Khảo sát sự ra hoa trong ống nghiệm ở cây lan sò và cây bắt ruồi

Khảo sát sự ra hoa trong ống nghiệm ở cây lan sò và cây bắt ruồi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ RA HOA TRONG ỐNG NGHIỆM Ở CÂY

LAN SÕ (Dischidia pectinoides Pearson) và CÂY BẮT RUỒI (Drosera burmannii Vahl)

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2003 – 2007

SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN THỊ NGỌC TÖ

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHẢO SÁT SỰ RA HOA TRONG ỐNG NGHIỆM Ở CÂY

LAN SÕ (Dischidia pectinoides Pearson) và CÂY BẮT RUỒI (Drosera burmannii Vahl)

GVHD: TS TRẦN THỊ DUNG SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC TÖ

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007

ii

LỜI CẢM TẠ

Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi

điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập

- Các Thầy Cô thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng các Thầy Cô tại

trường đã luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy và giúp đỡ tôi

- TS Trần Thị Dung đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời

gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

- KS Trần Ngọc Hùng, KS Nguyễn Thị Thu Hằng, KS Lê Hồng Thủy

Tiên thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Nông Lâm Tp.HCM đã tạo mọi điều kiện và hướng dẫn tôi hoàn thành tốt đề tài

- Toàn thể các bạn trong lớp CNSH29 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi

trong suốt thời gian làm đề tài

Chân thành cảm ơn

Tháng 08 năm 2007 Nguyễn Thị Ngọc Tú

iii

TÓM TẮT

NGUYỄN THỊ NGỌC TÚ, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 08/2007

“KHẢO SÁT SỰ RA HOA TRONG ỐNG NGHIỆM Ở CÂY LAN SÒ (Dischidia

pectinoides Pearson) và CÂY BẮT RUỒI (Drosera burmannii Vahl)”

Hội đồng hướng dẫn: TS Trần Thị Dung

Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007 tại Bộ môn Công

nghệ sinh học Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM Cây lan sò và cây bắt ruồi in

vitro được nuôi cấy trong môi trường cảm ứng ra hoa với các yếu tố cảm ứng được

sử dụng là GA3, BA, cường độ ánh sáng và sự gia tăng nồng độ KH2PO4, giảm nồng độ NH4NO3

Những kết quả thu được:  Đối với cây lan sò

- Môi trường thích hợp nhất để cây lan sò ra hoa trong ống nghiệm (đạt tỉ lệ 44,4%) là môi trường MS có bổ sung GA3 1,5mg/l Cây ra nụ sau 78 ngày nuôi cấy và ra hoa sau 95,5 ngày, trung bình đạt 7 hoa/cây

- Môi trường có bổ sung BA hoặc thay đổi cường độ ánh sáng không có ảnh

hưởng nhiều trên sự ra hoa của cây lan sò in vitro

 Đối với cây bắt ruồi

- Việc thay đổi nồng độ KH2PO4 và NH4NO3 không có ảnh hưởng tốt trên sự

ra hoa của cây bắt ruồi in vitro Cây chỉ ra nụ nhưng tỉ lệ không cao hơn so với đối

chứng Tất cả các nụ đều không nở thành hoa

iv

ABSTRACT

NGUYEN THI NGOC TU, Nong Lam University, HCM city, August, 2007

“The study of flowering in vitro in Dischidia pectinoides Pearson and Drosera

burmannii Vahl.”

Supervisor: Tran Thi Dung, Ph.D

The subject was studied from 3/2007 to 8/2007 at the Department of Biotechnology

at Nong Lam University Dischidia pectinoides and Drosera burmannii in vitro

were cultured in basic medium Murashige and Skoog (MS) and the supplement with different plant growth regulator such as: GA3, BA; the change of the intensity of light, KH2PO4, NH4NO3

Results:

 In Dischidia pectinoides

The best medium for flower induction is MS medium supplemented with 1.5mg/l GA3 The plants has formed flower buds after 78 days and bloomed after 95.5 days There are 7 flowers in plant

The effect of MS medium supplemented with BA or changed the intensity of light isn’t clearly

 In Drosera burmannii

The change of KH2PO4 and NH4NO3 concentrations didn’t effect in fowering

in vitro in Drosera burmannii The plants was formed flower buds, but ratio isn’t

higher when compared with control treatment All of flower buds didn’t bloom

Chương 2:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về đối tượng nghiên cứu 3

2.2.1 Giới thiệu khái quát về cây lan sò 3

2.1.2 Giới thiệu khái quát về cây bắt ruồi 5

2.2 Các yếu tố ảnh hưởng lên sự ra hoa ngoài tự nhiên 6

2.2.2.4 Hiện tượng xuân hóa (hay sự thọ hàn) 13

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng lên sự ra hoa in vitro 15

2.3.1 Độ tuổi cây 16

2.4 Sự phát triển hoa in vitro 22

2.5 Các nghiên cứu ra hoa in vitro 23

2.5.1 Trên thế giới 23

2.5.2 Trong nước 24

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26

3.2 Nội dung 26

3.3 Bố trí thí nghiệm 26

3.3.1 Nội dung 1: Khảo sát sự ra hoa in vitro của cây lan sò 27

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tạo sò và ra hoa in vitro của cây lan sò 26

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro của cây lan sò trên môi trường có và không có bổ sung nước dừa 27

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự tạo sò và ra hoa in vitro của cây lan sò 28

3.3.2 Nội dung 2: Khảo sát sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi 28

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi 28

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi 29

3.4 Chỉ tiêu theo dõi 29

vii

3.4.1 Theo dõi khả năng tạo chồi và sinh trưởng 29

3.4.2 Theo dõi sự ra hoa 29

3.5 Phương pháp tiến hành 30

3.5.1 Môi trường nuôi cấy 30

3.5.2 Chuẩn bị mẫu cấy 30

3.5.3 Điều kiện nuôi cấy 30

viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hưởng của cường độ ánh sáng

đến sự tạo sò và ra hoa trên cây lan sò trong ống nghiệm 26

Bảng 3.2: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ GA3

đến sự ra hoa in vitro ở cây lan sò trên môi trường có và không có

bổ sung nước dừa 27

Bảng 3.3: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ BA

đến sự tạo sò và ra hoa in vitro trên cây lan sò 28

Bảng 3.4: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4

đến sự ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi 28

Bảng 3.5: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NH4NO3

đến sự ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi 29

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự gia tăng số chồi

của cây lan sò in vitro 31

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự gia tăng lá

của cây lan sò in vitro 32

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến số chồi của cây lan sò in vitro

trên môi trường có và không có bổ sung nước dừa 34

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến sự sinh trưởng lá

của cây lan sò in vitro trên môi trường có và không có bổ sung nước dừa 36

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro

của cây lan sò trên môi trường có và không có bổ sung nước dừa 37

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự gia tăng số chồi

của cây lan sò in vitro 42

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự gia tăng số lá

của cây lan sò in vitro 42

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến sự sinh trưởng chiều cao

ix

của cây bắt ruồi in vitro 45

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro

của cây bắt ruồi 46

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của nồng độ NH4NO3 đến sự sinh trưởng chiều cao

của cây bắt ruồi in vitro 47

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa

của cây bắt ruồi in vitro 48

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1: Các giai đoạn phát triển của hoa lan sò in vitro 39 Hình 4.2: Hoa lan sò in vitro 40 Hình 4.3: Những biểu hiện bất thường của hoa lan sò in vitro 41

Hình 4.4: Ảnh hưởng của BA trên sự tạo chồi và gia tăng số lá

của cây lan sò in vitro 44

Hình 4.5: Các giai đoạn phát triển của hoa bắt ruồi in vitro 49 Hình 4.6: Cấu tạo hoa và các cơ quan bên trong của nụ hoa bắt ruồi in vitro 50

B2

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Vòng đời của một thực vật bắt đầu từ hạt Hạt nẩy mầm hình thành chồi và rễ Cây phát triển sinh dưỡng đến một giai đoạn nhất định thì ra hoa, thụ phấn và tạo hạt Giai đoạn tạo hạt cũng chính là giai đoạn kết thúc một vòng sinh trưởng và phát triển của thực vật và khi hạt nẩy mầm sẽ mở ra một vòng đời mới Thế giới thực vật vô cùng phong phú và đa dạng, có những cây hoàn thành vòng đời trên chỉ trong ba tháng đến một năm nhưng cũng có những cây phải mất đến vài năm

Do vậy, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại, con người đã dần dần chuyển sang nhân giống cây trong ống nghiệm để rút ngắn vòng đời của thực vật, từ đó có thể kiểm soát hầu hết cơ chế của các quá trình diễn ra trong cuộc sống của thực vật Việc nghiên cứu điều khiển thực vật ra hoa trong ống nghiệm cũng là một phần của mục đích trên Nếu con người hiểu rõ cơ chế và có thể điều khiển thực vật ra hoa trong ống nghiệm dễ dàng thì đây sẽ là một công cụ rất hữu ích trong việc nghiên cứu sinh lý thực vật; rút ngắn giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng ở các thực vật có giai đoạn sinh trưởng dài, làm cây ra hoa sớm; và một đóng góp to lớn cho nông nghiệp đó là xây dựng một hệ thống có ý nghĩa trong vi nhân giống, cải thiện giống cây trồng, phục hồi các tính trạng quý, tạo cây có năng suất cao, chất lượng tốt,…

Hơn nữa, trong cuộc sống hiện đại mà hoa kiểng là một phần không thể thiếu của con người thì việc thương mại hóa hoa trong ống nghiệm rất có tiềm năng phát triển trong tương lai do hoa trong ống nghiệm có nhiều ưu điểm vượt trội như là nhỏ, gọn, không tốn diện tích, không tốn công chăm sóc,…rất thích hợp để trang trí trong những văn phòng làm việc hiện đại cũng như làm quà tặng

Cùng mục đích trên và được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại học Nông Lâm, dưới sự hướng dẫn của TS.TRẦN THỊ DUNG, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:

KHẢO SÁT SỰ RA HOA TRONG ỐNG NGHIỆM Ở CÂY LAN SÕ

(Dischidia pectinoides Pearson) VÀ CÂY BẮT RUỒI (Drosera burmanniiVahl)

1.2 MỤC ĐÍCH YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích

Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp để cây lan sò và cây bắt ruồi ra hoa trong ống nghiệm

1.2.2 Yêu cầu

Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây lan sò và cây bắt ruồi in vitro:

- Trong môi trường nuôi cấy có sự thay đổi nồng độ chất dinh dưỡng và nồng độ chất kích thích sinh trưởng

- Trong các điều kiện ánh sáng khác nhau

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Giới thiệu khái quát về cây lan sò

 Nguồn gốc phân loại [15]

Tên khoa học : Dischidia pectinoides Pearson /

Tên tiếng Việt : Lan sò

Lan sò có nguồn gốc từ Philippines, là một loại hoa kiểng mới tại Việt Nam  Đặc điểm hình thái và sinh học [25]

Lan sò là một loại dây leo nhỏ, sống hàng năm, có khả năng phát triển đến chiều dài khoảng 250 cm Lá đơn, mọc đối hoặc xen kẽ Cây phân nhánh từ gốc và nách lá Một số lá của lan sò phồng to lên trông giống như một con sò Hoa nhỏ màu đỏ hồng xuất hiện ở nách lá vào mùa xuân

Lan sò được trồng từ cây con in vitro hoặc từ các nhánh con có rễ Lan sò phát

triển tốt trên các loại giá thể là dương xỉ, vỏ cây bần, xơ dừa hoặc những nhánh cây gỗ trôi dạt,…không phát triển hoặc phát triển chậm trên giá thể là đất Lan sò là cây ưa bóng râm, dưới ánh nắng trực tiếp có thể dẫn tới hiện tượng cháy sém lá, phát

triển tốt trong điều kiện ít ánh nắng mặt trời tốt nhất là ánh nắng nhẹ lúc sớm mai và lúc cuối buổi trưa Ngoài ra đây cũng là một loại cây nhạy cảm với nhiệt độ lạnh Nhu cầu nước của cây không cao, chỉ cần tưới phun sương cho cây 1-2 lần trong một tuần Nguồn thức ăn của cây được tổng hợp từ không khí do vậy chỉ cần bổ sung thêm cho cây một lượng ít phân bón mỗi tháng một lần

 Một số loại lan sò [18, 33]

Dischidia ovata: có nguồn gốc từ Úc, được phát triển như là một loại thực vật

trồng trong nhà, là một loại dây leo có rễ bám có khả năng phát triển đến chiều dài 2m Lá hình oval, mọng nước, màu nâu đỏ khi phát triển dưới ánh nắng mặt trời Khi lớn, cây có những cụm hoa nhỏ màu đỏ hồng

Đây là loại cây ưa bóng râm, phát triển trong điều kiện khí hậu ẩm ướt Cây được nhân giống bằng hạt tươi hoặc giâm cành Cây giâm cành ở giai đoạn vườn ươm cần độ ẩm rất cao

Dischidia platyphylla: xuất xứ từ vùng đảo Philippine, dài khoảng 2m Lá mọc

đối; một vài lá nhỏ, màu xanh xám; hình oval Hoa màu vàng sẫm có thể lớn đến khoảng 4mm đường kính, phát triển từ nách lá có hình dạng như là bình chứa nước

Nhân giống bằng hạt hoặc cành Điều kiện thích hợp cho loại thực vật này phát triển là nhà kính có độ ẩm và nhiệt độ cao, khí hậu mát mẻ

Dischidia nummularia: dài khoảng 3m, dạng dây leo bện chặt vào thân cây

chủ Lá màu xám bạc Hoa nhỏ màu trắng dạng ống mọc thành cụm tròn đồng tâm có một vòng lông thưa phía trong

Nhân giống sử dụng hạt hoặc nhánh trưởng thành trong điều kiện ẩm ướt và khí hậu ấm áp

Dischidia imbricata: có nguồn gốc từ vùng rừng mưa của Malaysia cũng là

một dạng dây leo, bám và phát triển rễ từ các nách lá bất cứ nơi nào tiếp xúc với giá thể để củng cố độ bám và bao phủ hầu như toàn bộ giá thể Hoa của loại cây này có dạng như là một cái bình trà nhỏ Đây cũng là loại cây ưa bóng râm, phát triển tốt trong nhà kính có nhiệt độ ấm áp và có độ ẩm thích hợp

2.1.2 Giới thiệu khái quát về cây bắt ruồi

 Nguồn gốc phân loại [10]

Tên khoa học : Drosera burmanni Vahl (1794)

Tên tiếng Việt : Cây bắt ruồi, Trường lệ Burman, Bèo đất, Trói gà Trong tự nhiên, họ bắt ruồi Droseraceae gồm có 4 chi và khoảng 200 loài, phân bố khắp thế giới Phổ biến nhất là ở Mỹ Ở Việt Nam, cây bắt ruồi được tìm thấy ở khu bảo tồn Bình Châu- Phước Bửu, Đà Lạt và một vài nơi ở Miền Trung Chúng chủ yếu mọc hoang dại, dọc đường đi, ít được con người quan tâm.[3]

 Đặc điểm hình thái và sinh học [1, 16, 19]

Cây bắt ruồi (Drosera burmanni) là dạng cây cỏ nhỏ, sống nhất niên, bò sát

đất Thân ngắn, rễ giả Lá hình hoa thị, mọc chụm ở mặt đất, có cuống bụng, dạng trứng ngược (đầu nhỏ ở phía cuống lá) hoặc dạng nêm, cuống nhỏ dài 10-15 mm, có nhiều lông tuyến ở phía trên Lá có thể sập lại được để bắt sâu bọ đậu vào lá

Cây sinh sản bằng hai hình thức hữu tính và vô tính Sinh sản vô tính bằng cách nẩy chồi con từ gốc thân hay từ đỉnh sinh trưởng Sinh sản hữu tính bằng hạt Cây có hoa quanh năm Hoa nhỏ màu trắng, vàng hoặc tím nằm trên một cuống chung dài mọc thẳng từ giữa đám lá thấp mang hoa lưỡng tính gọi là phát hoa Phát hoa cao khoảng 10 cm có từ 3-10 hoa; hoa mẫu 5; 5 nhị hoa, ngắn hơn đài hoa; bầu nhị đơn, 5 vòi nhụy Quả mỡ, chứa nhiều hạt nhỏ

Hệ thống lông tuyến trên lá tiết ra nhiều chất keo rất nhầy Khi những con côn trùng nhỏ như ruồi, muỗi đậu vào lá, chúng sẽ bị dính chặt vào, lá từ từ cuộn mép

lại, đưa con mồi vào giữa lá, sau đó dịch tiêu hóa sẽ được tiết ra và con mồi dần dần bị tiêu hóa

Cây bắt ruồi được nhân giống bằng hạt, tách chồi hoặc bằng cây con nuôi cấy

in vitro Môi trường phát triển cây bắt ruồi ngoài vườn ươm thích hợp là: ¾ đất mùn + ¼ cát,

cát sạch hoặc cát trộn với bột than gỗ, độ ẩm khoảng 50-70%, nhiệt độ 18-240C, là loại cây ưa ánh sáng nên cần nhiều ánh sáng trực tiếp và cây phải được chiếu sáng tối thiểu từ 6-8 h ngày Ở nơi có cường độ ánh sáng cao cây phát triển tốt và có màu đỏ

 Các loại cây bắt ruồi

Drosera indica L (gọng vó): lá hẹp và dài, mọc toả ra như gọng vó, cũng có

nhiều lông nhày Phân bố những vùng đất lầy, ruộng nghèo [1]

Drosera spatulata: còn gọi là bắt ruồi lá hình thìa, là một loài cây thân thảo

với các lá hình thìa đường kính 12-25 mm Rễ chùm, đường kính mỗi sợi rễ tới 0,2 mm Hoa mọc thành chùm khoảng 2-30 hoa nhỏ, cuống hoa dài khoảng 2-30 cm, phủ đầy lông Các cánh hoa màu tím hồng Hạt hình elip- trụ hoặc elip- trứng, màu từ nâu sẫm đến đen, dài 0,4 mm, đường kính 0,06- 0,12 mm Loài bắt ruồi này phân bố chủ yếu ở châu Á, từ miền bắc Nhật Bản, tới Australia và New Zealand [11]

2.2 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG LÊN SỰ RA HOA NGOÀI TỰ NHIÊN [8]

Trong suốt cuộc đời mình, cơ thể thực vật chịu nhiều biến đổi chất lượng đặc trưng phù hợp với từng giai đoạn khác nhau của vòng đời Ở thực vật có hoa, sự ra hoa là bước chuyển quan trọng đánh dấu bước phát triển mới của thực vật và có ý nghĩa quyết định đối với sự tồn tại của thực vật Hoa được thành lập từ chồi ngọn hay chồi nách qua ba giai đoạn chính: chuyển tiếp ra hoa; tượng hoa; tăng trưởng và nở hoa

Sự chuyển tiếp ra hoa

Sự chuyển tiếp ra hoa gây nên các biến đổi sâu sắc của mô phân sinh ngọn, từ mô phân sinh dinh dưỡng thành mô phân sinh tiền hoa Các biểu hiện đầu tiên của sự chuyển tiếp ra hoa không thấy được bằng mắt thường, chỉ biết được bởi các phân tích tế bào học hay sinh hóa học, với sự tăng mạnh hoạt tính biến dưỡng (tổng hợp RNA, ribosom, protein), đặc biệt trong vùng đỉnh Sự chuyển tiếp ra hoa xảy ra

đồng thời với sự biến đổi rất rõ của bộ máy dinh dưỡng, đặc biệt là sự kéo dài lóng thân do hoạt động mạnh của vùng dưới ngọn của mô phân sinh tiền hoa

Sự tượng hoa

Sự chuyển tiếp ra hoa cần khoảng 2-3 ngày để dẫn tới sự tượng hoa, tức sự sinh cơ quan hoa (quan sát được dưới kính hiển vi) Sự phát triển của các sơ khởi hoa nói chung xảy ra nhanh chóng, làm chồi phồng lên thành nụ hoa (dễ thấy dưới kính lúp, qua lát cắt dọc)

Sự tăng trưởng và nở hoa

Khi sự tượng hoa hoàn thành, nụ hoa có thể tiếp tục tăng trưởng và nở (trường hợp các cây nhất niên) Tuy nhiên nụ hoa có thể vào trạng thái ngủ (ví dụ: nụ hoa Lilas được tạo vào cuối mùa hè, nhưng hoa chỉ nở vào mùa xuân nhờ nhiệt độ lạnh mùa đông gỡ trạng thái ngủ).[8]

2.2.1 Độ tuổi cây [8]

Sự ra hoa (phát triển hoa) là bước chuyển quan trọng trong đời sống thực vật Để một chồi dinh dưỡng trở thành sinh sản, thực vật cần phải đạt tới trạng thái phát

triển tối thiểu hay trưởng thành ra hoa Trạng thái này có thể rất sớm ở Arachis

(phát thể hoa thành lập ở nách tử điệp), khoảng 13 lóng ở cà chua, 5-7 năm ở các cây ăn trái, và khoảng 50 năm ở cây sồi Hơn nữa, vài thực vật cần mùa đông hay quang kỳ thích hợp mới đạt tới trạng thái này Tùy theo các loài thực vật khác nhau mà có chu kỳ phát triển khác nhau, từ hột tới hột, trong vòng vài tháng tới vài năm, thậm chí ở một số cây chỉ khoảng 15 ngày như vài cây vùng sa mạc

2.2.2 Môi trường

2.2.2.1 Tình trạng dinh dưỡng [8]

Mỗi thời kỳ sinh trưởng và phát triển của thực vật có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Trong thời kỳ ra hoa cây cần nhu cầu dinh dưỡng không nhiều nhưng phải cân đối Lượng dinh dưỡng phải đảm bảo nằm trong giới hạn cho phép:

Giới hạn trên: là giới hạn mà ở đó sự phát triển dinh dưỡng chiếm ưu thế Giới hạn dưới: là giới hạn mà dưới đó, dinh dưỡng không đủ cho sự ra hoa

Vì vậy, trong thực tế sự tỉa cành thích hợp sẽ kích thích mạnh sự phát triển hoa

Thông thường, sự dinh dưỡng nhiều đạm kích thích sự phát triển dinh dưỡng và ngược lại, sự dinh dưỡng giàu carbon kích thích sự ra hoa Do đó, việc lựa chọn tỉ lệ C/N cao thích hợp sẽ kích thích sự ra hoa, nếu tỉ lệ này thấp sẽ làm cây phát triển sinh dưỡng cao, nếu tỉ lệ này quá cao hoặc quá thấp sẽ ức chế sinh trưởng của thực vật

Tóm lại, có nhiều yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng tới sự ra hoa, tuy nhiên quan trọng nhất là: sự cạnh tranh giữa phát triển dinh dưỡng và phát triển sinh sản, sự thiếu dinh dưỡng nhẹ (trên mức tối thiểu), và cân bằng C/N

2.2.2.3 Quang kỳ [8]

Quang kỳ là sự xen kẽ giữa sáng và tối trong giai đoạn 24 giờ (trong thực nghiệm, giai đoạn này có thể dài hoặc ngắn hơn), và quang kỳ tính (quang chu kỳ) là phản ứng của thực vật đối với quang kỳ tức là đối với sự biến thiên theo mùa của độ dài ngày Độ dài ngày là một yếu tố quan trọng để điều khiển thời gian ra hoa Đã có nhiều thí nghiệm chứng minh rằng độ dài ngày có ảnh hưởng sâu sắc đối với sự ra hoa của thực vật

Thí nghiệm của Tournois (1912, Pháp) lần đầu tiên chứng minh cây gai dầu có khả năng ra hoa, trong nhà kính, nếu giai đoạn chiếu sáng được rút ngắn

Năm 1913, Klebs trên ví dụ của cây cỏ trường sinh (Sempervivum) đã chỉ ra

rằng có thể làm cây ra hoa vào mùa đông bằng cách chiếu ánh sáng bổ sung

Garner và Allard (1920, Mỹ) thực hiện một hệ thống các thí nghiệm trên loại thuốc lá ra hoa vào mùa thu: Maryland mammoth Bằng cách thay đổi nhiệt độ và quang kỳ (thay đổi chiều dài ngày và đêm), họ kết luận, ở thứ thuốc lá này, không phải nhiệt độ mà chính là quang kỳ ảnh hưởng tới sự ra hoa: cây chỉ ra hoa nếu chiều dài ngày dưới 13-14 giờ Đây là cây ngày ngắn (CNN), giống như cây gai dầu Như vậy, khi đạt tới tuổi trưởng thành, nhiều thực vật phải chờ một dấu hiệu nào đó để tượng hoa, mà quan trọng nhất là quang kỳ Dựa theo những quan sát và phân tích cách đáp ứng của thực vật đối với quang kỳ, người ta phân biệt cây theo quang kỳ như sau:

 Cây bất định (CBĐ): có thể ra hoa bất chấp quang kỳ, miễn là giai đoạn sáng cho phép quang hợp đủ Đặc trưng cho các loại thực vật thuộc nhóm này là: cà chua, đậu Hà lan, phần lớn các thứ thuốc lá, bắp, Lilas, anh đào,…

 Cây ngày ngắn (CNN): chỉ có thể ra hoa nếu giai đoạn sáng ngắn hơn một giai đoạn sáng tới hạn C và giai đoạn tối dài hơn giai đoạn tối tối thiểu; giai đoạn tối không được gián đoạn (sự chiếu sáng trong giai đoạn tối, dù chỉ vài phút, sẽ cản sự ra hoa) Các cây tiêu biểu cho nhóm này là: gai dầu, đậu nành, tía tô, thược dược,…

 Cây ngày dài (CND): chỉ có thể ra hoa nếu giai đoạn sáng dài hơn giai đoạn sáng tới hạn C Ví dụ: rau bi na có C = 13-14 giờ, thì là: 11-14 giờ Trong nhóm này còn có: hành, cà rốt, cải đường, sà lách, thuốc phiện, lúa mạch… Ngoài các nhóm cây nêu trên, còn một số cây không lệ thuộc quá chặt chẽ vào quang kỳ: trong quang kỳ thích hợp, chúng ra hoa nhanh chóng; trong quang kỳ không thích hợp, chúng vẫn ra hoa nhưng chậm hơn Đó là các cây thích ngày ngắn

(vài thứ cúc, Cosmos, Euphorbia), hay các cây thích ngày dài (lúa mì, lúa mạch đen

mùa xuân) Hiếm hơn, một vài loài có thể ra hoa trong đêm tối liên tục như huệ dạ hương từ giò, khoai tây từ chồi trên củ Một số cây có đồng thời hai giá trị tới hạn: một trên và một dưới Đây là các cây ngày dài- ngày ngắn hay cây ngày ngắn- ngày dài

Vậy quang kỳ tác động lên cây như thế nào? Theo quan điểm của Allard và Garnar (1920) thì cây đáp ứng với các chiều dài tương đối của ngày và đêm Hanner

và Bonner (1938) đã chứng minh rằng ở một số cây ngày ngắn Xanthium (C=15,5

giờ): cây không đáp ứng với chiều dài ngày cũng như chiều dài tương đối của ngày và đêm, mà đáp ứng với chiều dài của giai đoạn tối, chính giai đoạn tối mới quan trọng Các nhà nghiên cứu trong những năm 40 của thế kỷ XX đã phát hiện rằng sự ra hoa và các phản ứng khác đối với quang kỳ thực chất là do độ dài đêm chứ không phải do độ dài ngày kiểm soát Thực nghiệm cho thấy thực vật được gọi là ngày ngắn cần có đêm tối liên tục Nếu giai đoạn tối bị ngắt quãng bởi những cường độ chiếu sáng thấp chỉ khoảng 3-5 lux trong thời gian 3-5 phút ở 7-9 giờ sau khi bắt đầu giai đoạn tối có thể đảo ngược phản ứng ra hoa của cây Ngược lại, nếu giai đoạn sáng của cây ngày dài bị ngắt quãng bởi sự che tối thì điều này hoàn toàn không gây ảnh hưởng tới khả năng ra hoa của cây ngày dài [2,8]

Năm 1936, B.S Moskov và M.K Tsailakhian chứng minh rằng cơ quan tiếp nhận cảm ứng quang kỳ là lá Những cành không có lá không ra hoa mặc dầu có tác động của quang kỳ thích hợp Sự tác động của quang kỳ dù chỉ trên một lá cũng đủ để hình thành mầm hoa Các lá non đã nở ra hoàn toàn mẫn cảm nhất Tác nhân kích thích được hình thành trong lá dưới ảnh hưởng của quang kỳ thích hợp di chuyển vào điểm sinh trưởng Sau một số lượng chu kỳ cảm ứng nhất định cây mới ra hoa trong mọi chu kỳ quang Tùy thuộc vào kiểu thực vật mà số lượng các chu kỳ cảm ứng khác nhau Có những loài chỉ đòi hỏi một chu kỳ quang, song cũng có những loài cần đến 25 chu kỳ quang (đậu tương) [8]

Vào năm 1865, Sachs phát hiện ra rằng những lá cây để ngoài sáng sản xuất ra những chất hình thành hoa, chúng hiện diện ở hàm lượng rất nhỏ nhưng đóng vai trò tiên phong trong sự ra hoa Đến năm 1936, Chailakhyan đã nhận thấy ở cây

Xanthium chỉ cần đặt một lá trong ngày ngắn (che tối), phần cây còn lại trong ngày

dài, cây có thể ra hoa ở những vị trí khác nhau Lá là nơi nhận cảm ứng và chồi là nơi phản ứng ra hoa, do đó phải có sự vận chuyển kích thích từ lá tới chồi [7] Kích thích ấy có dấu hiệu hormon và được ông gọi là florigen – hormon ra hoa

Giả thuyết về florigen đã được làm sáng tỏ qua việc tiến hành các thí nghiệm ghép: có sự truyền kích thích quang kỳ qua chỗ ghép, để kích thích sự ra hoa của

cành không được cảm ứng Hơn nữa, chất trích từ cây ngày ngắn Xanthium hay cây bất định hướng dương, đang ra hoa, nếu được chích vào cây Xanthium chưa được cảm ứng quang kỳ, có thể kích thích cây Xanthium này ra hoa Từ các kết quả như

vậy, người ta cho rằng: florigen là hormon chuyên biệt cho sự ra hoa, có tính phổ biến ở thực vật và không có tính hữu cực Như vậy, cây chỉ ra hoa khi nào tích lũy đủ lượng florigen cần thiết cho sự ra hoa dưới tác dụng của quang kỳ.[8]

Các thí nghiệm trên đã dẫn tới kết luận về sự tồn tại của hormon đặc hiệu chuyên biệt gây ra sự chuyển cây sang trạng thái ra hoa Vì sự chuyển sang trạng thái ra hoa có thể do sự ghép lá lấy từ cây đang ra hoa gây nên tùy thuộc vào phản ứng chu kỳ quang của nó, người ta giả định hormon đó giống nhau đối với tất cả các loài cây Tuy nhiên, quan điểm đó đã bị lung lay một ít vì đã có thí nghiệm trong đó xử lí hormon GA làm cho thực vật ngày dài ra hoa ở điều kiện ngày ngắn và không gây ảnh hưởng gì đối với cây ngày ngắn [8] Chailakhyan (1936- 1977) đã đưa ra giả thuyết chất tạo hoa có chứa hai thành phần gồm: gibberellin và anthesin để hóa giải mâu thuẫn này Theo ông tùy loài thực vật mà một trong hai thành phần của florigen luôn luôn hiện diện đầy đủ trong mọi cơ quan thực vật, thành phần thứ hai chỉ được tạo ra trong điều kiện quang kỳ cảm ứng Một thực vật trưởng thành ra hoa khi hội đủ hai thành phần này Quang kỳ và số chu kỳ cảm ứng thay đổi theo loài là để điều chỉnh tỉ lệ giữa hai thành phần này (gibberellin/ anthesin) ở mức độ thích hợp từ đó kích thích cây ra hoa [8]

Những thí nghiệm trên đây đã khẳng định sự hiện diện của florigen nhưng bản chất và cơ chế tác động thực sự của florigen đối với sự hình thành ra hoa của cây vẫn còn là một bí ẩn lớn đối với các nhà khoa học Gần đây, với tiến bộ về phương pháp phân tích với độ nhạy cao có thể phát hiện sự hiện diện của những hợp chất ở những nồng độ rất nhỏ đã mở ra hy vọng tìm ra florigen Kết quả phân tích cho thấy, ngoại trừ đường, trong libe còn chứa những phân tử nhỏ, peptide, protein(Fisher và ctv, 1992; Sakuth và ctv, 1993; Marentes và Grusak, 1998; Xoconostle-

Cazares và ctv, 1999; Kehr và ctv, 1999), và acid nucleic (Kühn và ctv, 1997; Medrano và ctv, 1999) Vì vậy florigen cũng có thể được dự đoán là một peptide, 1 protein, 1 nucleic acid, hay 1 phân tử nhỏ Vì vậy chỉ có những phân tích về thành phần của nhựa libe một cách tỉ mỉ hơn mới có thể trả lời chính xác thành phần tự nhiên của florigen là gì và đây cũng là nhiệm vụ của công nghệ sinh học thực vật trong tương lai [14,24]

Ruiz-Năm 1935, Flint và Mcalister thấy rằng sự nẩy mầm của hạt cải xà lách được kích thích bởi ánh sáng đỏ nhưng bị cản bởi ánh sáng đỏ xa (Fr) Năm 1946, Borthwick và Hendricks chứng minh hiệu ứng đối nghịch của R (660nm) và Fr

(730nm) trên sự ra hoa Xanthium pennsylvanicu Năm 1952, Borthwick và

Hendricks lặp lại thí nghiệm của Flint và Mcalister và nhận thấy rằng hiệu ứng ánh sáng có những đặc tính giống nhau trên hai hiện tượng nẩy mầm và ra hoa và hai ông nhận định rằng: do yêu cầu thấp về năng lượng nên không thể có hai sắc tố mà đơn giản hơn chỉ có hai dạng dễ biến đổi qua lại của cùng một sắc tố họ gọi là phytochrom gồm có dạng Pfr (hoạt động) được sinh ra dưới hiệu ứng của R qua con đường quang hóa có tác dụng kích thích nẩy mầm hay cản ra hoa, và dạng Pr (không hoạt động) được sinh ra dưới hiệu ứng của Fr Từ đây xuất hiện hai thuyết về hoạt động của phytochrom đối với quá trình ra hoa của thực vật là thuyết “đồng hồ cát” và thuyết “đồng hồ sinh học” Tuy nhiên, hai thuyết này chưa thuyết phục bởi chưa giải thích được một số trường hợp đối với các loài thực vật khác Gần đây, người ta hướng sang xem xét đến nhiều yếu tố môi trường sung quanh Các yếu tố môi trường có thể tác động trực tiếp hoặc gián tiếp trên sự ra hoa: quang kỳ được nhận bởi lá trưởng thành, nhiệt độ bởi cả thực vật (riêng sự thọ hàn được nhận chủ yếu bởi ngọn chồi), nước bởi hệ thống rễ,…Các yếu tố này tương tác mạnh trong sự ra hoa, và mỗi yếu tố có thể làm thay đổi giá trị ngưỡng của những yếu tố khác Sự điều hòa chuyển tiếp ra hoa bằng tín hiệu môi trường có ảnh hưởng quan trọng đảm bảo cho sự ra hoa đồng loạt và giao phối cùng loài của hầu hết các loài thực vật, hoàn tất sự sinh sản hữu tính dưới các điều kiện bên ngoài thích hợp

Cho đến nay cơ chế của sự ra hoa trên thực tế vẫn chưa được hiểu rõ và vẫn còn gây nhiều thắc mắc tranh cãi đối với những người làm nghiên cứu khoa học Tuy nhiên, những thí nghiệm trên đây đã phần nào hé mở và đưa ra những hướng đi mới để chúng ta có thể đi sâu nghiên cứu một cách rõ ràng hơn nữa cơ chế và các yếu tố ảnh hưởng trên sự ra hoa ở thực vật

2.2.2.4 Hiện tượng xuân hóa (hay sự thọ hàn) [8]

Hiện tượng xuân hóa ở thực vật là hiện tượng cảm ứng thực vật nẩy chồi hoặc ra hoa bằng xử lý nhiệt độ lạnh (cây chỉ ra hoa sau khi trải qua một giai đoạn nhiệt độ lạnh nhất định) đặc biệt là thực vật ôn đới Điều này đã được chứng minh qua thí

nghiệm của Lyssenko (1928) trên giống lúa mì Triticum sativum Đây là giống lúa

mì gồm hai thứ: thứ mùa đông hạt gieo vào mùa thu, cây mầm trải qua mùa đông và tăng trưởng trong mùa xuân, sau đó cây ra hoa vào mùa hè năm sau; thứ mùa xuân hạt được gieo vào mùa xuân, cây tăng trưởng và ra hoa trong mùa hè (cây mầm không chịu được mùa đông) Như vậy, thứ mùa đông phải trải qua nhiệt độ lạnh mùa đông mới có thể cho hoa, nếu gieo vào mùa xuân, cây vẫn ở trạng thái dinh dưỡng và không cho hoa trong mùa hè Trên cơ sở đó, Lyssenko đã tiến hành thí nghiệm như sau: ông đã cho làm ẩm hạt thứ mùa đông (tới 50% trọng lượng khô), sau đó đặt hạt trong phòng lạnh (1-200C), trong một tháng, thì các hạt này có thể gieo trong mùa xuân, và cây ra hoa như thứ mùa xuân với năng suất cao Với kỹ thuật này, cây không cần qua mùa đông và người nông dân không phải làm việc vất vả Đó là kỹ thuật thọ hàn hay xuân hóa do Lyssenko đề ra và đặt tên, và đã được áp dụng trên hàng triệu hecta, từ năm 1935, ở Liên Xô

Như vậy, dựa vào yêu cầu của sự thọ hàn có thể phân thực vật ra làm 3 loại: Cây cần thọ hàn tuyệt đối (thường có dạng hoa hồng): phải trải qua một thời gian nhiệt độ lạnh mới ra hoa thường là cây hai năm ( cải đường, cà rốt,…); cây nhiều năm (Lolium, Dactylis glomerata,…);…

Cây cần thọ hàn không bắt buộc (ra hoa sớm hơn nếu được thọ hàn): lúa mạch đen Petkus ra hoa khi có 7 lá nếu hạt được thọ hàn, nhưng cần 16-25 lá nếu không được thọ hàn

Cây không cần thọ hàn: cây một năm không qua mùa đông, cây đa niên tượng hoa trước mùa đông.

Cơ quan để cây tiếp nhận kích thích của nhiệt độ thấp là phôi hay chồi Nhiệt độ thấp là yếu tố khởi động hoạt tính phân sinh của phôi hay chồi và làm cho tất cả các chồi xuất phát từ đó cũng được xuân hóa Ngoài ra cũng có một số thí nghiệm cho thấy rằng đỉnh sinh trưởng cũng là nơi tiếp nhận xử lý lạnh Nếu ghép đỉnh sinh trưởng của cây đã xuân hóa vào cây chưa xuân hóa thì sẽ xảy ra phản ứng ra hoa y như chúng đã được xuân hóa Tuy nhiên cho đến lúc này thì cơ chế của quá trình xuân hóa vẫn chưa được hiểu đầy đủ [2]

Tùy theo loại cây mà độ tuổi mẫn cảm với xuân hóa của thực vật có khác nhau Ở ngũ cốc giai đoạn hiệu quả nhất là lúc nẩy mầm, thậm chí ở giai đoạn bảo quản hạt giống Ở các thực vật khác thì giai đoạn mẫn cảm nhiệt độ sảy ra ở một thời kỳ sinh trưởng của cây: giai đoạn cây con, giai đoạn trải lá bàng (bắp cải) Chính vì vậy mà những cây hai năm thì cần một mùa đông cây sinh trưởng trong điều kiện nhiệt độ thấp

Năm 1948, Melchers và Lang đã tiến hành thí nghiệm ghép giữa cây hai năm không thọ hàn và cây hai năm đã thọ hàn, cho thấy kích thích ra hoa Từ đây đã xuất hiện quan niệm về hormon xuân hóa đặc hiệu gọi là “vernalin” được truyền qua chỗ ghép và không đặc hiệu cho loài Vậy bản chất của “vernalin” là gì? Sự thọ hàn thường đi cặp với sự gia tăng gibberellin, nhóm chất làm dễ sự ra hoa ở vài loài hoa hồng Các chất cản sinh tổng hợp gibberellin đàn áp hiệu ứng thọ hàn Tuy nhiên, giả thuyết vernalin là gibberellin là khó chấp nhận vì gibberellin chỉ giúp sự kéo dài lóng ở các thực vật mà các lóng ngắn là sự cản trở duy nhất của sự ra hoa và gibberellin vẫn kích thích ra hoa ở một số cây hai năm khi không trải qua xử lý lạnh Vậy cũng giống florigen, gibberellin không thể là vernalin - hormon xuân hóa mà chỉ có thể là hormon hoạt tính của vernalin Trong cây tồn tại chất mà biến đổi thành tiền chất của vernalin trong điều kiện lạnh, sau đó tiền chất này biến đổi thành vernalin và ở nhiệt độ ấm áp, nó quay trở lại chất ban đầu Do đó trong một số

trường hợp điều kiện môi trường không thuận lợi đặc biệt là nhiệt độ cao sẽ xảy ra hiện tượng phản xuân hóa.[2,8]

Việc hiểu biết ảnh hưởng của nhiệt độ thấp hay hiện tượng xuân hóa đến sự phát triển của cây có ý nghĩa trong sản xuất Bằng biện pháp xử lý nhiệt độ thấp thích hợp, người ta có thể biến lúa mì đông thành lúa mì xuân, biến cây hai năm thành cây một năm Hơn nữa, với hầu hết các loại cây trồng, việc xử lý nhiệt độ thấp hoặc bảo quản nhiệt độ thấp cho hạt giống, củ hoặc căn hành sẽ làm tăng khả năng rút ngắn thời gian sinh trưởng, xúc tiến sự ra hoa nhanh và làm tăng năng suất, phẩm chất thu hoạch [2]

2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG LÊN SỰ RA HOA IN VITRO

Ngay từ khi ra đời ngành công nghệ sinh học nhất là công nghệ sinh học thực vật đã có những đóng góp to lớn trong lĩnh vực nông nghiệp, góp phần cải thiện đáng kể sản lượng lương thực, thực phẩm đồng thời bảo tồn và góp phần làm phong phú thêm hệ thực vật trên trái đất Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật có vai trò đáng kể trong những thành quả đã đạt được ở trên thông qua việc nghiên cứu sinh lý các quá trình sinh trưởng và sinh sản của thực vật Hiện nay, việc nghiên cứu sinh lý thực vật được tập trung ở thời kỳ cuối trong vòng đời của thực vật đó là giai đoạn ra hoa

Khả năng hình thành hoa in vitro của mẫu cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố bên

trong và bên ngoài, hoá học và vật lý nhưng thật sự thì các yếu tố trên đều có ảnh hưởng qua những con đường rất phức tạp và không thể xác định được (Trần Thanh Vân ,1973; Trần Thanh Vân và ctv, 1974; Scorza và Janick, 1980; Croes và ctv, 1985; Lang, 1987; Compton và Vielleux, 1992) Sự ra hoa được xem là một quá trình điều hoà phức tạp bởi sự phối hợp của các yếu tố môi trường và di truyền (Tisserat và Galletta, 1995) Những yếu tố đặc biệt quan trọng là độ tuổi, dinh dưỡng, chất điều hoà sinh trưởng, ánh sáng và pH của môi trường nuôi cấy (Heylen và Vendrig, 1988) [38]

2.3.1 Độ tuổi cây

Trong điều kiện in vitro, cây có thể ở trạng thái phát triển sinh dưỡng mãi mãi mà không cần hoàn thành vòng đời như trong điều kiện in vivo Tuy nhiên, đối với giai đoạn ra hoa, cả cây in vitro lẫn cây in vivo đều phải hội đủ các yếu tố cần thiết

mới hình thành hoa hay nói cách khác thực vật phải trải qua giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, đạt đến một giai đoạn trưởng thành nhất định thì mới ra hoa Thực vật còn non không ra hoa vì chúng chưa có khả năng ra hoa hoặc đỉnh sinh trưởng không đáp ứng với nhân tố tạo hoa (Lang, 1965; Hackett, 1985) Ở đây, độ tuổi của mẫu cấy ban đầu có thể có hoặc không ảnh hưởng như là một yếu tố cần thiết cho sự

ra hoa của cây in vitro Demeulemeester và Deproft (1999) báo cáo rằng độ tuổi của cây mẹ có khả năng ảnh hưởng lên sự ra hoa in vitro ở cây rau diếp xoăn Tương tự,

ở cây hoa hồng, G Y Wang+ và cộng sự cũng nhận thấy cây mẹ hoa hồng còn trẻ và khỏe mạnh sẽ làm tăng sức sống và sự đồng đều của mẫu cấy trước khi đưa vào môi trường cảm ứng tạo hoa Hơn nữa, thời gian của giai đoạn tiền nuôi cấy cũng ảnh hưởng mạnh tới khả năng tạo hoa của cây hoa hồng sau khi được đưa vào môi trường cảm ứng Ví dụ: nếu mẫu cấy hoa hồng được nuôi cấy 45 ngày trước khi đưa vào môi trường cảm ứng thì tỉ lệ hình thành hoa rất cao (49,2%), trong khi mẫu được nuôi cấy khoảng 25 hoặc 60 ngày trước khi cảm ứng cho tỉ lệ hoa thấp hơn

nhiều (5,9% và 9,2%) Đối với cây đậu xanh (Pisum sativum), tỉ lệ hoa tăng sau khi

cấy chuyền lần hai, tỉ lệ hoa giảm và mất khả năng ra hoa sau lần cấy chuyền thứ ba trở đi Trái lại, đối với cây cẩm chướng, các mẫu cấy dù đã trải qua trên bốn lần cấy chuyền mẫu cấy vẫn cho tỉ lệ hình thành hoa cao (Daksha et al, 1994) Cho đến nay vẫn chưa có báo cáo rõ ràng nào về sự ảnh hưởng của độ tuổi mẫu cấy đối với sự ra

hoa của cây trong điều kiện in vitro [21,22]

2.3.2 Dinh dưỡng 2.3.2.1 Nồng độ đường

Đường cần thiết cung cấp nguồn cacbon trong môi trường nuôi cấy để cảm ứng sự ra hoa và phát triển hoa (Steinberg 1950; Takimoto 1960; Kimura 1963; Loo 1964b; Paulet 1965; Margara và Touraud 1968; Nitsch 1972; Dien và Tran Thanh

Van 1974; Handro 1977) Các loại đường sucrose, glucose, maltose, lactose và raffinose đã được sử dụng thành công (Margara và Rancillac 1966; Nitsch và Nitsch

1967) trong đó sucrose là loại đường thường được sử dụng trong nuôi cấy in vitro

nhất Nồng độ đường tối ưu cho sự ra hoa khác nhau giữa các loài Hiệu quả tác động của đường hòa tan thể hiện thông qua việc tăng cường hoạt động của con đường trao đổi chất pentose phosphate (Nitsch và Nitsch 1967) Ngoài ra, hiệu quả của việc sử dụng đường cũng chịu ảnh hưởng của ánh sáng và sự xuân hóa trong tác động riêng biệt của chúng (Liverman và Bonner 1953; Baldev 1959; Pierik 1967b) [9]

2.3.2.2 Hàm lượng photpho và nitơ [1,22]

Như chúng ta đã biết, nitơ là thành phần cơ bản của chất nguyên sinh trong tế bào, quyết định sự sinh trưởng của cây Ngoài ra, nitơ còn là thành phần cấu tạo của enzyme và diệp lục tố Sự dinh dưỡng giàu nitơ giúp cây phát triển sinh dưỡng mạnh, cây cao lớn, lá xanh tốt; thiếu nitơ, lá nhỏ, vàng úa, cây cằn cỗi, phát triển

chậm và ra hoa sớm Trong nuôi cấy mô, nitơ được cung cấp thống qua các các

muối nitrat (NO3

)và muối amon (NH4+) Ngoài nitơ, phospho cũng là yếu tố không thể thiếu cho cây, có vai trò quan trọng trong tổng hợp nucleoprotein của nhân tế bào, vận chuyển năng lượng, tham gia vào cấu trúc màng, thúc đẩy sự phát triển rễ

và làm cây phát dục nhanh Do vậy, trong nghiên cứu ra hoa in vitro, môi trường

thường được sử dụng là môi trường ½ MS hoặc kết hợp giảm lượng nitơ và tăng lượng phospho Điều này đã đem lại những kết quả đáng kể trong các nghiên cứu ra

hoa in vitro Ví dụ: ở cây Torenia, nếu loại bỏ NH4NO3 trong môi trường sẽ làm tăng cường sự biệt hóa nụ hoa của mẫu cấy trên môi trường MS (Tanimoto và Harada, 1981); ở cây đậu xanh, khi giảm nồng độ NH4NO3 trong môi trường MS

còn 8,25g/ml thì tỉ lệ ra hoa cao nhất là 4,2 hoa/ chồi; ở Cymbidium và

Ornithogalum nồng độ phospho cao kích thích sự ra hoa của cây; sự gia tăng lượng

phospho gấp 2 lần trong môi trường ½ MS (giảm N) làm cải thiện đáng kể tỉ lệ ra

hoa của cây Brassica [30]

2.3.3 Các chất điều hòa sinh trưởng

Khi thực vật đạt được độ tuổi nở hoa, các yếu tố môi trường như nhiệt độ, ánh sáng và chất dinh dưỡng có ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành và biệt hóa chồi hoa (Lang, 1952; Salisbury, 1961; Evans, 1971) Những ảnh hưởng này được thực vật cảm nhận gián tiếp thông qua các chất có tác dụng kích thích hay ức chế sự nở hoa tồn tại trong cơ thể chúng Qua nhiều nghiên cứu cho thấy sự nở hoa dường như là kết quả của sự tương tác giữa các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như cytokinin, auxin, gibberellin, ethylene, acid abscisic (ABA) và những chất khác đã biết hoặc chưa biết (Raghavan và Jacobs, 1961; Bernier và ctv, 1977; Wellensiek, 1977) Điều này càng thể hiện rõ hơn trong các nghiên cứu ra hoa trong ống nghiệm

và các chất điều hòa sinh trưởng thể hiện rõ vai trò quan trọng của mình [9]

2.3.3.1 Cytokinins

Cytokinin là một trong các chất điều hòa sinh trưởng bắt buộc được sử dụng

trong điều khiển ra hoa in vitro do có vai trò kích thích sự phân chia tế bào và hình

thành cơ quan, tạo chồi và tăng trưởng nụ nách thông qua tác dụng của quá trình sinh tổng hợp các yếu tố tăng trưởng [2,20] Ngoài ra, cytokinin còn thúc đẩy một

số thực vật bậc cao chuyển sang giai đoạn sinh sản trong điều kiện in vitro (Dickens

và Staden, 1988; Paek và ctv, 1989; Wang và ctv, 1993, 1997; Jumin và Nito, 1996; Jumin và Ahmad 1999) Cytokinin cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của nụ hoa được báo cáo ở cả cây một lá mầm (Mohanram và Batra, 1970; Zhong và ctv, 1992) và hai lá mầm (Rastogi và Sawhney, 1987; Narasimhulu và Reddy, 1984) Cytokinin có thể cảm ứng tạo hoa khi sử dụng đơn lẻ (Duan và Yazawa, 1995; Jumin và Nito, 1996; Nadgauda và ctv, 1997; Jumin và Ahmad, 1999) Ở một số thực vật, để hoa được hình thành thì cần kết hợp cytokinin với auxin (Peeter và ctv, 1994), hay gibberellin (Rastogi và Sawhney, 1987) hoặc kết hợp cùng kinetin, GA3 và IAA (Luo và ctv (2000); Tepfer và ctv, 1966) [30] Tuy cytokinin có vai trò quan

trọng trong việc hình thành hoa in vitro nhưng nó vẫn không thể cảm ứng sự nở hoa

ở các mô thực vật còn non Điều này cho thấy rằng ngoài cytokinin còn có yếu tố

khác liên quan đến hướng biệt hóa hoa của thực vật (Wardell và Skoog, 1969b; Scorza và Janick, 1980)[9]

Trong các loại cytokinin thì 6_Benzyladenine (BA) và thidiazuron (TDZ) thường được sử dụng nhất TDZ là một chất điều hoà sinh trưởng tổng hợp, không là dẫn xuất của cytokinin nhưng có tác dụng như 1 cytokinin Các sinh trắc nghiệm được thực hiện nhận thấy rằng TDZ có tác dụng gấp 4 lần hơn cytokinin Ở nồng độ thấp, TDZ cảm ứng tái sinh chồi trực tiếp từ mô Ở nồng độ cao, TDZ cảm ứng hình thành sẹo và những cấu trúc bất thường Ở nồng độ quá cao, TDZ cảm ứng hình thành sẹo và phôi sinh dưỡng từ sẹo Vì TDZ bền, có hoạt tính cao nên thường được sử dụng trong nuôi cấy mô [5] Đối với tác dụng kích thích sự ra hoa in vitro, đã có

nhiều nghiên cứu thành công khi bổ sung BA hoặc TDZ vào môi trường nuôi cấy

như Bambusa edulis (Chuoun-Sea Lin và ctv, 2002), hoa hồng (Wang G.Y và ctv, 2002), Cymbidium (Chang và Chang, 2003), Murya paniculata (Jumin và Admad,

Anton và cộng sự (1991) nghiên cứu sự tạo hoa của cây Nicotiana tabacum cv

Samsun bằng cách áp dụng những loại hormone khác nhau trong những thời gian

khác nhau cho thấy rằng auxin tuy không có vai trò trong sự tượng hoa nhưng nó quan trọng trong sự biệt hoá của chồi hoa sau đó [30]

2.3.3.3 Gibberellins [9]

Trong điều kiện in vivo, gibberellins là kích thích tố sinh trưởng vừa có tác

dụng điều khiển nở hoa trên một số loài vừa có tác dụng ức chế ra hoa trên một số loài khác (Evans 1971) Gibberellins có thể cảm ứng làm thay đổi trạng thái của cây

từ giai đoạn trẻ sang giai đoạn ra hoa trên một vài loại cây lá kim (Phares et al 1976) Trong điều kiện in vitro, gibberellin thường được sử dụng trong các nghiên

cứu điều khiển ra hoa trong ống nghiệm Có nhiều báo cáo chứng minh rằng GA3 có tác dụng tăng cường sự nở hoa của mẫu cấy trên nhiều loài khác nhau như Araceae (Paulet và Nitsch 1964b; Pierik 1967b; Tizio 1979; Chang và Hsing 1980; Corr và Widme 1987, Tjia 1989; Funnell 1993; Henny 1995; Henny et al 1999; Kuehny 2000) Lang (1965) cho rằng gibberellins có tác dụng đối với sự phát triển của hoa hơn là cảm ứng tạo hoa

2.3.4 Các yếu tố khác

Ngoài các chất cơ bản có trong môi trường nuôi cấy như: các chất vô cơ và hữu cơ, chất điều hoà sinh trưởng thì còn có một số chất khác cũng đóng vai trò là tác nhân kích thích hoặc ức chế sự ra hoa trong ống nghiệm Các chất kích thích sự

ra hoa in vitro thường là các hợp chất phenol như p-coumaric acid và coumarin

(Paulet và Nitsch, 1964), EDTA (Maheshwari và Chauhan, 1963), nước dừa, dịch

chiết từ cây L annua đang nở hoa hoặc chưa nở hoa (Pierik, 1967), orotic acid,

thymine, adenine, abscisic acid (Nitsch và Nitsch, 1967), glucosamine, diethylstillbesterol, uridylic acid (Margara và Touraud, 1967), amino acid, amino sugars và meso-inositol (Margara và Touraud, 1967) Ngược lại, các RNA nucleosides, Flavin-adenine-dinucleotide (Chailakhyan và ctv, 1961) và dịch chiết từ cây Kalanchoe blossfediana chưa cảm ứng được sự ra hoa (Blake, 1972) có vai trò như chất ức chế sự hình thành hoa [9]

 pH và trạng thái vật lý của môi trường

Sự phát triển của mô có thể thay đổi hoàn toàn nếu chúng được nuôi cấy trên một môi trường đặc hoặc trong một môi trường lỏng Các rễ của cây endive (một loại rau cải thường được sử dụng ở Châu Âu) được nuôi trong môi trường lỏng có cầu giấy chỉ có thể sinh ra các chồi dinh dưỡng, trong lúc ấy nếu nuôi trên môi

trường có agar thì có thể tạo nên các chồi hoa Tương tự, mẫu cấy rễ C intybus

trong môi trường có agar cho tỷ lệ mẫu nở hoa nhiều hơn trong môi trường lỏng sử dụng cầu giấy lọc làm giá thể (Margara và Bouniols, 1967; Bouniols và Margara,

1968; Bouniols, 1971) [3] Ngược lại, G R Rout và P Das (1994) khi nghiên cứu

tạo phôi soma và ra hoa trong ống nghiệm ở 3 loài tre là Bambusa vulgaris,

Dendrocalamus gigateus và Dendrocalamus strictus thì môi trường lỏng cảm ứng ra

hoa tốt hơn môi trường thạch [22]

pH môi trường ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào Vì vậy, việc xác định chính xác độ pH của môi trường có ý nghĩa quan trọng trong nuôi cấy mô [3] Đối

với điều khiển ra hoa in vitro, pH thích hợp cho sự ra hoa thường ở mức thấp hơn so với pH của môi trường thông thường (5,2- 5,8) Ví dụ ở cây Brassica napus pH tối ưu cho sự ra hoa in vitro là 3,9 là mức pH khá thấp so với pH của môi trường

thường Ở mức pH thấp như vậy cây có thể hấp thu được một số hợp chất chỉ hòa tan được ở mức pH thấp như Fe từ hợp chất sắt ferric phosphate (Dalton, Iqbal và Turner 1983; Vyskot và Bezdek 1984; Wolfe, Chen và Eck 1986),… [30] Tác động của pH được xác định thông qua khả năng tăng cường sự hấp thu các chất dinh dưỡng như ion NO3-

(pH thấp), NH4+; các chất điều hòa sinh trưởng nhất là auxin; khả vận chuyển H+

qua màng tế bào thực vật (Edwards và Goldsmith 1980; Zsoldos và Haunold 1982)

 Quang kỳ

Ở điều kiện tự nhiên, quang kỳ đóng vai trò rất quan trọng cho sự ra hoa và

qua nhiều nghiên cứu quang kỳ cũng cần thiết cho sự ra hoa in vitro đặc biệt là ở

các loài nhạy cảm với chiều dài ngày Các nghiên cứu cho thấy sự cảm ứng quang

kỳ của thực vật in vitro có thể là do toàn cơ thể thực vật (Hillman, 1959), đỉnh sinh

trưởng (Raghavan, 1961; Harada, 1967; Jacobs và Suthers, 1971), đốt thân (Harada, 1966; C Nitsh, 1967), đoạn cắt của trục dưới lá mầm (Nitsch, 1972), mẫu mô lá (Rossini và Nitsch, 1966) và đốt rễ (Paulet và Nitsch, 1964; Bouriquet, 1966; Margana và Touraud, 1967, 1968) Các xử lý quang kỳ nhìn chung thường ứng dụng cho các mẫu cấy còn non, qua các thí nghiệm cho thấy rằng sự cảm nhận kích thích của ánh sáng ở thực vật phụ thuộc vào sự hiện diện của lá, đỉnh sinh trưởng hoặc cả cây hoàn chỉnh Sự phản ứng của thực vật đáp ứng với quang kỳ còn phụ

thuộc vào nồng độ tối thiểu của đường có trong môi trường nuôi cấy (Margana và Touraud, 1968; C Nitsch, 1967, 1972) Trong một vài trường hợp người ta thấy

rằng sucrose có thể thay thế hoàn toàn sự kích thích ngày dài ở các cây in vitro

(Lona, 1948; Baldev, 1959, 1962; Deltour, 1967) Zeatin có thể thay thế kích thích

ngày ngắn cho sự nở hoa của cây Wolffia microscopica (Margara và ctv, 1965) [9]

2.4 SỰ PHÁT TRIỂN HOA IN VITRO

Sự khởi đầu ra hoa ở cây xảy ra thường theo sau sự cảm ứng của các tín hiệu

môi trường Trong điều kiện in vivo và in vitro, giai đoạn này thường được nhận biết

bởi sự tích lũy và lưu giữ tinh bột, sự phân bố lại phức tạp hơn của mạng lưới nội chất trong toàn bộ tế bào chất, sự tăng tổng hợp DNA, tăng cường hoạt động của ty thể, của các enzyme thủy giải, tăng mật độ ribosome, tăng hoạt động của các quá trình nguyên phân và hệ số hô hấp ở đỉnh sinh trưởng hoa (Ebrahim Zadeh và Nicolas – Prat, 1969; Salisbury, 1971; Yeung và Peterson, 1972; Wardell vavf Skoog, 1973; Trần Thanh Vân và Chlyah, 1976; Bernier và ctv, 1977) [9]

Thông thường các hoa tạo ra trong ống nghiệm có kích thước nhỏ hơn hoặc có hình dạng khác thường so với hoa ngoài tự nhiên (Buteko, 1964; Ganapathy, 1969; Mehra và Mehra, 1972; Trần Thanh Vân, 1973a; Scorza và Janick, 1980) [9] Chẳng

hạn ở cây nhân sâm, hoa tạo ra trong điều kiện in vitro có kích thước nhỏ hơn so với

hoa trong điều kiện tự nhiên mặc dù hoa vẫn có đầy đủ các cơ quan hoa)[23]; ở cây hoa hồng, đôi lúc hoa bị đột biến, cánh hoa không đều, đài hoa chưa chuẩn hoặc có khi chưa ra được màu giống với hoa trồng trong môi trường thiên nhiên [26]; ở

cây Gentiana triflora Pall var axillarflora, tuy màu sắc hoa có sáng hơn, số bao

phấn ít hơn nhưng hoa vẫn có hình chuông nguyên thủy (Zhang và Leung, 2000) Ngoài ra, việc điều khiển ra hoa trong ống nghiệm còn một hạn chế đó là tỉ lệ nở hoa không đạt được 100% như mong đợi [23,36]

2.5 CÁC NGHIÊN CỨU RA HOA IN VITRO

2.5.1 Trên thế giới

Chang và Hsing (1980) tạo phôi từ các mô sẹo rễ của cây nhân sâm (Panax

ginseng) và các phôi này ra hoa khi nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS có bổ sung 1

mg/l BA và 1 mg/l GA3 [23]

Haeng Soon Lee, Kwang _ Wong Lee, Seung Gyun Yang và Jang Ryol Liu(1991): từ tế bào hợp tử (zygotic embryos) nghiên cứu điều khiển ra hoa trong ống

nghiệm trên cây nhân sâm (Panax ginseng) Thí nghiệm được tiến hành trên môi

trường muối vô cơ MS (1962) có nồng độ nitrogen giảm đi một nửa, 100mg/l myo_inositol, 0,4mg/l thiamin HCl, 30mg/l sucrose và kích thích sinh trưởng BA, GA3, ABA Sau 10 tuần nuôi cấy, cây nhân sâm ra hoa với tỉ lệ cao nhất trên môi trường chứa 5µm BA và 5µm GA3 Ngoài ra, trên các môi trường chỉ chứa BA; tổ hợp BA+GA3+ABA, hoặc BA + ABA cây cũng cho ra hoa với tỉ lệ tương đối cao

G R Rout và P Das (1994) nghiên cứu tạo phôi soma và ra hoa trong ống

nghiệm ở 3 loài tre là Bambusa vulgaris, Dendrocalamus gigateus và

Dendrocalamus strictus Đốt thân của cây con tái sinh từ phôi soma được nuôi cấy trên môi trường cảm ứng ra hoa: 1/2 MS bổ sung 0,5 mg/l adenin sulphate; 0,25 mg/l IBA; 0,5 mg/l GA3 và 3% sucrose Sau 12 tuần nuôi cấy thì cho hoa, môi trường lỏng cảm ứng ra hoa tốt hơn môi trường có agar (60-70% so với 25-30%).[36]

Rajani S Nadgauda và ctv (1997) báo cáo rằng khi nuôi cấy cây con in vitro của giống tre Babusa arundinacea trong môi trường MS lỏng chứa 2% sucrose, 5%

nước dừa và 2,2 µM BA, sau 3 - 6 tháng có 70 % mẫu cấy ra hoa [37]

Nadgauda et al (2000): Cảm ứng tạo hoa in vitro ở cây Dendrocalamus

strictus Cây được nuôi cấy trong môi trường ½ MS có bổ sung các nồng độ khác

nhau của TDZ (0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; và 1mg/l); 2% sucrose và để trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày ở 25 ± 20

C Sau 21 ngày nuôi cấy tất cả mẫu được chuyển sang môi trường ½ MS không chứa TDZ Kết quả thí nghiệm cho tỷ lệ ra hoa cao

nhất sau 2 tuần nuôi cấy trên những mẫu cấy được cấy chuyền từ môi trường ½ MS

có chứa 0,5mg/l TDZ sang môi trường ½ MS

Kachonpadungkitti Yong sak Romchatngoen Supot Hasegewa Koji và

Hisajima Shigeru (2001): cảm ứng tạo hoa in vitro từ mẫu chồi cây lúa kiều mạch nuôi cấy in vitro Trên môi trường ½ MS, với nitrat là nguồn nitro duy nhất, 5%

sucrose, 0,1µm kinetin trong điều kiện nuôi cấy 27± 20C ở quang kỳ là 8 giờ chiếu sáng và 16 giờ trong tối, mẫu cấy được cảm ứng tạo hoa trên 100% số lượng với 16 hoa trên mẫu và số hoa nở trên mẫu là 9 sau 8 tuần nuôi cấy [29]

S Sudhakaran và V.Sivasankari (2002): chồi của cây húng (Ocimum basilicum

L.) được cấy trên môi trường 1/2 MS có bổ sung BAP (3- 5- 7 mg/l) và IAA (1-3-5

mg/l) Sau 20 ngày nuôi cấy cây cho ra hoa in vitro ở môi trường có nồng độ BAP là

7 mg/l và IAA là 5 mg/l [35]

G Y Wang, M.F.Yuan và Y.Hồng (2002) đã nghiên cứu ra hoa trong ống nghiệm ở 6 loại hoa hồng Cây con tái sinh từ chồi sau 45 ngày thì chuyển sang môi trường MS chứa 400 mg/l myo–inositol, 30 g/l sucrose bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng zeatin, TDZ, NAA, BA, IAA, GA3 ở các nồng độ khác nhau Sau 156-

561 ngày kể từ khi bắt đầu nuôi cấy cây cho ra hoa in vitro với mật độ hoa cao nhất

ở môi trường chứa 0,5 mg/l TDZ hoặc 0,5 mg/l zeatin kết hợp với 0,1 mg/l NAA (49,2%, 44,2%) [21]

Chen Chang và Wei - Chin Chang (2003) đã thành công khi callus có được từ

thân rễ của Cymbidium ensifolium var misericors ra hoa in vitro trên môi trường 1/2

MS chứa 1,5 µM NAA kết hợp với TDZ (nồng độ từ 3,3–10 µM) hay 2iP (nồng độ 10–33 µM) sau 100 ngày nuôi cấy [31]

2.5.2 Trong nước

Nguyễn Hồng Vũ và ctv (2003) lần đầu tiên điều khiển thành công ra hoa trong ống nghiệm ở cây hoa hồng Đặc biệt, tác giả đã phát hiện 2 yếu tố quan trọng mang tính chất quyết định đối với sự nở hoa của thực vật là cytokinin và đường, trong đó,

đường là yếu tố tác động chính lên sự hình thành hoa in vitro, còn cytokinin giúp

làm tăng tỉ lệ hình thành hoa và giúp biệt hoá các cấu trúc hoa ở giai đoạn sau khi

tượng hoa, làm chất kích thích sự hình thành hoa Tuy nhiên đề tài vẫn còn một số điểm chưa hoàn thiện lắm: đôi lúc hoa bị đột biến, cánh hoa không đều, đài hoa chưa chuẩn hoặc có khi chưa ra được màu giống với hoa trồng trong môi trường thiên nhiên do vậy cần tiếp tục nghiên cứu, hoàn thiện quy trình ra hoa của cây hoa hồng trong ống nghiệm [26,27]

Phạm Thị Minh Thu và ctv (2005) đã cho loài hoa Torenia màu tím (Torenia

Fournieri) trổ hoa thành công trong ống nghiệm từ mẫu chồi được tái sinh từ lá cây

Torenia mọc lên từ hạt Tiếp theo Nguyễn Ngọc Thi và ctv đã tiếp tục tiến hành thí

nghiệm làm thay đổi màu sắc hoa torenia trong ống nghiệm từ màu tím sang trắng

bằng cách bổ sung yếu tố vi lượng vào môi trường sống của cây.[12,34]

Vũ Quốc Luận, Dương Tấn Nhựt (2006) đã điều khiển làm cho những đóa hoa

lan đầu tiên nở trong ống nghiệm ở loài lan Dendrobium Mild Yumi [17]

Lê Hồng Thủy Tiên và ctv (2006) điều khiển ra hoa thành công cây dừa cạn

(Catharanthus roseus) trong điều kiện in vitro Theo thí nghiệm này, môi trường

thích hợp nhất cho sự ra hoa của cây dừa cạn trong ống nghiệm là môi trường MS bổ sung 0,05 mg/l TDZ và 0,1 mg/l NAA.Tỉ lệ ra hoa là 100%.Cây ra nụ sau 58 ngày nuôi cấy và 68 ngày thì hoa nở, trung bình có 4 hoa/cây [4]

Nguyễn Thị Mỹ Duyên và ctv (2007) đã tiến hành thí nghiệm nở hoa trong ống

nghiệm trên hai giống lan Dendrobium mini và Giả Hạc và đã đạt được thành công

đáng kể khi hai loại hoa lan này đã lần lượt ra hoa trong ống nghiệm [13]

Đề tài thực hiện gồm 2 nội dung:

Nội dung 1: Khảo sát sự ra hoa in vitro ở cây lan sò (Dischidia pectinoides Pearson) Nội dung 2: Khảo sát sự ra hoa in vitro ở cây bắt ruồi (Drosera burmannii Vahl)

3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), một yếu tố, 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình 1 mẫu

3.3.1 Nội dung 1: Khảo sát sự ra hoa in vitro của cây lan sò

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tạo sò và ra

hoa in vitro của cây lan sò

Bảng 3.1: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự

tạo sò và ra hoa in vitro trên cây lan sò

Nghiệm thức Môi trường Cường độ ánh sáng (lux)

Tổng số bình: 36 Tổng số mẫu:

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro của

cây lan sò trên môi trường có và không có bổ sung nước dừa

Bảng 3.2 Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in

vitro ở cây lan sò trên môi trường có và không có bổ sung nước dừa

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự tạo sò và ra hoa in

vitro của cây lan sò

Bảng 3.3 Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự tạo

sò và ra hoa in vitro trên cây lan sò

Tổng số mẫu: 36

3.3.2 Nội dung 2: Khảo sát sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi

Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường cơ bản MS với sự thay đổi nồng độ của thành phần hóa chất thực hiện thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro

của cây bắt ruồi

Bảng 3.4: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến sự

ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi

Tổng số bình: 45 Tổng số mẫu: 45

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa in vitro

của cây bắt ruồi

Bảng 3.5: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NH4NO3 đến sự

ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi

3.4 CHỈ TIÊU THEO DÕI

3.4.1 Theo dõi khả năng tạo chồi và sinh trưởng của cây

- Chiều cao cây (cm): tính từ gốc đến đỉnh sinh trưởng

- Số lá (lá/cây): đếm số lá trên cây, tính lá đã nở ra hoàn toàn và thấy rõ cuống lá - Số chồi hình thành: số chồi hình thành sau khi cấy

3.4.2 Theo dõi sự ra hoa

- Tỉ lệ cây ra nụ (%): là tỉ lệ giữa tổng số cây ra nụ trên tổng số mẫu cấy - Thời gian ra nụ (ngày): tính từ lúc cấy đến khi có 30% cây ra nụ

- Thời gian ra hoa (ngày): tính từ lúc cấy đến khi 30% nụ nở thành hoa đầu tiên - Tỉ lệ hoa nở (%): là tỉ lệ giữa tổng số hoa và tổng số nụ

- Số hoa (hoa/cây): là tổng số hoa trên 1 cây