Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn và tính đề kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nước uống

Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn và tính đề kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nước uống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

****** 000 ******

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM KHUẨN VÀ TÍNH ĐỀ

KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Pseudomonas

aeruginosa TRONG NƯỚC UỐNG

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HOÀNG THU TRANG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

****** 000 ******

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM KHUẨN VÀ TÍNH ĐỀ

KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Pseudomonas

aeruginosa TRONG NƯỚC UỐNG

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS NGUYỄN TRỌNG HIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY

****** 000 ******

SERVEY OF THE MICROBIOLOGICAL QUALITY AND

ANTIBIOTIC - RESISTANCE OF Pseudomonas aeruginosa ISOLATED FROM DRINKING WATER

GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY

Professor Student

HCMC, 08/2007

iii

LỜI CẢM ƠN

 Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP HCM đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt bốn năm qua Ban Giám đốc Viện PASTEUR TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp

 Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

ThS Phẩm Minh Thu, Trưởng phòng Vi Sinh Thực Phẩm, Khoa LAM, Viện PASTEUR TP HCM đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi nhiều kiến thức quý báo trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

TS Nguyễn Trọng Hiệp, Bộ môn Vi Sinh – Ký Sinh, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM là người thầy khơi dậy trong tôi niềm đam mê trong công việc Thầy đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn tất khóa luận tốt nghiệp này

TS Nguyễn Ngọc Hải, Đại Học Nông Lâm TP HCM đã đóng góp những ý kiến chân thành cho tôi trong bước đầu thực hiện khóa luận

Các cô trong Phòng vi sinh thực phẩm, Khoa LAM, Viện PASTEUR TP HCM đã nhiệt tình chỉ dẫn cho tôi trong quá trình thực tập

 Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè, tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã luôn ở bên tôi, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian qua

 Con thành kính ghi ơn ba mẹ và tất cả những người thân trong gia đình luôn là nguồn động viên và khích lệ to lớn cho con trong suốt thời gian học tập

Sinh viên

Nguyễn Hoàng Thu Trang

iv

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

NGUYỄN HOÀNG THU TRANG, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh “Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

Pseudomonas aeruginosa trong nước uống” thực hiện tại Phòng vi sinh thực phẩm,

Khoa LAM, Viện PASTEUR TP HCM từ 03/2007 đến 07/02007 GVHD: ThS PHẨM MINH THU

TS NGUYỄN TRỌNG HIỆP

Vật liệu dùng để nghiên cứu là nước uống được phân thành 2 nhóm: nhóm 1 là nước uống đóng chai (50 mẫu), nhóm 2 là nước uống xử lý (350 mẫu) gồm có nước uống công ty (200 mẫu), gia đình (50 mẫu), trường học (50 mẫu), bệnh viện (50 mẫu) Chúng tôi sử dụng phương pháp màng lọc để kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh trong nước uống dựa theo TCVN 6096:2004, làm kháng sinh đồ để kiểm tra tính đề kháng kháng

sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa

thạch theo tiêu chuẩn NCCLS 2007 và tham khảo thêm tiêu chuẩn CA-SFM 2004 Kết quả chúng tôi ghi nhận được như sau:

Về các chỉ tiêu vi sinh

Nước uống gia đình không đạt chỉ tiêu vi sinh nhiều nhất chiếm 52% mẫu kiểm tra Tiếp theo là nước uống công ty 28%, nước uống đóng chai 20% , nước uống trường học 6% và hầu hết nước uống bệnh viện đều đạt chỉ tiêu vi sinh

Trong các chỉ tiêu vi sinh, P aeruginosa là chỉ tiêu nhiễm nhiều nhất chiếm đến 62% (59 trong 95 mẫu không đạt chỉ tiêu vi sinh), kế đến là Coliform 56%,

Về tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn P aeruginosa

Trong 16 loại kháng sinh thử nghiệm, vi khuẩn đề kháng tỉ lệ cao với fosfomycin từ 33% đến 50% các chủng thu được Một số kháng sinh khác như ticarcillin/a.clavulanic, cefsulodin, imipenem, aztreonam, sulfamides, tobramycin, amikacin cũng bị kháng với tỉ lệ thấp (≤ 5%) Ngoài ra, các chủng vi khuẩn tìm thấy không có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh

v

SUMMARY

This is Nguyen Hoang Thu Trang studying at Nong Lam University and finishing the thesis in August 2007 The thesis entitles “Survey of the

microbiological quality and antibiotic-resistance of Pseudomonas aeruginosa

isolated from drinking water”

A total of 400 samples of drinking water are divided into 2 groups (drinking bottled water and drinking treated water) Group one consists of 50 samples of bottled water; group two consists of 200 samples of drinking water from companies, 50 from families, 50 from schools, 50 from hopitals We use the TCVN 6096:2004 membrane filtration method to isolate microbiology in samples of drinking water We also use the NCCLS 2007 and CA-SFM 2004 diffusion disk method to test the

antibiotic susceptibility of P aeruginosa isolated from samples above

The results of this research are as follows: Microbiology standards:

Family drinking water which is affected most by microbiology contaminations occupies 52% of 50 samples,water from companies occupies 28% of 200 samples, bottled water occupies 20% of 50 samples, water from school only occupies 6% of 50 samples and 100% of samples from hopital is not affected by microbiology contaminations

According to microbiology standards, P aeruginosa is found to be

contaminated most, occupying 62% of 95 samples which do not meet the

microbiology standards, next is Coliform 56%, Coliform fecal 43%, the spores of sulfite-reducing anaerobes (Clostidium) 21% and Streptococcus fecalis 13%

Antibiotic-resistance of P aeruginosa:

High resistance level to fosfomycin observed occupies from 33% to 50% of the isolated samples The strains show resistance at low levels (≤ 5%) to

ticarcillin/a.clavulanic, cefsulodin, imipenem, aztreonam, sulfamides, tobramycin,

amikacin Overall of P aeruginosa strains isolated from drinking water are not

multiresistant

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH BẢNG, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH ix

Chương 2:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình nhiễm khuẩn nước uống 3

2.3.1 Coliforms và Coliform fecal 8

2.3.2 Liên cầu khuẩn nguồn gốc từ phân (Streptococcus fecalis) 9

2.3.3 Vi khuẩn kỵ khí khử sunphite (Clostridium) 10

2.3.4 Pseudomonas aeruginosa 13

2.4 Kháng sinh và tính kháng thuốc của vi khuẩn 16

2.4.1 Thuốc kháng sinh 16

2.4.2 Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 18

Chương 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

3.4 Phương pháp nghiên cứu 23

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu 23

3.4.2 Xử lý số liệu 23

3.4.3 Đánh giá kết quả 24

3.4.4 Phương pháp thử nghiệm vi sinh vật 25

3.4.5 Phương pháp làm kháng sinh đồ 32

Chương 4:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Tỉ lệ nhiễm khuẩn của các loại nước uống 36

4.1.1 So sánh giữa 2 nhóm nước uống (đóng chai và xử lý) 36

4.1.2 Giữa các chỉ tiêu trong từng nhóm nước 38

4.1.3 Tỉ lệ nhiễm P aeruginosa giữa các loại nước uống 40

4.2 Tỉ lệ đề kháng với kháng sinh của P aeruginosa trong các loại nước uống 41

4.3 Một số hình ảnh các vi sinh vật trong quá trình thử nghiệm 44

4.3.1 Tình hình nhiễm khuẩn nước uống 48

4.3.2 Tính đề kháng kháng sinh của P aeruginosa 50

TTC Triphenyl Tetrazolium Chloride

ix

DANH SÁCH BẢNG, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH

Bảng 3-1: Các kháng sinh thử nghiệm trong kháng sinh đồ 33

Bảng 4-1: So sánh tỉ lệ không đạt về chỉ tiêu vi sinh giữa 2 nhóm nước 36

Bảng 4-2: Tỉ lệ không đạt theo từng chỉ tiêu vi sinh giữa 2 nhóm nước 37

Bảng 4-3: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống đóng chai theo từng chỉ tiêu 38

Bảng 4-4: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống công ty theo từng chỉ tiêu 38

Bảng 4-5: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống gia đình theo từng chỉ tiêu 39

Bảng 4-6: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống trường học theo từng chỉ tiêu 39

Bảng 4-7: Tỉ lệ nhiễm P.aeruginosa giữa các loại nước uống 40

Bảng 4-8: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa trong các loại nước uống 41

Biểu đồ 4.1: So sánh sự nhiễm khuẩn giữa 2 nhóm nước 36

Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ nhiễm từng loại chỉ tiêu vi sinh của 2 nhóm nước 37

Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ nhiễm từng loại chỉ tiêu vi sinh của 2 nhóm nước 37

Biểu đồ 4.4: Tỉ lệ nhiễm P aeruginosa giữa các loại nước uống 40

Biểu đồ 4.5: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa trong nước uống đóng chai 42

Biểu đồ 4.6: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa trong nước uống công ty 42

Biểu đồ 4.7: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa trong nước uống gia đình 43

Sơ đồ 3.1: Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform fecal và E coli giả định 26

Sơ đồ 3.2: Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân Streptococcus fecalis 28

Sơ đồ 3.3: Phát hiện và đếm số bào tử kỵ khí khử sunphite (Clotridium) 29

Sơ đồ 3.4: Phát hiện và đếm vi khuẩn P aeruginosa 31

x

Hình 3.1: Thiết bị lọc vi sinh vật với 3 vị trí đặt màng 22

Hình 3.2: Thiết bị hỗ trợ việc đếm khuẩn lạc và đọc kết quả kháng sinh 22

Hình 3.3: Bình ủ kỵ khí 22

Hình 3.4: Các kháng sinh thử nghiệm 32

Hình 4.1: Khuẩn lạc coliform trên môi trường lactose TTC tergitol 7 44

Hình 4.2: Thử nghiệm khả năng lên men đường lactose của coliform, faecal coliform 44

Hình 4.3: Khuẩn lạc Streptococcus fecalis trên môi trường Slanetz và Bartley 45

Hình 4.4: Khuẩn lạc Steptococcus fecalis trên thạch mật asculin-nitrua 45

Hình 4.5: Khuẩn lạc các bào tử Clostridium trên thạch sunphit triptoza 46

Hình 4.6: Khuẩn lạc P aeruginosa trên môi trường thạch CN 46

Hình 4.7: P aeruginosa trên môi trường King’s B 47

Hình 4.8: Thử nghiệm kháng sinh đồ vi khuẩn P aeruginosa 47

Chương 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nước là một thành phần quan trọng của cơ thể sinh vật nói chung trong đó có con người Cơ thể chúng ta có đến 60 – 80% là nước Chỉ cần mất 10% số lượng nước (khoảng 3,5 lít đối với một người nặng 50kg) là cơ thể đã có nguy cơ đưa đến tử vong Trong điều kiện bình thường, mỗi ngày một người lớn trung bình cần khoảng 2 – 2,5 lít nước và nhu cầu này thay đổi tùy theo nhiệt độ môi trường, mức độ hoạt động thể lực, tình trạng bệnh lý của cơ thể Loại nước cơ thể thường dùng nhất là nước lọc, nước nấu chín Đời sống công nghiệp ngày càng phát triển nên nhu cầu sử dụng nước đóng chai rất lớn Do đó trên thị trường xuất hiện các mặt hàng nước khoáng, nước tinh khiết đóng chai, đóng thùng lớn đang ngày càng trở nên phổ biến và thông dụng, đa dạng mẫu mã và rất nhiều chủng loại khác nhau, vì thế chất lượng cũng khó mà kiểm soát Chính vì vậy vấn đề vệ sinh an toàn về nước uống ngày càng được chú trọng Nước uống không đạt tiêu chuẩn vi sinh không chỉ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người sử dụng mà còn là tác nhân truyền các bệnh nhiễm khuẩn qua đường ăn uống một cách nhanh chóng trên diện rộng [38]

Theo TCVN 6096 : 2004 về nước uống yêu cầu kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật

bao gồm: Coliforms tổng số, Coliform fecal, Streptococcus fecalis, Pseudomonas aeruginosa, vi khuẩn kỵ khí khử sunphite [1] Trong đó, P aeruginosa là một chỉ

tiêu mới được đưa vào Ngày nay, người ta càng quan tâm nhiều hơn về sự xuất

hiện của P aeruginosa trong nước uống vì nó có vai trò quan trọng trong nhiễm trùng cơ hội và hiện diện phổ biến trong tự nhiên Do đó, P aeruginosa là một

trong 3 tác nhân hàng đầu gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện [38] Thêm vào đó, trong những điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ cao, thiếu dinh dưỡng , chúng vẫn có thể sinh sôi và phát triển tốt

Trước đây, P aeruginosa được biết đến với vai trò gây bệnh trong bệnh

phẩm nhiều hơn thực phẩm, nó được xem là vi khuẩn gây bệnh cơ hội, tác động đến người có sức đề kháng kém Hiện nay, vi khuẩn này chiếm một tỉ lệ không nhỏ trên các bệnh nhiễm trùng đường tiểu, máu, phổi, vết thương,… và tỉ lệ tử vong khá cao, có thể lên đến 50% so với các loại vi khuẩn khác [23] Gần đây, nhiều khảo sát cho

thấy tính kháng kháng sinh của vi khuẩn này ngày một gia tăng P aeruginosa đã

đề kháng cao với các kháng sinh thường dùng ở Việt Nam [5] Tuy nhiên, ở nước ta tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn này trên nước uống chưa được khảo sát

Từ những cơ sở trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Khảo sát tình hình

nhiễm khuẩn và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nước uống”

1.2 Mục tiêu

1.2.1 Mục tiêu chung

Đánh giá tình hình vệ sinh nước uống và tìm hiểu khả năng đề kháng kháng sinh

của P aeruginosa

1.2.2 Mục tiêu chuyên biệt

 Xác định tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống theo TCVN 6096: 2004

Coliforms tổng số Coliform fecal

Streptococcus fecalis P aeruginosa

Bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sunphit (Clostridium)

 Xác định tỉ lệ nhiễm P aeruginosa trong các mẫu khảo sát

 Khảo sát tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn P aeruginosa tìm được

1.3 Giới hạn đề tài

Do thời gian có hạn nên đề tài chỉ thực hiện kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh của nước uống đóng chai và nước xử lý dùng để uống theo tiêu chuẩn nước uống đóng

chai Trong đó, đặc biệt lưu ý đến chỉ tiêu P aeruginosa và làm kháng sinh đồ của

vi khuẩn này, bởi vì đây là một loại vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng cơ hội nguy hiểm và mới được đưa vào Tiêu Chuẩn Việt Nam về nước uống đóng chai từ năm 2004 đến nay

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nhiễm khuẩn nước uống 2.1.1 Trong nước

Theo kết quả kiểm tra 152 cơ sở sản xuất nước uống đóng chai quy mô nhỏ trên địa bàn TP HCM của Trung tâm Y tế dự phòng thành phố (2004), chỉ có 4 cơ sở (2,5%) đảm bảo điều kiện vệ sinh Trong số các cơ sở còn lại, 70% cơ sở rửa bình (loại bình tái sử dụng) bằng phương pháp thủ công không đảm bảo vệ sinh, 60% có quy trình sản xuất và thực hiện dán nhãn mác không đúng với công bố trước đó, 40% không khám sức khỏe cho công nhân - những người trực tiếp sản xuất [42]

Trần Thị Mai (2005), điều tra nghiên cứu cắt ngang 20 cơ sở sản xuất nước uống đóng chai tại thành phố Buôn Ma Thuộc cho thấy có 11,8% số mẫu không đạt

chỉ tiêu về vi sinh vật, chủ yếu là do sự có mặt của Coliform, Coliform fecal và E coli trong sản phẩm nước uống đóng chai Bên cạnh đó, chỉ có 75% cơ sở được bố

trí dây chuyền sản xuất theo nguyên tắc một chiều, 25% cơ sở có phân xưởng rót và đóng nắp chai kín, 100% cơ sở chưa thực hiện kiểm nghiệm nguồn nước sản xuất và 95% cơ sở chưa kiểm định sản phẩm nước đóng chai theo định kỳ 6 tháng/ lần Trách nhiệm của chủ cơ sở về tổ chức tập huấn và khám sức khoẻ cho công nhân còn hạn chế và ý thức về vệ sinh an toàn thực phẩm của người trực tiếp sản xuất còn thấp[9]

Trung tâm Y tế dự phòng TP HCM (2006) đã xác định vi khuẩn Coliform, Coliform fecal, E coli – là những tác nhân dẫn đến bệnh đường tiêu hóa – có mặt

trong rất nhiều mẫu nước của các trường học thuộc nhiều quận huyện, trong đó nhiều trường có mật độ vi khuẩn khá cao Mẫu nước của Trường Mầm non tư thục

S.C (huyện Bình Chánh) có các loại vi khuẩn E coli (5/100 ml), Coliform và Coliform fecal (60/100 ml); mẫu nước của trường tiểu học Đ.S (quận 11) có đến

1300 Coliform, 1200 Coliform fecal trong 250 ml nước; mẫu nước của trường Mầm

non bán công Y (quận Gò Vấp) có chỉ tiêu 2 loại vi khuẩn nói trên là 600 và 400/250 ml… Thống kê chưa đầy đủ của Trung Tâm Y Tế Dự Phòng Thành Phố, cho đến cuối tháng 10-2005, đã có trên 90 trường trên địa bàn TP HCM có mẫu nước bị nhiễm vi sinh [44]

lệ nhiễm khuẩn của nước máy thấp hơn rất nhiều so với nước lấy từ máy làm lạnh nước uống Điều này có thể do các bình làm lạnh nước uống không được vệ sinh sạch sẽ là nơi ẩn trú các vi sinh vật gây bệnh [21]

Tamagnini L.M và González R.D (1997) nghiên cứu tính ổn định của vi

sinh vật trong nước đóng chai và sự phát triển của P aeruginosa cho kết quả: nước

uống đóng chai vô trùng trong các chai nhựa tái sử dụng hay sử dụng một lần đều

không bị nhiễm Coliforms và Coliform fecal nhưng lại tìm thấy P aeruginosa trong

các chai nhựa tái sử dụng Điều này có thể do vệ sinh kém các chai đựng và vi khuẩn sinh sôi nhờ sử dụng lượng dinh dưỡng thừa còn sót lại trên bề mặt chai [40]

Theo Vess et al (1993), P aeruginosa có khả năng sống sót trên bề mặt PVC [41] Theo Hunter (1993), 29% Pseudomonas sp được phân lập từ nước uống đóng chai là P aeruginosa [25]

Rusin PA (1997), giám sát bệnh lây lan qua đường uống và sự bùng phát bệnh liên quan đến nước uống và nước không dùng để uống thì vi sinh vật gây bệnh

trong nước uống chủ yếu gồm 3 loại vi khuẩn Gram âm đó là P aeruginosa, Acinetobacte, Xanthomonas maltophilia với tỉ lệ như sau: P aeruginosa, < 1%-24%; Acinetobacter, 5%-38%; X maltophilia, < 1%-2%; Aeromonas, 1%-27 Theo

đó, nước uống cũng là nguồn lây nhiễm các loại vi khuẩn gây bệnh cơ hội ảnh

hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ cộng đồng [38] Một khảo sát từ 2003-2004 tại Mỹ có 2760 người mắc các bệnh qua đường uống, có 4 trường hợp bị tử vong [27]

Bharath J (2003), khảo sát chất lượng nước uống đóng chai nội và ngoại

nhập ở Trinidad nhận thấy sự hiện diện của Coliforms tổng số trong các sản phẩm

nội địa là 6,9% so với sản phẩm nhập khẩu là 0% Tương tự như vậy, vi khuẩn hiếu khí trong nước uống đóng chai nội địa cao hơn nhiều so với hàng nhập khẩu (33,6%

so với 14,8%) Đối với Pseudomonas species tỉ lệ nhiễm là 7,6% nhưng tất cả đều âm tính với Coliform fecal và Salmonella spp Như vậy trên cơ sở không có sự hiện diện của Coliform fecal và Salmonella trong nước uống thì 5% nước uống đóng

chai (nội và ngoại nhập) bán trên thị trường không đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng [22]

Aulicino FA (2004), khảo sát các vi sinh vật tồn tại trong nước uống cho biết, nước uống bị đục là nơi ẩn náu cho mầm bệnh và vi sinh vật gây bệnh khác Dịch bệnh lây lan qua đường uống làm ảnh hưởng đến sức khỏe nhiều người thông qua các hệ thống phân phối nước uống, nhất là các khu vực gần bệnh viện [19]

Baumgartner A (2006), đánh giá tình trạng vệ sinh của các loại nước uống: đối với nước uống đóng chai bao gồm nước tinh khiết và nước khoáng từ các máy làm lạnh thì tổng số vi sinh vật hiếu khí ở nước nguồn cao hơn từ các máy làm lạnh

Tuy vậy, P aeruginosa được tìm thấy trong nước nguồn với tỷ lệ 25% và tần số

xuất hiện tương tự như trong các máy làm lạnh , tỉ lệ là 24,1% Kiểm tra tính nhạy

cảm kháng sinh các chủng P aeruginosa tìm thấy trên cả nước nguồn và nước từ

máy làm lạnh là như nhau, chứng tỏ một chủng đơn bắt nguồn từ nước uống đóng chai hơn là xung quanh máy làm lạnh Cho thấy sự nhiễm này bắt nguồn từ nhà sản xuất [20]

2.2 Tình hình kháng kháng sinh của P aeruginosa

2.2.1 Trong nước

Các nghiên cứu trong nước về tình hình nhiễm P aeruginosa trong nước

uống chưa được nghiên cứu Hầu hết khả năng gậy bệnh và tính đề kháng kháng sinh của loại vi khuẩn này chủ yếu được phân lập trên bệnh phẩm Quá trình theo dõi mức độ đề kháng trong năm 1997 của Võ Thị Chi Mai và cộng sự [7] trên các

tác nhân trong nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn đường hô hấp và nhiễm khuẩn

đường tiết niệu thì P aeruginosa là nguyên nhân chính Hơn thế nữa, hầu hết 374

dòng trực khuẩn mủ xanh phân lập từ máu (16), nước tiểu (47) và đàm (311) kháng nhiều loại kháng sinh Ðối với cephalosporins thế hệ 3, đến 62,5% kháng cefotaxime và 38,9% kháng ceftazidime Các vi khuẩn này kháng amikacin 10,8% và tobramycin 59% Trên fluoroquinolones, tỉ lệ kháng ofloxacin là 58,3%, kháng norfloxacin 55,2% và kháng ciprofloxacin 43,8%

Nghiên cứu về tình trạng nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện đa khoa

(BVĐK) tỉnh Quảng Ngãi và bệnh viện đa khoa khu vực Bồng Sơn từ năm

2003-2004 cho thấy P aeruginosa đứng hàng thứ 3 với tỷ lệ 18,8%, gặp chủ yếu ở bệnh

phẩm mủ, chỉ nhạy với amikacin, axepim, ceftazidin, ceftriaxon

Kết quả kiểm tra mẫu nước y tế tại 2 bệnh viện cho thấy: năm 2003 mẫu nước tại BVĐK khu vực Bồng Sơn không có vi khuẩn gây bệnh, năm 2004 các mẫu nước ngâm dây máy hút, rửa tay, nước tắm bé lấy từ sô đựng nước của cả 2 bệnh viện

(nước cất dùng làm ẩm bình ôxy, ngâm dây thở, hút đàm) đều bị nhiễm P aeruginosa và Pseudomonas sp Hai loại vi khuẩn gây bệnh trong mẫu nước chủ yếu là P aeruginosa (71,4%) và trực khuẩn đường ruột gram âm (28,6%) [4]

Trong một nghiên cứu của Lê Bảo Huy và cộng sự [5], tác nhân gây bệnh

viêm phổi bệnh viện chủ yếu là vi khuẩn Gram âm chiếm 86,15% trong đó P aeruginosa chiếm 41,15% Vi khuẩn này đã đề kháng cao đối với những kháng sinh

chuyên trị và hay dùng ở Việt Nam (nhất là các khoa ICU: khoa điều trị tích cực): imipenem (66,7%), ticarcillin/a.clavulanic (45%), ceftazidime (74,1%), cefepime (77,8%), ciprofloxacin (96,3%)

2.2.2 Thế giới

A Lateef (2005), khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn trên các mẫu bệnh

phẩm, thực phẩm, nước uống cho thấy: P aeruginosa được tìm thấy trong các mẫu

bệnh phẩm, dược phẩm, đất bị nhiễm dầu, nước (nước sông, nước giếng và nước

máy) Kết quả: 3,46% P aeruginosa phân lập từ đất đề kháng với 5 loại kháng sinh

Trong bệnh phẩm, 7,69% đề kháng 6 loại kháng sinh, 30,77% đề kháng 7 loại

kháng sinh, 23,1% đề kháng với 8 loại kháng sinh (ampicillin, chloramphenicol, cloxacillin, erythromycin, penicillin, tetracycline, streptomycin, gentamicin) Trong dược phẩm, loại vi khuẩn này cũng có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh từ 2, 4 đến 8 loại kháng sinh khác nhau (augmentin, amoxycillin, tetracycline,

cotrimoxazole, nalidixic acid, ofloxacin, nitrofurantoin) Trong nước, 6,7% P aeruginosa kháng lại 4 loại kháng sinh, 8,5% kháng với 5 loại kháng sinh

(augmentin, amoxycillin, tetracycline, cloxacillin, cotrimoxazole) [26]

Ngoài ra, một số nghiên cứu khác trên bệnh phẩm cũng cho thấy khả năng đề

kháng kháng sinh của P aeruginosa khá cao Gales A C (1997-1999), 6631 P aeruginosa được phân lập chủ yếu trên bệnh nhân viêm đường hô hấp tại 3 vùng khác nhau (Châu Âu, Cannada, Châu Mỹ Latin) Trong đó 218 mẫu P aeruginosa

đa kháng thuốc – đề kháng với nhiều loại kháng sinh thông dụng (piperacillin, ceftazidime, imipenem, and gentamicin), với tỉ lệ 8,2% ở Châu Mỹ Latin, 0,9% ở Cannada [24]

Oguntibeju OO1 & Nwobu RAU2 (2004), nghiên cứu P aeruginosa trên những bệnh nhân bị nhiễm trùng vết thương thấy rằng: tỉ lệ P aeruginosa xâm

nhiễm vào phụ nữ cao hơn đàn ông (tỉ lệ 3 : 2) và tìm thấy nhiều hơn trên các bệnh

nhân là trẻ em và người già Khảo sát tính nhạy cảm kháng sinh của 20 chủng P aeruginosa phân lập được cho thấy tính nhạy cảm của vi khuẩn này với một số

kháng sinh, tỉ lệ là colistin (100%), gentamicin (75%), streptomycin (30%), và tetracycline (10%) [34] Theo nhiều tác giả, fosfomycin là một kháng sinh rất hữu

hiệu trong điều trị các nhiễm trùng do P aeruginosa gây ra Đặc biệt, fosfomycin

có hiệu quả khi kết hợp với các kháng sinh như oxfloxacin [31][32]

2.3 Tổng quan các vi sinh vật

2.3.1 Coliforms và Coliform fecal

 Định nghĩa

Đối với các mục đích kiểm tra nước hằng ngày, nhóm vi khuẩn Coliform có

thể được mô tả bằng các thuật ngữ vi sinh chung, không mang tính phân loại học, như sau:

Các vi khuẩn Coliforms là các vi khuẩn hình que (dạng thẳng), Gram âm,

không có bào tử, oxidase âm tính Chúng có khả năng sinh trưởng hiếu khí và kỵ khí không bắt buộc trong sự có mặt của muối mật (hoặc các yếu tố tác động bề mặt khác có đặc tính ức chế sinh trưởng tương tự) Chúng có thể lên men lactoza kèm theo sự tạo thành acid, gas và andehyd trong vòng 48 giờ khi nuôi cấy ở nhiệt độ từ 350C đến 370C [12], [15]

Các vi khuẩn Coliform fecal là các vi khuẩn Coliform cho thấy có cùng khả

năng lên men và các đặc tính sinh hóa khi nuôi cấy ở nhiệt độ từ 440C đến 44,50C

E.coli là Coliform fecal cho kết quả thử nghiệm IMViC là (+ + - -) dùng để

phân biệt với Aerobacter

 Sự phân bố và khả năng gây bệnh

Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật Coliforms được xem là vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong

thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ khả năng hiện diện

của các vi sinh vật gây bệnh khác Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số Coliforms

của nước cao thì khả năng hiện diện của vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao

Coliform fecal là thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột ở người và động

vật máu nóng khác dùng để chỉ sự ô nhiễm phân trong mẫu môi trường hoăc trong quá trình chế biến, bảo quản thực phẩm, nước uống

E coli là loại vi khuẩn thường trú trong đường ruột động vật và người Bình

thường, chúng là vi khuẩn thuộc hệ sinh thái ruột không gây bệnh, chỉ gây bệnh khi sức đề kháng của người và động vật yếu Chúng gây ngộ độc cho người khi ăn phải thức ăn hoặc thức uống bị nhiễm một lượng lớn vi khuẩn, vi khuẩn theo thức ăn vào ruột và tiết ra độc tố thấm vào máu và gây ngộ độc Biểu hiện thường là tiêu chảy,

sốt cao, mệt mỏi, chân tay co quắp, nặng hơn là viêm dạ dày Đặc biệt là gây tiêu chảy ở trẻ em < 5 tuổi

Ngoài ra, E coli còn gây nhiễm bộ phận niệu sinh dục, viêm màng bụng,

nhiễm trùng huyết ở người

2.3.2 Liên cầu khuẩn nguồn gốc từ phân (Streptococcus fecalis)

 Đặc điểm vi sinh vật học [15]

Steptococcus fecalis là các liên cầu khuẩn, có hình cầu hay hình oval kéo

dài, thường tụ tập thành từng đôi hay từng chuỗi, không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhày, bắt màu Gram dương

Những đặc tính bẩm sinh cho phép chúng sinh trưởng và sống sót trong

những môi trường khắc nghiệt và tồn tại lâu dài trong môi trường tự nhiên S fecalis được tìm thấy ở khắp nơi trong đất, nước, thực phẩm, thực vật và động vật

bao gồm các loài thú, chim và côn trùng Ở người, chúng cư ngụ chủ yếu trong đường tiêu hóa và rất ít hiện diện ở các vị trí khác như đường sinh dục, khoang miệng

Hầu hết các loài này sống hiếu khí tuỳ ý, nhưng phát triển tốt trong điều kiện kỵ khí, tiết bacteriocin trong quá trình tăng trưởng và có thể ức chế sự tăng trưởng

của các vi sinh vật khác S fecalis được xem như là vi khuẩn chỉ thị chất lượng vệ

 Tính chất nuôi cấy

Khi được nuôi cấy trong môi trường azide natri chứa triphenyl tetrazolium

chloride (TTC), khuẩn lạc S fecalis có màu hồng đến màu đỏ đậm do sự khử

triphenyl tetrazolium chloride

S fecalis có khả năng sinh trưởng trong môi trường azide natri, lên men

glucose sinh acid làm biến đổi màu của chất chỉ thị pH trong môi trường

Môi trường khẳng định được sử dụng là Bile Esculine Agar, S fecalis thủy

phân esculine trong môi trường tạo ra sản phẩm cuối cùng là 6,7-hydroxycourmarin, chất này kết hợp với Fe3+ tạo thành hợp chất có màu nâu đen khuếch tán vào môi trường [18]

 Khả năng gây bệnh

Mặc dù S fecalis có thể gây ra nhiễm trùng trong cộng đồng và bệnh viện,

nhưng phải đến sau những năm 1970 vi khuẩn này mới được biết đến như một tác nhân nhiễm trùng bệnh viện mắc phải, cùng với nó là sự gia tăng tính đề kháng với các kháng sinh đương thời được sử dụng Vi khuẩn trên trở thành tác nhân phổ biến đứng hàng thứ hai gây ra nhiễm khuẩn đường tiết niệu và nhiễm trùng vết thương Một số nghiên cứu cho thấy loại vi khuẩn này cũng là nguyên nhân của viêm màng trong tim Nhiễm trùng hô hấp hay hệ thần thần kinh trung ương cũng như viêm

khớp, hạch, viêm xoang có thể do S fecalis gây ra nhưng rất hiếm gặp [28]

2.3.3 Vi khuẩn kỵ khí khử sunphite (Clostridium)

 Đặc điểm vi sinh vật học

Giống Clostridium là các vi khuẩn Gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di động Clostridium thuộc nhóm ưa nhiệt vừa, tuy nhiên có một số ưa nhiệt và một số ưa lạnh

Clostridium có thể thuỷ giải saccharide và protein trong các hoạt động thu

nhận năng lượng Những loài thủy giải saccharide có thể lên men các loại đường polysaccharide tạo thành acetic acid, butyric và rượu Nhiều loài có thể thủy giải protein và chuyển hóa không hoàn toàn các acid amin tạo thành mùi rất khó chịu trong sản phẩm [2][15]

 Khả năng gây bệnh

Người ta nhận biết được hơn 60 chủng loại Clostridium, trong đó nhiều loại

nói chung được coi là khuẩn hoại sinh Một số loài trong nhóm này gây bệnh cho người và động vật đặc biệt trong điều kiện thế năng khử oxy bị giảm sút, một số khác gây hư hỏng thực phẩm, khử sulphite thành sulphur tạo màu đen và gây mùi khó chịu

Các loại khuẩn này gây ra những nhiễm khuẩn kể từ những ô nhiễm vết thương khu trú đến bệnh lan tràn toàn thân Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan

trọng là: C botulinum và C perfringens C botulinum

Đây là vi sinh vật phân bố khắp nơi trong đất, nước, gia súc và các loại thủy sản Loài này sinh độc tố gây bệnh ngộ độc thịt cho người (botulism) Bệnh gây ra

do độc tố được hình thành bởi C botulinum nhiễm trong thực phẩm Các loại thực

phẩm như thịt, rau quả không được bảo quản đúng quy định hay lây nhiễm từ đất, phân động vật hay do chế biến không đủ nhiệt độ trước khi dùng, các sản phẩm đóng hộp không đúng quy cách cũng có nguy cơ nhiễm vi sinh vật này

Độc tố botuline do C botulinum tiết ra gồm 8 typ độc tố khác nhau A, B,C1,

C2, D, E, F và G Tất cả chúng đều là độc tố thần kinh rất mạnh (trừ C2 là loại độc tố tế bào), là những protein có trọng lượng phân tử lớn khoảng 1 triệu dalton Trong

những năm gần đây, các vụ ngộ độc botulism gây ra do C botulinum dòng E

thường được phát hiện khi tiêu thụ cá và các sản phẩm thủy sản

Một số biểu hiện do ngộ độc C botulinum:

- Ngộ độc C botulinum do thức ăn: Sau khi tiêu hóa thực phẩm nhiễm độc tố,

bệnh phát sinh rất khác biệt từ mức nhẹ không cần can thiệp y tế đến mức rất nặng gây tử vong trong vòng 24 giờ Triệu chứng lâm sàng của bệnh là ói mửa, buồn nôn, sau đó có những biểu hiện rối loạn thần kinh như choáng váng, rối loạn thị giác, rối loạn các cơ ở cổ và miệng, đau ở vùng ngực, khó thở và tê liệt, có thể dẫn đến tử vong

- Ngộ độc C botulinum qua vết thương: Khi vết thương bị nhiễm nha bào C botulinum thì các bào tử đó có thể kết đôi và sinh trưởng tạo ra độc tố

- Ngộ độc C botulinum ở trẻ em và người lớn: Độc tố tạo ra và hấp thụ trong

ruột của trẻ sau khi các bào tử đã bị tiêu hóa Mức độ nghiêm trọng có thể gây liệt nặng kèm suy hô hấp và có thể gây chết đột ngột cho trẻ nhỏ

C perfringens

Nhưng trong những năm gần đây không chỉ các dòng C perfringens kháng

nhiệt, tạo bào tử và không làm tan máu mới có thể gây ngộ độc thực phẩm mà các dòng nhạy cảm với nhiệt, không làm tan máu cũng được tìm thấy trong các vụ ngộ độc do vi sinh vật này gây nên

Khi đun nấu thức ăn ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn có thể làm cho các dòng kháng nhiệt tồn tại vì thế chúng sẽ gây tái nhiễm sau khi bảo quản

Các nguồn thực phẩm có thể gây ngộ độc với các vi sinh vật này thường là

thịt gia cầm, nhất là các loại gia cầm lớn đông lạnh sâu, thịt trong các hầm chứa C perfringens cũng được tìm thấy trong đất, trong phân người và trong các loại thực

+ Viêm tiểu tràng hoại tử: do những chủng typ C của C perfringens gây

ra Biểu hiện của bệnh thường là đau bụng cấp, tiêu chảy có lẫn máu, nôn, choáng và viêm phúc mạc

- Nhiễm khuẩn mô sâu làm mủ - Nhiễm khuẩn da và mô mềm

- Vi khuẩn huyết gồm có vi khuẩn huyết nhất thời và nhiễm trùng huyết

C tetani

Là loài kỵ khí bắt buộc, bị chết ngay khi tiếp xúc với không khí Thường được tìm thấy trong đất, trong phân các loài động vật và người Là loài gây bệnh uốn ván rất nguy hiểm

Sự sản sinh vi khuẩn và độc tố chỉ diễn ra nơi các vết thương có các quá trình oxy hóa khử ở mức thấp, chẳn hạn như những vết thương có chứa các mô tế bào đã

mất sức sống, các dị vật hoặc nhiễm trùng đang hoạt động C tetani bản thân nó

không gây ra viêm Tuy nhiên, các bào tử của nó có thể tồn tại hàng năm trong một số môi trường với đủ loại thuốc khử trùng và không bị diệt khi đun sôi 20 phút

2.3.4 Pseudomonas aeruginosa

P aeruginosa trước đây là Bacterium aeruginosa do Schroeter mô tả vào năm 1872, đến năm 1900 Migula chuyển chúng sang giống Pseudomonas, từ đó vi khuẩn mang tên Pseudomonas aeruginosa (Psedes: tiếng Hy Lạp: giả; monas: tiếng Hy Lạp: đơn vị; aeruginosa: gỉ đồng) thường được gọi là trực khuẩn mủ xanh [43]

 Sự phân bố

P aeruginosa phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, trên bề mặt động

thực vật, đặc biệt là những nơi môi trường ẩm ướt chúng sinh sôi và phát triển rất mạnh Trong tự nhiên người ta tìm thấy chúng trên bề mặt nhiều loại rau quả, trên cơ thể và phân một số động vật

Trong cơ thể người, P aeruginosa hiện diện thường xuyên trong đường tiêu

hóa và một số nơi ẩm ướt trong cơ thể như da, niêm mạc, vùng dưới cánh tay, … Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh trưởng trong các môi trường hạn chế sự có mặt của các vi sinh vật khác như chất khử trùng, thuốc mỡ, xà phòng, nước cất, …

 Hình thái

P aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí Gram âm, hình dạng thẳng hoặc hơi

cong nhưng không xoắn, 2 đầu tròn, kích thước 0,5-1 µm x 1,5-5 µm Có một lông duy nhất ở 1 cực, các pili của chúng dài khoảng 6 nm, là nơi tiếp nhận nhiều loại

phage và giúp vi khuẩn gắn vào bề mặt của tế bào vật chủ P aeruginosa là loài

không sinh bào tử

 Đặc điểm nuôi cấy

Vi khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, điều kiện hiếu khí tuyệt đối Nhiệt độ phát triển tối ưu là 370C, phát triển được ở nhiệt độ 50C-420C, pH thích hợp là 7,2-7,5 (có thể chịu được pH từ 4,5-9)

Trên môi trường đặc thường có 2 loại khuẩn lạc: một loại to, dẹt, nhẵn, trung tâm hơi lồi; một loại nhỏ, xù xì, lồi

 Sắc tố

Tính chất đặc trưng của loại vi khuẩn này là sinh sắc tố và chất thơm Có 2 loại sắc tố chính: pyocyanin có màu xanh lam tan trong nước và chlorofoc làm cho môi trường nuôi cấy và khuẩn lạc có màu xanh, pyoverdin là sắc tố phát huỳnh quang tan trong nước nhưng không tan trong chlorofoc Chất thơm do trực khuẩn sinh ra là Kimetylamin [18]

Có khoảng 10% P aeruginosa không sinh sắc tố Trong những trường hợp

này chẩn đoán vi khuẩn học gặp nhiều khó khăn Người ta phải dùng các môi trường tăng sinh sắc tố: môi trường King A (tăng sinh pyocianin) và môi trường King B (tăng sinh pyoverdins)

 Đặc điểm sinh hóa

P aeruginosa có đủ các cytochrom (b, c, a và oxidase) trong hệ thống vận

chuyển điện tử Trong thực hành người ta thường dùng “oxidase test” để tìm sự có mặt của cytochrom oxidase

Các tính chất sinh hóa thường sử dụng trong lâm sàng gồm: urease (-), indol (-), H2S (-); citrat Simmon, agrinin dihydrolase và gelatinase (+); khử NO3- thành N2 Trên môi trường OF (Oxidation-Fermentation) nhiều loại carbohydrat bị thoái hóa theo lối oxy hóa có sinh acid: glucose, mannitol, glycerol, ethalnol, arabinose, fructose và galactose

 Khả năng đề kháng

Chết nhanh chóng ở 1000C; trong môi trường ẩm, thoáng và không có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, chúng sống được hàng tuần; trong môi trường có dinh dưỡng tối thiểu; 50C, chúng sống được hơn 6 tháng

 Kháng nguyên

Kháng nguyên O chịu nhiệt, bản chất hóa học là lipopolysaccharid (LPS),

dựa vào kháng nguyên này người ta chia P aeruginosa thành 12 nhóm

Kháng nguyên H không chịu nhiệt, là kháng nguyên lông Vì khó khăn trong việc điều chế, nên việc định týp huyết thanh dựa trên kháng nguyên này chưa được áp dụng rộng rãi

 Khả năng gây bệnh

P aeruginosa là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện như khi cơ thể bị suy

giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mạn tính, khi dùng corticoid lâu dài, việc sử dụng kháng sinh tùy tiện, việc sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc các vết bỏng, vết thương hở,… Chúng có thể gây ra nhiêu bệnh khác nhau: gây viêm màng trong tim, viêm đường hô hấp, viêm phổi, nhiễm trùng đường máu, đường tiết niệu, viêm màng não mủ và áp xe não, viêm tủy xương, viêm tai, gây bệnh hóa sừng ở mắt, gây nhiễm trùng da, mô mềm, … [15]

P aeruginosa xâm nhiễm vào trong mắt thường gây ra những tổn thương

giác mạc, sự nhiễm này thường liên quan đến việc sử dụng kính sát tròng [23] Ở Việt Nam, theo kết quả nghiên cứu tại Viện Mắt trong vòng khoảng 20 nǎm trở lại

đây, P aeruginosa đã vượt lên với trên 70% các trường hợp xét nghiệm vi khuẩn

dương tính trong viêm loét giác mạc do vi khuẩn Hiện nay, vi khuẩn này là nguyên nhân hàng đầu gây viêm loét giác mạc sau chấn thương nông nghiệp[15]

Các bệnh nhân nằm viện bị mắc các chứng bệnh về tim mạch, tiểu đường hay bị các u ác tính bị sốc do nhiễm trùng máu thường có tỉ lệ tử vong khá cao Tác

nhân thường gặp là P aeruginosa chiếm từ 5% đến 50% so với các tác nhân vi

khuẩn khác

P aeruginosa dẫn đầu trong các tác nhân nhiễm trùng hô hấp bệnh viện, đặc

biệt đối với những bệnh nhân có hỗ trợ các máy thông khí, khả năng bị viêm phổi cao gấp 20 lần và tỉ lệ tử vong cao

Một số nghiên cứu còn cho thấy P aeruginosa giữ vai trò gây bệnh trong

giai đoạn đầu và cuối của bệnh đái tháo đường [23]

Loài này còn là vi khuẩn kháng thuốc phổ biến đối với nhiều loại kháng sinh Tính kháng thuốc thường được quy định bởi các plasmid và các yếu tố di truyền này có thể được lan truyền trong quần thể thông qua hiện tượng biến nạp và tải nạp tạo ra những dạng đột biến kháng thuốc mới P aeruginosa hiện kháng với rất nhiều

loại kháng sinh nên việc làm kháng sinh đồ trước khi điều trị là cần thiết [15]

2.4 Kháng sinh và tính kháng thuốc của vi khuẩn 2.4.1 Thuốc kháng sinh

2.4.1.1 Định nghĩa

Kỷ nguyên hiện đại của hóa trị liệu kháng khuẩn được bắt đầu từ việc tìm ra sulfonamid (Domagk, 1936) “Thời kỳ vàng son” của kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuất penicillin để dùng trong lâm sàng (1941) Khi đó, “kháng sinh được xem là những chất do vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn khác”[3][4]

Về sau, với sự phát triển của khoa học, người ta đã có thể:

Tổng hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (cloramphenicol) Tổng hợp nhân tạo các chất có tính kháng sinh: sulfamid, quinolon

Chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được tế bào ung thư (actinomycin) Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được thay đổi: “Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp, với nồng độ rất thấp, có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc diệt được vi khuẩn”

2.4.1.2 Phân loại

Một số thuốc kháng sinh có cấu trúc hóa học giống nhau, do đó chúng có chung cơ chế tác động và hoạt phổ tương tự nhau Dựa trên cấu trúc hóa học, người ta có thể xếp kháng sinh theo các nhóm như sau:

Nhóm -lactam: penicillin, ampicillin, cephalosporin, … Nhóm tetracyclines: tetracyclin, oxytetracyclin, … Nhóm phenicol: chloramphenicol, thamphenicol, …

Nhóm aminoglycosides: gentamycin, kanamycin, amikacin , … Nhóm macrolides: tylosin, spiramycin, …

Nhóm kháng sinh gần gũi với macrolides: lycomycin, virginiamycin, … Nhóm polypeptid: colistin, bacitracin, polymycin,…

Nhóm sulfamides: sulfamethoxazol, sulfadimidin, … Nhóm quinolones: oxfloxacin, ciprofloxacin, …

Ngoài ra còn có một số nhóm khác như glycopeptid, nitrofuran, …

Bên cạnh việc phân loại theo cấu trúc hóa học, ta cũng có thể phân loại kháng sinh theo tác động kháng khuẩn:

Nhóm kháng sinh kiềm khuẩn: tetracylin, macrolid, phenicol, sulfamid, … Nhóm kháng sinh diệt khuẩn: -lactam, amynosid, quynolones, polypeptid,…

2.4.1.3 Cơ chế tác động

Ức chế tổng hợp vách tế bào: gồm các kháng sinh: penicillin,

cephalosporins, bacitracin, vancomycin, …

Khác với tế bào động vật, vi khuẩn có một lớp vỏ cứng bên ngoài gọi là vách tế bào, có nhiệm vụ giữ hình dạng tế bào được nguyên vẹn trước áp lực thẩm thấu cao ở bên trong tế bào Khi sự tổng hợp vách tế bào bị ức chế do tác dụng của thuốc kháng sinh, các vi khuẩn Gram dương biến thành dạng hình cầu không có vách và vi khuẩn Gram âm có vách không hoàn chỉnh Những hình thức này làm cho tế bào bị vỡ trong điều kiện có trương lực bình thường

Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào: gồm nhóm thuốc chống nấm: colistin,

imidazol, polymycin, nistatin, amphotericin B, …

Tế bào chất của tất cả tế bào sống đều được bao bọc bởi một màng tế bào chất Màng này được xem như một hàng rào có khả năng thẩm thấu chọn lọc, thực hiện chức năng vận chuyển chủ động và như vậy kiểm soát các thành phần ở bên

trong tế bào Nếu sự toàn vẹn chức năng của màng tế bào chất bị phá vỡ thì những đại phân tử và những ion sẽ thoát ra khỏi tế bào làm tế bào chết

Ức chế tổng hợp protein: gồm các họ chloramphenicol, tetracyclines,

lincomycins, …

Vi khuẩn có ribosom 70 S, gồm 2 đơn vị là 30 S và 50 S Kháng sinh có thể gắn lên các đơn vị này để ngăn cản sự tạo thành polysom trong dịch mã

Ức chế tổng hợp acid nucleic: Kháng sinh tác động vào quá trình sao chép

DNA (nhóm quinolones), ức chế sao mã RNA (nhóm rifampicin) và ức chế tổng hợp các nucleotid (nhóm sulfamid và trimethoprim)

2.4.2 Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

Trong cuộc cạnh tranh giữa sự phát triển kháng sinh mới với sự đề kháng mới của vi sinh vật, thì cho đến nay vi sinh vật vẫn chiếm ưu thế Quá trình này được thúc đẩy mạnh, nếu thiếu sự hiểu biết và sử dụng thuốc sai trong điều trị

Có hai dạng đề kháng: đề kháng giả và đề kháng thật

2.4.2.1 Đề kháng giả

Khi hệ thống miễn dịch của cơ thể suy giảm (do dùng corticoid, tia xạ, …) hoặc chức năng của đại thực bào bị hạn chế (ví dụ ở ổ mủ), thì cơ thể không đủ khả năng loại trừ được những vi khuẩn đã bị kháng sinh ức chế ra khỏi cơ thể

Khi vi khuẩn tự đề kháng: Ở trạng thái nghỉ (không nhân lên, không chuyển hóa do thiếu oxy, pH thay đổi …), vi khuẩn không chịu tác dụng của kháng sinh

Khi có vật cản, tuần hoàn ứ trệ, kháng sinh không thấm tới ổ viêm thì vi khuẩn cũng tỏ ra đề kháng

2.4.2.2 Đề kháng thật

 Đề kháng tự nhiên: Một số loại vi khuẩn luôn luôn không chịu tác dụng của

một số kháng sinh Ví dụ P aeruginosa kháng với penicillin G, tụ cầu không chịu

tác dụng của colistin

Một số vi sinh vật không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng của các kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp vách như penicillin, cephalosporin, vancomycin

 Đề kháng thu được: Do biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ không có trở thành có gen đề kháng

Đột biến gen: Biến cố này có thể xảy ra trước hoặc sau khi tiếp xúc với kháng sinh

− Đột biến một bước: Mức độ đề kháng không phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh được tiếp xúc; có thể chỉ sau một lần đột biến, vi khuẩn đã đề kháng rất cao

− Đột biến nhiều bước: Mức độ đề kháng có liên quan đến mức độ kháng sinh Trong trường hợp này, kháng sinh là nhân tố chọn lọc giữ lại những cá thể đột biến, cho nên ở lần đột biến sau thì nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) sẽ cao hơn lần trước

Gen đề kháng sau khi xuất hiện sẽ lan truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn

Nhận gen đề kháng: Gen đề kháng có thể lan truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua các hình thức vận chuyển chất liệu di truyền như sau:

− Tiếp hợp: Hai vi khuẩn tiếp xúc nhau và truyền cho nhau gen đề kháng

− Biến nạp: Khi vi khuẩn đề kháng bị ly giải, giải phóng các đoạn DNA tự do và những đoạn này xâm nhập vào tế bào vi khuẩn khác

− Tải nạp: Phage mang gen đề kháng từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Đề tài được thực hiện từ tháng 03 năm 2007 đến tháng 07 năm 2007 tại Phòng vi sinh thực phẩm – Khoa LAM – Viện Pasteur Tp HCM

3.2 Vật liệu

Nhóm 1: nước uống đóng chai

Nhóm này gồm 2 loại: nước uống tinh khiết và nước khoáng thiên nhiên Nhóm 2: nước uống xử lý: nước uống được xử lý không theo quy trình công nghiệp khép kín, nước nguồn có thể là nước giếng hoặc nước máy được lọc bằng các máy lọc nước thông thường hoặc bằng cách đun sôi

Nhóm này gồm các loại: nước uống trường học, nước uống gia đình, nước uống công ty được khách hàng mang đến viện Pasteur phân tích Ngoài ra, được xếp vào nhóm này còn có các mẫu nước được chúng tôi lấy từ các bình lọc nước uống trong các bệnh viện trong thành phố

3.3 Thiết bị, hóa chất và môi trường 3.3.1 Thiết bị và dụng cụ

Tủ sấy để khử trùng khô và một nồi hấp áp lực

Tủ ấm hoặc nồi cách thủy kiểm tra được nhiệt độ 350C ± 0,50C hoặc ở 370C ± 0,50C

Tủ ấm hoặc nồi cách thủy kiểm tra được nhiệt độ 440C ± 0,250C hoặc ở 44,50C ± 0,250

C Bình ủ kỵ khí pH mét, nhiệt kế Dụng cụ lọc màng Đèn UV

Kẹp để giữ màng lọc, găng tay

Màng lọc thông thường có đường kính 47mm hoặc 50mm, có đặc tính lọc tương đương với lỗ có đường kính định danh là 0,45µm, nếu chưa được khử trùng thì phải khử trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất Phiến kính và lá kính

Pipette Pasteur, pipette 2ml, 5ml Đĩa petri

3.3.2 Hóa chất

Cồn

Nước cất, nước nuối sinh l ý

Thuốc thử oxidase, Kovac’s, Nessler, oxy già (H2O2)

Thạch sunphit triptoza

Thạch Pseudomonas / thạch CN

Môi trường King’s B Thạch dinh dưỡng Canh thang acetamide Thạch Mueller-Hinton

Hình 3.1: Thiết bị lọc vi sinh vật với 3 vị trí đặt màng

Hình 3.2: Thiết bị hỗ trợ việc đếm khuẩn lạc và đọc kết quả kháng sinh

Hình 3.3: Bình ủ kỵ khí

3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp lấy mẫu

Áp dụng theo TCVN 5992-1995 (ISO 5669-2:1991) [11]  Nguồn gốc mẫu thí nghiệm:

Nước uống đóng chai: nước tinh khiết và nước khoáng thiên nhiên Nước uống xử lý: nước uống công ty, nước uống trường học, nước uống bệnh viện, nước uống gia đình

 Quá trình lấy mẫu:

Sát trùng bên ngoài vòi nước, mở vòi cho nước chảy một lúc rồi hứng vào các chai đựng Dụng cụ chứa nước là các chai thủy tinh có thể tích 1,25 ml được vô trùng trước khi lấy mẫu

Lấy mẫu xong phải đậy kín bình chứa rồi nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm và lọc ngay trong ngày Nếu để sang ngày hôm sau phải được trữ trong tủ mát ở nhiệt độ 40C

3.4.2 Xử lý số liệu

Từ các kết quả phân lập vi khuẩn của nước uống đóng chai và nước uống xử lý, chúng tôi xử lý số liệu theo thống kê mô tả Tiếp theo các kết quả về tỉ lệ phần trăm khác biệt được phân tích về mặt ý nghĩa thống kê với P < 0,05 bằng phép kiểm

2 test

Tính đề kháng kháng sinh của P aeruginosa cũng được phân tích sự khác

biệt về mặt ý nghĩa thống kê theo nhóm (nước uống đóng chai hoặc nước uống xử

lý) Trong trường hợp mẫu nhỏ, phép kiểm sẽ được xử lý hiệu chỉnh Yates

+ Biện giải kết quả:

Nếu một mẫu bị vi phạm bất cứ chỉ tiêu nào trong các chỉ tiêu trên thì đều không đạt tiêu chuẩn vi sinh

3.4.4 Phương pháp thử nghiệm vi sinh vật

3.4.4.1 Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform fecal và Escherichia coli giả định

Áp dụng theo TCVN 6187-1:1996; ISO 7899-2:1990(E) [12]  Nguyên tắc

Lọc một lượng mẫu thử qua màng lọc để giữ lại các vi khuẩn, đặt màng lọc trên môi trường nuôi cấy thạch lactoza chọn lọc hoặc một miếng đệm hấp thụ bão hòa bằng môi trường lỏng chọn lọc chứa lactoza

Nuôi cấy màng lọc trong 24 giờ ở nhiệt độ 350C hoặc 370C để phát hiện vi

khuẩn Coliform, hoặc ở 440C để phát hiện Coliform fecal

Đếm trực tiếp các khuẩn lạc đặc trưng được hình thành trên màng; cấy chuyển các khuẩn lạc đặc trưng để thử nghiệm xác định khả năng sinh khí và sinh

indol Tính toán số vi khuẩn Coliform, Coliform fecal và E coli giả định có trong

Thuốc thử Kovac’s để thử indol

Thuốc thử oxidase dùng cho phép thử oxidase

 Cách tiến hành

Lọc thể tích nhất định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch

Sơ đồ 3.1: Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform fecal và E coli giả định

- Nước pepton lactoza (sinh gas) - Thạch dinh dưỡng(thử oxidase) - Nước trypton (sinh indol)

Ủ 370C/ 48 giờ

Ủ 440C/ 24 giờ - Pepton lactoza sinh gas (+) - Thử oxidase (-)

3.4.4.2 Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân (Streptococcus fecalis)

Áp dụng theo TCVN 6189-2:1996; ISO 7899-2:1984(E) [13]  Nguyên tắc

Đếm liên cầu phân dựa trên việc lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua một màng lọc có kích thước lỗ (0,45 µm) thích hợp để giữ lại các vi khuẩn

Màng lọc được đặt vào môi trường đặc chọn lọc chứa natri nitrua (để ngăn sự sinh trưởng của các vi khuẩn Gram âm) và 2,3,5- triphenyltetrazoli chlorua liên cầu phân sẽ khử thuốc nhuộm không màu thành focmazan màu đỏ Sau khi nuôi cấy, tất cả khuẩn lạc đã mọc sẽ cho màu đỏ, màu hạt dẻ hoặc màu hồng toàn bộ khuẩn lạc hoặc từ trung tâm, toàn bộ các khuẩn lạc được đếm là liên cầu phân giả định

Môi trường khẳng định, thạch mật asculin-nitrua, được nuôi trong 48 giờ ở nhiệt độ 440C Liên cầu phân phát triển trong môi trường này và thủy phân asculin, sản phẩm cuối cùng, 6,7-dihydroxycourmarin sẽ kết hợp với ion Fe3+

cho hợp chất màu nâu vàng tới đen và khuếch tán vào môi trường

Ngoài ra, tiến hành một phép thử catalase đối với các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường khẳng định Những khuẩn lạc cho phản ứng asculin dương tính và catalase âm tính thì có thể xem là liên cầu phân

 Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập:

Môi trường m-enterococcus (Slanetz và Bartley) Môi trường khẳng định:

Thạch mật asculin-nitrua Thuốc thử catalase:

Hydropeoxit dung dịch 30g/l