đặc điểm sinh học 2.3.1.1 Hình thái

Salmonella là trực khuẩn Gram (-), kích thước trung bình 3,0 x 0,5 μm Có nhiều

lông xung quanh thân (trừ S.gallinarum và S.pullorum), rất di động, không có vỏ,

không sinh bào tử

Hình 2.2: Salmonella typhimurium

2.3.1.2 Tính chất nuôi cấy

Có khả năng phát triển trong điều kiện nuôi cấy hiếu khí hay kỵ khí tùy ý Rất dễ nuôi cấy, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 370C nhưng có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ 60

C – 420C, pH thích hợp là 7,6, phát triển được ở pH từ 6 – 9

Trên môi trường lỏng: Sau 5 – 6 giờ nuôi cấy, vi khuẩn làm đục nhẹ môi trường, sau 18 giờ môi trường đục đều

Trên môi trường thạch thường: Khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, thường không màu hoăc màu trắng sáng

Trên môi trường phân lập SS: khuẩn lạc có màu hồng; trên môi trường Istrati khuẩn lạc có màu xanh

2.3.1.3 Tính chất sinh vật hoá học

Không lên men lactose (loài S.arizona lên men lactose chậm) Lên men đường glucose thường sinh hơi (trừ S typhi)

Sử dụng được citrat ở môi trường Simmons (trừ S typhi và S paratyphiA)

Catalase (+), oxidase (-), urease (-)

Lysin decarboboxylase (+) (trừ S paratyphi A)

Bị chết ở nhiệt độ 500C trong vòng 1 giờ hoặc 1000C trong vòng 5 phút

Với các thuốc sát khuẩn thông thường, trực khuẩn Salmonella dễ bị tiêu diệt

2.3.1.5 Độc tố

- Nội độc tố: Nội độc tố của Salmonella rất mạnh, tiêm cho chuột nhắt hoăc

chuột lang liều thích hợp thì sau vài ngày chuột chết, mổ chuột thấy ruột non xung huyết, mảng Peyer bị phù nề, đôi khi hoại tử Nội độc tố có vai trò quyết định trong

tính chất gây bệnh của Salmonella

- Ngoại độc tố: Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện nuôi cấy invivo và

nuôi cấy kỵ khí Ngoại độc tố có thể điều chế thành giải độc tố

2.3.1.6 Cấu tạo kháng nguyên

Kháng nguyên O:

Hiện nay đã tìm thấy gần 70 yếu tố kháng nguyên O khác nhau Dựa trên kháng

nguyên O người ta chia Salmonella thành các nhóm A.B,C,D… Mỗi nhóm mang một

yếu tố kháng nguyên đặc hiệu nhóm Mỗi loài mang một yếu tố khác nhau, những yếu tố đó cấu tạo thành công thức O của từng loài

Kháng nguyên H:

Hầu hết Salmonella đều có kháng nguyên H trừ S gallinarum và S pullorum Kháng nguyên H của Salmonella có thể có tính đặc hiệu đơn hoặc kép Những loài

Salmonella có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu đơn khi gặp kháng huyết thanh

tương ứng sẽ mất khả năng di động Những loài có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép khi nuôi cấy chúng trong môi trường có kháng huyết thanh tương ứng với kháng nguyên H thì chúng vẫn di động và biểu hiện tính đặc hiệu của kháng nguyên H

kia Dựa vào kháng nguyên H người ta chia Salmonella thành các serotyp (typ huyết

thanh) Kháng nguyên H lai được chia thành hai phase: phase 1 đặc hiệu và phase 2

không đặc hiệu Thường các chủng Salmonella đều có cả hai phase này (trừ S typhi và

S paratyphi)

Kháng nguyên K:

Kháng nguyên K chỉ có ở S typhy và S paratyphi C và còn được gọi là kháng

nguyên Vi (Virulence) Kháng nguyên Vi dưới dạng một lớp rất mỏng không quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường Tuy nhiên kháng nguyên Vi có thể bao phủ kín kháng nguyên O, trong trường hợp này vi khuẩn sẽ không ngưng kết mặc

dù trộn với kháng huyết thanh O đặc hiệu Muốn cho hiện tượng ngưng kết O xuất hiện, cần phải làm nóng huyền dịch vi khuẩn (1000C trong 20 phút) để tách kháng nguyên K ra khỏi tế bào Kháng nguyên Vi không tham gia trong việc gây bệnh

2.3.1.7 Phân loại

Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, Salmonella được chia thành các nhóm, các loài

và các typ huyết thanh

Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng mà chúng gây ra như S typhy và các S paratyphi A,B,C (typhoid = bệnh thương hàn), hoặc theo vật chủ như S typhimurium gây bệnh ở chuột (murine = chuột) Về sau, người ta thấy rằng, một loài Salmonella có thể gây ra một số hội chứng và có thể phân lập ở nhiều

loài động vật khác nhau

Vì những lý do đó, cuối cùng người ta gọi các loài mới phát hiện đuợc theo tên

địa phương ở đó nó được phân lập như S teheran, S congo, S london

Đến nay người ta đã phát hiện được trên 1500 typ huyết thanh Salmonella

2.3.2 Khả năng và cơ chế gây bệnh 2.3.2.1 Khả năng gây bệnh

Tùy theo từng loài, Salmonella có thể chỉ gây bệnh cho người, chỉ gây bệnh cho

động vật, nhưng cũng có thể vừa gây bệnh cho người vừa gây bệnh cho động vật

Những loài Salmonella có khả năng gây bệnh cho người được quan tâm nhiều

hơn cả là:

S typhi: Loài này chỉ gây bệnh cho người, nó là vi khuẩn quan trong nhất trong

các căn nguyên gây bệnh thương hàn

S paratyphi A: Cũng chỉ gây bệnh cho người Là căn nguyên gây bệnh thương

hàn, ở nước ta, tỷ lệ phân lập được chỉ đứng sau S typhi

S paratyphi B: Chủ yếu gây bệnh ở người, nhưng có thể gây bệnh cho động vật

Tại các nước châu Âu, tỷ lệ phân lập được vi khuẩn này cao hơn ở nước ta

S paratyphi C: Vừa có khả năng gây bệnh thương hàn vừa có khả năng gây viêm

dạ dày, ruột và nhiễm khuẩn huyết Thường gặp ở các nước Đông Nam Á

S typhimurium và S enteritidis: vừa có khả năng gây bệnh cho người vừa có khả

năng gây bệnh cho động vật Có thể gặp ở nhiều nước khác nhau trên thế giới Chúng

là nguyên nhân chủ yếu của nhiểm độc thức ăn do Salmonella

S choleraesuis: là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm khuẩn huyết do Salmonella ở nước ta

2.3.2.2 Cơ chế gây bệnh thương hàn

Bệnh thương hàn do S typhi và S paratyphi A, B, C gây ra

Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo đường tiêu hóa do thức ăn, nước uống bị nhiễm bẩn Số lượng vi khuẩn đủ để gây bệnh khoảng 105

– 107 Sau khi vào ống tiêu hoá, vi khuẩn thương hàn bám vào niêm mạc ruột non rồi xâm nhập qua niêm mạc ruột rồi vào các hạch mạc treo ruột Ở đây vi khuẩn nhân lên rồi qua hệ thống bạch huyết và ống ngực đi vào máu, lúc này các dấu hiệu lâm sàn bắt đầu xuất hiện Từ máu, vi khuẩn đến lách và các cơ quan khác Tới gan theo mật đổ xuống ruột rồi được đào thải qua phân Một số vi khuẩn đi đến thận và được đào thải qua nước tiểu Tới mảng payer, vi khuẩn tiếp tục nhân lên

Vi khuẩn thương hàn gây bện bằng nội độc tố Nội độc tố kích thích thần kinh giao cảm ở ruột gây ra hoại tử chảy máu và có thể gây ra thủng ruột, vị trí tồn thương thường ở các mảng payer Đây là biến chứng thường găp do bệnh nhân ăn sớm khi chưa bình phục, nhất là các thức ăn cứng

Nội độc tố theo máu đi lên kích thích trung tâm thần kinh thực vật ở não thất ba Giai đoạn toàn thân nhiệt tăng cao, sốt Thân nhiệt tăng nhưng nhịp tim không tăng Bệnh nhân thường có dấu hiệu li bì, có thể hôn mê, trụy tim mạch, có thể dẫn đến tử vong

Những bệnh nhân qua khỏi, sau khi đã hết các triệu chứng lâm sàng, khoảng 5% vẫn tiếp tục thải vi khuẩn qua phân do vi khuẩn vẫn tồn tại ở túi mật Tình trạng này có thể kéo dài nhiêu năm Họ trở thành nguồn truyền bệnh rất nguy hiểm

2.3.2.3 Nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn

Bệnh xãy ra do ăn phải thực phẩm nhiễm Salmonella, thường do ăn thức ăn

không được bảo quản tốt

Thời gian ủ bệnh thường vào khoảng 10 đến 48 giờ (đây là điểm khác biệt rất cơ bản với nhiễm độc thức ăn do tụ cầu, thời gian ủ bệnh rất ngắn, chỉ khoảng vài ba giờ) Sau thời gian ủ bệnh bệnh nhân sốt, nôn và tiêu chảy Ở người lớn rối loạn tiêu hóa thường kéo dài từ 2 đến 5 ngày rồi tự khỏi Một số ít bệnh nhân trở thành người lành mang vi khuẩn kéo dài trong nhiều tháng

Một số loài Salmonella chỉ gây nhiễm độc thức ăn ở người lớn lại có thể gây ra

tình trạng bệnh lý rất nặng ở trẻ nhỏ và trẻ sơ sinh Bệnh nhi có thể nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm xương Có thể gây ra các vụ dich ở các khoa nhi

2.3.3 Miễn dịch

Sau khi mắc bệnh thương hàn, trong huyết thanh bệnh nhân có các kháng thể

chống lại kháng nguyên O, H (và cả kháng nguyên Vi đối với những bệnh do S typhy và S paratyphy C) Tuy nhiên ngày nay người ta nhận thấy vai trò bảo vệ của kháng

thể trong huyết thanh không đầy đủ Kháng thể lớp IgA trong dich tiết tại chỗ có vai trò rất quan trọng trong cơ chế bảo vệ

Người ta cũng có những bằng chứng về miễn dịch qua trung gian tế bào chống

Salmonella Tế bào lympho ở tổ chức bạch huyết tại ruột có khả năng đề kháng tự

nhiên đối với Salmonella

2.3.4 Chuẩn đoán vi sinh vật bệnh thương hàn 2.3.4.1 Cấy máu

Cấy máu được tiến hành lúc bệnh nhân đang sốt cao, cần lấy máu trước khi điều trị kháng sinh

Lấy 5 – 10 ml máu tĩnh mạch ngay vào tuần đầu của bệnh cấy vào bình canh thang (thường dùng canh thang có mật bò), ủ ở 370C, theo dõi hàng ngày Vi khuẩn thương hàn thường mọc sau 24 đến 48 giờ, nếu chưa mọc thì tiếp tục theo dõi tiếp 2 tuần lễ, nếu không mọc thì mới kết luận âm tính

Khi vi khuẩn mọc, môi trường đục và có váng thì nhuộm Gram, kiểm tra hình thể và tính chất bắt màu Nếu là Gram (-) thì cấy chuyển sang môi trường chọn lọc và xác định tính chất sinh vật hoá học Cuối cùng xác định công thức kháng nguyên bằng kháng huyết thanh mẫu

Nếu chưa điều trị bằng kháng sinh, ở tuần lễ đầu, tỉ lệ cấy máu dương tính tới 90%; tuần thứ 2 khoảng 70 – 80%; tuần thứ 3 khoảng 40 – 60%

Cấy máu có giá trị nhất trong chuẩn đoán Nếu cấy máu dương tính cho phép ta xác định chắc chắn bệnh nhân mắc bệnh thương hàn

2.3.4.2 Cấy phân

Nên cấy phân vào môi trường tăng sinh để Salmonella phát triển nhiều và kìm

hãm các vi khuẩn khác Sau đó cấy chuyển vào môi trường có tinh ức chế chọn lọc

Môi trường phân lập thích hợp nhất là SS (Salmonella – Shigella), ở nước ta các phòng

xét nghiệm thường dùng môi trường Endo hoặc môi trường Istrati vì nó dễ sản xuất trong điều kiện phòng thí nghiệm và cho kết quả tốt

Chỉ riêng cấy phân, dù phân lập được vi khuẩn cũng không cho phép ta xác định chắc chắn bệnh nhân mắc bệnh vì người lành cũng có thể mang vi khuẩn thương hàn

Cấy phân ngoài mục đích chuẩn đoán cón có giá trị kiểm tra sau khi bệnh nhân đã hết các dấu hiệu lâm sàn có còn tiếp tục đào thải vi khuẩn nữa hay không Cấy phân còn là phương pháp để phát hiện người lành mang vi khuẩn

2.3.4.3 Chuẩn đoán gián tiếp

Tiến hành phản ứng Widal để xác định kháng thể trong huyết thanh Sau khi

nhiễm Salmonella 7 – 10 ngày, trong máu sẽ xuất hiện kháng thể kháng kháng nguyên

O, sau 12 – 14 ngày xuất hiện kháng thể kháng kháng nguyên H Kháng thể tồn tại trong máu trung bình là 3 tháng đối với kháng thể O và 1 - 2 năm đối với kháng thể H

Phản ứng Widal là phản ứng ngưng kết Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng dần thành nhiều độ đậm khác nhau, trộn riêng biệt với kháng nguyên O và kháng nguyên H để xác định hiệu giá kháng thể O Trong giai đoạn đầu có thể chỉ thấy kháng thể O Đến giai đoạn toàn phát sẽ thấy cả kháng thể O và H

Việc phân tích kết quả xét nghiệm ở lần thứ nhất nhiều khi rất khó và thường không cho phép ta kết luận chắc chắn Phản ứng cần được làm hai lần để xác định động lực kháng thể: lần đầu làm ở tuần thứ nhất, lần hai làm ở tuần thứ hai của bệnh Nếu động lực kháng thể cao thì mới cho phép chuẩn đoán chắc chắn Nhược điểm của phương pháp chuẩn đoán gián tiếp là cho kết quả chậm

Phát hiện người lành mang vi khuẩn, đặc biệt lưu ý những người liên quan trực tiếp với ăn uống tập thể, như những người cấp dưỡng ở các cơ quan, những người chế biến thức ăn, phục vụ ở các cửa hàng ăn uống

Chuẩn đoán sớm và cách ly bệnh nhân kịp thời, xử lý chất thải của bệnh nhân Đối với xúc vật bị bệnh: chữa triệt để hoặc giết

2.3.5.2 Phương pháp phòng bệnh đặc hiệu

Trước đây người ta xử dụng rộng rãi vacxin TAB Đây là loại vacxin chết, 1 ml

chứa khoảng 1 tỉ S typhi, 250 triệu S paratyphi A và 250 triệu S paratyphi B Vacxin

TAB được đưa vào cơ thể qua đường tiêm, hiệu lực không cao và chỉ duy trì được 6 tháng

Sau đó người ta sản xuất loại vacxin chứa kháng nguyên Vi của S typhi, đưa vào

cơ thể bằng đường tiêm, có hiệu lực bảo vệ trên 70 % với liều 25 μg

Ngày nay, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đang nghiên cứu loại vacxin sống, giảm độc lực, đưa vào cơ thể bằng đường uống để kích thích miễn dịch tiết tại ruột Loại vacxin này đã được thử nghiệm ở một số nước nhưng kết quả đã được công bố khác nhau khá nhiều

2.3.6 Điều trị

Những kháng sinh thường được dùng để điều trị Salmonella là chloramphenicol

và ampicillin

Trước đây chloramphenicol là loại kháng sinh có hiệu lực gần như tuyệt đối trong

điều trị các Salmonella nói chung và các Salmonella gây bệnh thương hàn nói riêng Tuy nhiên hiện nay tỷ lệ Salmonella kháng thuốc ngày càng tăng Ở nước ta, những

năm gần đây đã xuất hiện nhiều vụ dịch thương hàn do vi khuẩn kháng thuốc gây nên Theo kết quả của Chương trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn

gây bệnh công bố năm 1999, đã có tới 40 % S typhi (phân lập năm 1998) kháng lại

ampicillin và 62 % kháng lại chloramphenicol

2.4 Escherichia coli[3],[12],[29]

Escherichia do Escherich phát hiện lần đầu tiên năm 1885 Giống Escherichia

được chọn là đại biểu điển hình của họ vi khuẩn đường ruột Giống này gồm nhiều loài

như E coli, E adecarbonxylase, E blattae, E fergusonii, E hermanii và E vulneris;

trong số đó, E coli có vai trò quan trọng nhất và được chọn làm đại biểu điển hình của giống Escherichia

2.4.1 Đặc điểm sinh học 2.4.1.1 Hình thái

E coli là trực khuẩn Gram (-), hình que thẳng Kích thước dài, ngắn khác nhau,

trung bình từ 2 – 3 x 0,5 μm; trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài (6 – 8 μm)

Rất ít chủng E coli có vỏ, không sinh bào tử, hầu hết có lông và có khả năng di

động

Hình 2.3: Escherichia coli

2.4.1.2 Tính chất nuôi cấy

E coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi Phát triển dễ dàng trên môi

trường nuôi cấy thông thường Một số có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng Phát triển được ở nhiệt độ từ 5 – 400C, phát triển tốt nhất ở 370C, pH 7 – 7,2

Trong những điều kiện thích hợp E coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ

khoảng 20 – 30 phút

Cấy vào môi trường lỏng sau 3 – 4 giờ đã làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau 2 ngày trên mặt môi trường có váng mỏng Những ngày sau dưới đáy ống có thể thấy cặn

Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 – 10 giờ, dùng kính lúp có thể quan sát được khuẩn lạc Sau 24 giờ đường kính khuẩn lạc khoảng 1,5 mm Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S, nhưng cũng có thể gặp dạng R, hoặc M

2.4.1.3 Tính chất hoá sinh

Lên men và sinh hơi một số loại đường thông thường như lactose (trừ E coli loại

EIEC), glucose, manitol, ramnose…Người ta dựa vào khả năng lên men đường lactose

để phân biệt E coli với các loài vi khuẩn đường ruột khác

ONPG (+), urease (-), H2S (-), LDC (+).ff Nghiệm pháp IMVIC: I+

M+ V- I- C-, indol (+), methyl red (+), Vosges Proskauer (-), lên men đường inositol (-), citrat simmons (-)

2.4.1.5 Cấu tạo kháng nguyên

Cấu tạo kháng nguyên của E coli rất phức tạp E.coli có đủ ba loại kháng nguyên

O, H, K

Kháng nguyên O:

Là kháng nguyên thân Hiện nay người ta đã biết tới gần 160 yếu tố kháng

nguyên O của E coli

Kháng nguyên K:

Là kháng nguyên bề mặt Khoảng 100 loại yếu tố kháng nguyên K đã được xác định và chia làm 3 loại dựa vào độ nhạy cảm của của kháng nguyên này với nhiệt độ: A, B và L, trong đó A dưới dạng vỏ quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường, B và L dưới dạng màng rất mỏng chỉ có thể quan sát được nhờ kính hiển vi điện tử

Kháng nguyên H:

Là kháng nguyên lông Hơn 50 yếu tố kháng nguyên H đã được xác định

2.4.1.6 Phân loại

Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E coli được chia thành các typ huyết thanh Với

sự tổng hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều typ huyết thanh