* Sắc ký lớp mỏng: giải ly bằng hệ dung mơi cloroform:ete dầu 9:1, thuốc thử hiện hình là acid sulfuric 10%/EtOH, sấy bản ở 1100C cho một vết duy nhất màu nâu cĩ giá trị Rf = 0,23.
*Nhiệt độ nĩng chảy 154-1560C (MeOH).
* Phổ khối lƣợng MS (Phụ lục số 1)
m/z: 414 (M+); 329; 255; 213; 161; 145; 105; 81; 69. * Phổ hồng ngoại IR (phụ lục số 2)
ν, cm-1:3452,45 (dao động O–H); 2906,52; 2783,90 (Dao động C–H bão hịa);1662,98 (dao động C = C); 12,82,94 (dao động C – O).
* Phổ 1H-NMR, CDCl3, δ, ppm (phụ lục số 3)
5,35 (d, 5Hz, – CH =); 5,14 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz; – CH =); 5,03 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz; – CH=); 3,52 (t, >CH – O –); 0,68 – 1,02 H của 6 nhĩm –CH3.
* Phổ 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT, CDCl3, δ, ppm (phụ lục số 4) 140,77 (>C =); 138,32 (– CH =);129,31 (– CH =); 121,73 (– CH =); 71,83 (CH – O –)
Biện luận cấu trúc S:
S cho phản ứng dương tính với các thuốc thử đặc trưng của triterpen và steroid như Liebermann Burchard, Salkowski và Noller.
Từ các tín hiệu trên phổ IR (3452,45cm-1); 1H-NMR (3,52ppm); 13C-NMR (71,83 ppm) chứng tỏ S cĩ nhĩm – OH.
Phổ 13
C-NMR và 1H-NMR cho thấy S cĩ hai nối đơi, trong đĩ 1 liên kết kiểu >C=CH và liên kết cịn lại kiểu – CH = CH – . Phổ 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT cho biết S cĩ 3 carbon bậc bốn (>C<), 11 carbon bậc 3 (>CH –), 9 carbon bậc hai (– CH2 –) và 6 carbon bậc 1 (– CH3), từ đĩ cơng thức phân tử của S là C29H48O, điều này được khẳng định lại dựa trên phổ khối lượng (M+= 414).
Độ bất bão hồ của S là 6, như vậy cấu trúc S cĩ 4 vịng. Kết hợp với số nguyên tử carbon giúp ta khẳng định S là một hợp chất steroid.
Phổ 1H-NMR cho biết nối đơi – CH = CH – tồn tại dưới dạng trans (dựa vào các mũi cộng hưởng δ 5,13(dd, 8,5Hz; 14,5Hz) và δ 5,03 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz).
Các nhận định ban đầu cho thấy S cĩ thể là stigmasterol, khảo sát kỹ cường độ các mũi cộng hưởng tại các vị trí δ 5,35; δ 5,13 đến 5,03 và δ 3,52 cho thấy các giá trị tích phân gần bằng nhau, kết hợp với phổ 13C- NMR (xuất hiện 42 tín hiệu cộng
hưởng) chúng tơi dự đốn S là hỗn hợp của stigmaterol và β-sitosterol với tỉ lệ 1:1, điều này dựa vào phổ 1H NMR của các vị trí 5,35; 5,13; 5,03.
Các số liệu phổ 13C-NMR và DEPT của S được so sánh với các phổ tương ứng của stigmasterol và β-sitosterol. Kết quả so sánh phổ 13
C-NMR của hợp chất S với stigmasterol và β-sitosterol (phụ lục 5) cho thấy sự trùng khớp ở các vị trí của cả hai hợp chất. Như vậy S là hỗn hợp của stigmasterol và β-sitosterol.
β-Sitosterol Stigmasterol Hình 4.2: Cấu trúc hĩa học của β-Sitosterol và Stigmasterol 4.4. Thử nghiệm vi sinh
Hai ống nghiệm thử dung mơi vi khuẩn mọc làm đục mơi trường, cĩ tạo váng màu trắng trên bề mặt và cĩ cặn trắng bên dưới ống nghiệm. Kết luận dung mơi DMSO khơng ức chế sự phát triển của hai chủng vi khuẩn E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium ở tỉ lệ 0,06 ml/ 2 ml mơi trường
Đối với các loại cao ete dầu hỏa, cao n-butanol và cao nước các ống nghiệm thử nghiệm ở các nồng độ từ 100 đến 600μg/ml vi khuẩn làm đục mơi trường cĩ lắng cặn trắng ở dưới đáy.
Kết luận: Cao ete dầu hỏa, cao n-butanol và cao nước khơng cĩ khả năng ức chế hai chủng vi khuẩn E. coli và Salmonella tới nồng độ 600 μg/ml
Đối với cao chloroform, với các nồng độ 400 – 600 μg/ml quan sát thấy mơi trường khơng bị đục. HO CH3 C2H5 H CH3 H3C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28, 29 H5C2 CH3 CH3 CH3 CH3 H3C HO H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28,29
Bảng 4.4: Kết quả thử nghiệm các loại cao trong khoảng nồng độ 100-600 μg/ml
Loại cao
Ete dầu hỏa CHCl3 n-butanol H2O Nồng dộ (μg/ml)
E.coli Sal E.coli Sal E.coli Sal E.coli Sal
100 + + + + + + + + 200 + + + + + + + + 300 + + + + + + + + 400 + + – – + + + + 500 + + – – + + + + 600 + + – – + + + +
Ghi chú: +:Mơi trường bị đục
–: Mơi trường khơng bị đục.
Tiến hành thử nghiệm tiếp tục ở các nồng độ với khoảng cách nhỏ hơn trong khoảng từ 300 – 400 μg/ml.
Hình 4.3: Các ống nghiệm nồng độ trong khoảng 300 - 400 μg/ml trước khi đem ủ.
Sau khi ủ, ở nồng độ 330 μg/ml E. coli khơng làm đục mơi trường nuơi cấy. Cịn đối với Salmnella thì khơng làm đục mơi trường ở nồng độ 340 μg/ml.
Bảng 4.5: Kết quả thử nghiệm cao chloroform trong khoảng nồng độ 300-400 μg/ml Nồng độ (μg/ml) E. coli Salmonella 310 + + 320 + + 330 – + 340 – – 350 – – 360 – – 370 – – 380 – – 390 – –
Ghi chú: +: Mơi trường nuơi cấy bị đục –: Mơi trường nuơi cấy khơng bị đục
Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm trên E. coli.
Hình 4.5: Kết quả thử nghiệm trên Salmonella.. Bảng 4.6: Kết luận Vi khuẩn MIC (μg/ml) E. coli ATCC 25922 330 Salmonella typhimurium 340 310 320 330 340 350 360 370 380 390 (μg/ml). 310 320 330 340 350 360 370 380 390 (μg/ml)
Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
I. Kết luận
5.1. Khảo sát thành phần hĩa học
Đã sơ bộ phân tích thành phần hĩa học các hợp chất cĩ trong lá Xuân Hoa. Đã xác định được sự hiện diện của các cấu tử hữu cơ: flavonoid, tanin, terpenoid, saponin...
Từ 500g bột lá khơ cây Xuân Hoa đã điều chế được cao ete dầu hỏa là 5,6g (hiệu suất 1,12%), cao chloroform 9,8g (hiệu suất 1,98%), cao n-butanol 15,2g (hiệu suất 3,04%) và cao nước 25,7g (hiệu suất 5,14%).
Từ cao ete dầu hỏa đã tiến hành phân lập và thu được 64 mg hợp chất S (hiệu suất 2,13 % tính trên trọng lượng cao ete dầu hỏa).
Cấu trúc của hợp chất được xác định dựa trên các phương pháp phổ nghiệm như khối phổ, phổ hồng ngoại, phổ 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT. Hợp chấy S được nhận danh là hỗn hợp của Stigmasterol và β-sitosterol tỉ lệ 1 : 1.
5.2. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn
Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn trên hai đối tượng vi sinh là E. coli
ATCC 25922 và Salmonella typhimurium với 4 loại cao: ete dầu hỏa, chloroform, n- butanol và cao nước.
Kết quả cho thấy chỉ cĩ cao chloroform cĩ khả năng ức chế sự phát triển của hai chủng vi sinh vật trên.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chloroform đối với hai chủng vi sinh vật lần lượt: E. coli ATCC 25922 là 330 μg/ml và Salmonella typhimurium là 340μg/ml.
II. Đề nghị
Trong khoảng thời gian ngắn làm khĩa luận tốt nghiệp những kết quả thu được chỉ là những kết quả bước đầu. Nếu cĩ thời gian, xin đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để cĩ thể tìm hiểu thêm về tác dụng sinh học và thành phần hĩa học của cây Xuân Hoa. Đặt biệt là phân lập, xác định cấu trúc hĩa học các hợp chất hữu cơ trên cao chloroform và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên một số dịng vi khuẩn đường ruột khác. Từ đĩ làm cơ sở cho việc chuẩn hĩa và tạo ra chế phẩm cĩ khả năng thay thế kháng sinh trong điều trị các bệnh nhiểm khuẩn đường tiêu hĩa.
Phụ lục 5: So sánh phổ 13
C-NMR của S với -Sitosterol và Stigmasterol
STT Hợp chất S -Sitosterol Stigmasterol
13C-NMR DEPT carbon Vị trí 13C-NMR Loại carbon car bon Vị trí 13C-NMR Loại carbon
1 140,77 Biến mất 5 140,10 >C= 5’ 140,67 >C=
2 138,32 Mũi dương - - - 22’ 138,25 -CH=
3 129,31 Mũi dương - - - 23’ 129,19 -
4 121,73 Mũi dương 6 121,60 =CH- 6’ 121,62 -CH=
5 71,83 Mũi dương 3 71,00 -CH-OH 3’ 71,72 -CH-OH
6 56,89 Mũi dương - - - 14’ 56,83 >CH- 7 56,79 Mũi dương 14 56,70 >CH- - - - 8 56,09 Mũi dương 17 55,80 >CH- - - - 9 255,99 Mũi dương - - - 17’ 55,91 >CH- 10 51,25 Mũi dương - - - 24’ 51,21 >CH- 11 50,17 Mũi dương 9 50,10 >CH- 9’ 50,12 >CH- 12 45,87 Mũi dương 24 45,60 >CH- - - - 13 42,31 Mũi âm 4 42,10 -CH2- 12’ 42,25 -CH2- 14 42,24 Biến mất 13 42,10 >C< 13’ 42,18 >C< 15 40,49 Mũi dương - - - 20’ 40,45 >CH- 16 39,71 Mũi âm 12 39,60 -CH2- 4’ 39,66 -CH2- 17 37,28 Mũi âm 1 37,10 -CH2- 1’ 37,24 -CH2- 18 36,53 Biến mất 10 36,40 >C< 10’ 36,40 >C< 19 36,16 Mũi dương 20 36,00 >CH- - - - 20 33,98 Mũi âm 22 33,80 -CH2- - - - 21 31,93 Mũi dương 8 31,80 >CH- 8’ 31,87 >CH- 22 31,89 Mũi dương - - - 25’ 31,87 >CH- 23 31,67 Mũi âm 7 31,80 -CH2- - - - 24 31,58 Mũi âm 2 31,50 -CH2- 7’ 31,61 -CH2- 25 29,67 Mũi dương 25 29,00 >CH- - - - 26 28,92 Mũi âm - - - 2’ 28,92 -CH2- 27 28,25 Mũi âm 16 28,20 -CH2- 16’ 28,20 -CH2- 28 26,13 Mũi âm 23 26,00 -CH2- - - - 29 25,41 Mũi âm - - - 28’ 25,40 -CH2- 30 24,38 Mũi âm 15 24,10 -CH2- 15’ 24,35 -CH2- 31 23,10 Mũi âm 28 23,00 -CH2- - - - 32 21,23 Mũi dương - - - 26’ 21,22 -CH3 33 21,09 Mũi âm 11 21,10 -CH2- 11’ 21,06 -CH2- 34 21,09 Mũi dương - - - 21’ 21,09 -CH3 35 19,82 Mũi dương 26 19,70 -CH3 - - - 36 19,40 Mũi dương 19 19,30 -CH3 18’ 19,39 -CH3 37 19,00 Mũi dương 27 19,00 -CH3 27’ 18,98 -CH3 38 18,79 Mũi dương 21 18,60 -CH3 - - - 39 12,25 Mũi dương - - - 29’ 12,26 -CH3 40 12,06 Mũi dương - - - 19’ 12,04 -CH3 41 11,99 Mũi dương 29 11,90 -CH3 - - - 42 11,87 Mũi dương 18 11,80 -CH3 - - -
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Phần tài liệu tiếng Việt:
1. Võ Hồi Bắc và Lê Thị Lan Oanh, 2003. Hàm lượng acid amin và nguyên tố khống trong lá cây Xuân Hoa. Tạp chí dược liệu tập 8, số 1: tr.11 - 15.
2. Võ Văn Chi,1997. Từ điển cây thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học.
3. Lê Huy Chính và cộng sự, 2003. Vi sinh y học. Nhà xuất bản Y Học.
4. Huỳnh Kim Diệu và Trần Văn Hịa, 2003. Efficacy of Pseuderanthemum
palatiferum Powder against Diarrhea of Piglets.
5. Huỳnh Kim Diệu, 2004. Investigating the toxicity and the antibacterial activity of
Pseuderanthemum palatiferum Powder.
6. Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985. Phương pháp nghiên cứu hĩa học cây
thuốc. Nhà xuất bản Y học.
7. Phạm Hồng Hộ, 1993. Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản Montreal.
8. Trần Cơng Khánh,1999. Cây Xuân Hoa, từ điển bách khoa dược học. NXB Từ Điển Bách Khoa Hà Nội, tr 714.
9. Trần Cơng Khánh, Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Thị Thanh Nhài và Lê Mai Hương, 1998. Gĩp phần nghiên cứu về thực vât, thành phần hĩa học và tác dụng sinh học của cây Xuân Hoa. Tạp chí Dược liệu, tập 3, tr 37- 41.
10.Trần Cơng Khánh, 1997. Sự thật về cây thuốc "kỳ diệu", cây Xuân Hoa.Tạp chí
thuốc và sức khỏe, số 101, tr 10 - 11.
11.Đỗ Tất Lợi, 1995. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội.
12.Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Hiền và Nguyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm vi
sinh vật học, tr 130 - 160. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.
13.Nguyễn Thị Thanh Nhài, 1997. Gĩp phần nghiên cứu về thực vật, thành phần hĩa
học và tác dụng sinh học của cây Xuân Hoa. Luận văn tốt nghiệp dược sĩ đại học,
14.Lê Thị Lan Oanh và cộng sự, 1998. Một số chỉ tiêu sinh hĩa của cây Xuân Hoa.
Tuyển tập báo cáo hội nghị hĩa học tồn quốc lần 3, tập 1, 1998, tr 96-99.
15.Lê Thị Lan Oanh và cộng sự, 1999. Khảo sát một số chỉ tiêu sinh hĩa và tác dụng thủy phân prơtêin của lá cây Xuân Hoa. Tạp chí dược liệu, tập 4, số 1, 1999, tr 13- 17.
16.Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, 2001. Bài giảng chiết suất dược liệu. Trường Đại học Y Dược Tp.HCM.
17.Nguyễn Thị Minh Thu, 1999. Gĩp phần nghiên cứu về thực vật, thành phần hĩa học
và tác dụng sinh học của cây Xuân Hoa. Luận văn thạs sĩ Dược học, Đại học Dược
Hà Nội.
18.Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Cơng Khánh và cơng sự, 1999. Thử độc tính cấp diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của cây Xuân Hoa. Tạp chí Dược học, số 9, 1999, tr 15-17.
19.Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Cơng Khánh và Nguyễn Văn Hùng, 2000. Gĩp phần nghiên cứu thành phần hĩa học trong lá cây Xuân Hoa (thơng báo số 5). Tạp chí
Dược liệu, tập 5, số 6, tr 163-167.
20.Bộ Y Tế và Bộ GD & ĐT, 1998. Bài giảng dược liệu tập 2, Hà Nội.
21.Dược điển Việt Nam III, 2002. Nhà Xuất bản Y học Hà Nội.
22.Giáo trình phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2004. Đại học Y Dược TP.HCM.
23.Thực tập vi sinh và miễn dịch, 2003. Trường Đại Học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh.
Phần tài liệu tiếng nuớc ngồi:
25.Forgo P, Kover KE, Gradient enhanced selective experiments in the 1H NMR chemical shift assignment of the skeleton and side-chain resonances of stigmasterol, a phytosterol derivative, Department of Organic Chemistry, University of Szeged, Dom ter 8, H-6720, Szeged, Hungary. pforgo@chem.u-szeged.hu, Steroids. 2004 Jan;69(1):43-50.
26.PhD Ronald Mc. Atlas, 1994. Principles of Microbiology. Univesity of Louisville, Kentucky, tr 360 - 367.
Phần tài liệu từ internet:
27.http://www.e-chikusan.com/products/bio-add/bio-add.htm.
28.http://www.scielobr/scielo.php.
29.http://www.ecplanet.com.