2.4.3.1. Chuẩn đốn trực tiếp
Bệnh phẩm khác nhau tùy từng bệnh: - Phân với nhiễm khuẩn đường tiêu hố. - Nước tiểu với nhiễm khuẩn đường tiết niệu. - Máu nếu là nhiễm khuẩn máu…
Cĩ thể làm tiêu bản soi trực tiếp với một số loại bệnh phẩm như cặn ly tâm nước tiểu hoặc nước não tủy.
Phương pháp chủ yếu nhất là nuơi cấy phân lập. Bệnh phẩm được nhân lên trên mơi trường cĩ chất ức chế chọn lọc như DCL, Endo. Nước tiểu giữa dịng được tiến hành cấy đếm trên thạch thường. Máu được cấy vào canh thang.
Sau khi đã phân lập được vi khuẩn thuần nhất thì xác định tính chất sinh vật hĩa học và định loại bằng kháng huyết thanh mẫu.
Đối với viêm màng não, hiện nay người ta cịn tiến hành phương pháp chuẩn đốn nhanh và đặc hiệu bằng kỹ thuật ngưng kết lactex để xác định kháng nguyên trong dịch não tủy.
2.4.3.2. Chuẩn đốn gián tiếp
Trên thực tế chuẩn đốn gián tiếp khơng được sử dụng trong chuẩn đốn các nhiễm khuẩn do E. coli.
2.4.4. Phịng bệnh
Hiện nay chưa cĩ phương pháp phịng bệnh đặc hiệu. Để đề phịng nhiễm khuẩn đường tiêu hĩa do E. coli, thực hiện các biện pháp phịng bệnh chung khơng đặc hiệu giống như đối với các vi khuẩn đường ruột khác.
2.4.5. Chữa bệnh
E. coli thuộc vào các vi khuẩn cĩ tỷ lệ kháng thuốc cao, nhất là chủng phân lập
được từ nước tiểu, vì vậy cần làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích hợp.
Ngồi việc sử dụng kháng sinh, một số việc khác rất cĩ giá trị như bồi phụ nước, điện giải trong trường hợp tiêu chảy (việc này nhiều khi cĩ vai trị quyết định để cứu sống bệnh nhân), giải quyết những cản trở trên đường tiết niệu, rút ống thơng sớm nếu cĩ thể được…
Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu
3.1.1. Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1.1. Nguyên liệu 3.1.1.1. Nguyên liệu
Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum). Bộ phận dùng : lá.
Thu hái tại vườn thực vật ĐH Cần Thơ.
3.1.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện qua 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Tiến hành thí nghiệm phân tích thành phần hĩa học trong lá cây Xuân Hoa. Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 7/2004, tại Phịng Hĩa Lý- Trung Tâm Phân Tích ĐHNL và Phân Viện Hĩa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên.
Giai đoạn 2: Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao được điều chế từ lá Xuân Hoa. Thời gian thực hiện từ 4/8/2005 đến 26/8/2005. Thực hiện tại phịng Cơng Nghệ Sinh Học Mơi Trường, Khoa Cơng Nghệ Mơi Trường.
3.1.1.3. Hĩa chất cần thiết
Hĩa chất dùng cho phân tích thành phần hĩa học
- Ete dầu hỏa: chưng cất phân đọan < 900C.
- Etylacetat: chưng cất phân đoạn ở 64 - 65oC, làm khan bằng Na2SO4. - Chloroform: chưng cất phân đoạn ở 60 - 61oC, làm khan bằng Na2SO4. - Ethanol : chưng cất phân đoạn ở 78oC, làm khan bằng Na2SO4.
- Nước cất hai lần.
- Thuốc thử hiện hình: H2SO410 % / C2H5OH, đèn UV 254nm.
- Hạt silicagel dùng cho sắc ký cột: kích thước hạt 0,04 – 0,063 mm, dùng lượng silicagel gấp 30 lần lượng cao, hoạt hĩa ở 1100C trong 30 phút trước khi sử dụng.
- Bản mỏng silicagel loại 25 DC - alufolien 20 x 20 cm, kieselgel 60 F254 , Merck. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Mg kim loại. - Natri acetat.
- H2SO4 10%, H2SO4 1%, H2SO4 đđ, HCl đđ.
- Thuốc thử: Liebermann, Fehling, Mayer, Bouchardat, Bertrand, Bouchardat, Dragendorff...
Hĩa chất dùng cho thử nghiệm vi sinh
- H2SO4 1 %, BaCl2.2H2O.
- Dung mơi DMSO (dimethysulfoside). - Nước cất.
- Mơi trường lỏng BHI. - Agar.
- Cồn 960, cồn 700 .
3.1.1.4. Thiết bị và dụng cụ phịng thí nghiệm
Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm sử dụng cho thí nghiệm phân tích thành phần hĩa học lá Xuân Hoa
- Bộ soxhlet 6 chỗ (Đức).
- Bộ chưng cất dung mơi (Việt nam). - Máy cơ quay hiệu Buchi (Đức) - Tủ sấy (Memmert).
- Bếp hồng ngoại (Scott, Đức). - Bình lắng (Duran, Đức).
- Ống chạy sắc ký cột kích thước 5 x 100 cm và 2,5 x 40 cm. - Điểm nĩng chảy xác định trên máy BUCHI melting point - B545.
- Phổ hồng ngoại ghi trên máy quang phổ hồng ngoại BURKER - IFS48 - Carlo Erba - GC 6130.
- Phổ 1
H-NMR ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân AV - 500, tần số cộng hưởng 500 MHz tại Viện Hĩa học, Hà Nội.
- Phổ 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân AV - 500, tần số cộng hưởng 125 MHz tại Viện Hĩa học, Hà Nội.
Thiết bị và dụng cụ phịng thí nghiệm cần cho thử nghiệm vi sinh
- Autoclave (Tomy SS – 325). - Tủ ấm (Memmert).
- Cân điện tử (Sartorius). - Bếp điện (Airlux).
- Pipette loại 100 – 1000 μl. - Đầu tipe loại 1000 μl. - Ống nghiệm.
- Que cấy trang, que cấy vịng. - Đèn cồn...
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Xử lý nguyên liệu [19],[20]
Nguyên liệu sau khi thu hái rửa sạch, để khơ, sấy khơ đến trọng lượng khơng đổi sau đĩ xay thành bột.
3.2.2. Xác định độ ẩm
-Nguyên tắc : Mẫu được sấy ở 1050C nước sẽ bốc hơi và làm giảm khối lượng. Cân rồi suy ra độ ẩm.
-Tiến hành : sấy trong chén sứ đến khối lượng khơng đổi. Cân chính xác 10 g mẫu sấy ở 1050C trong 2 giờ, sau đĩ lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 15 phút, sau đĩ cân thu khối lượng cịn lại (a g) và tính độ ẩm mẫu theo cơng thức:.
Độ ẩm mẫu = (10 - a ) x 100 %
3.2.3. Xác định tro tồn phần (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tro tồn phần là lượng hợp chất vơ cơ cịn lại khi nung cháy hồn tồn mẫu nguyên liệu, các ion cịn lại ở dạng carbonat hay oxit.
- Tiến hành : Nung chén sứ đến khối lượng khơng đổi. Cân chính xác 10 g mẫu trải đều thành một lớp mỏng. Đặt vào lị nung ở nhiệt độ 6000C trong 3 giờ, lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 30 phút, cân khối lượng tro cịn lại (b g) và tính hàm lượng tro theo cơng thức:
3.3. Phân tích sơ bộ thành phần hĩa học thực vật[6],[16],[20],[22]
3.3.1. Nguyên tắc
Dựa vào độ hịa tan trong các dung mơi khác nhau của các hợp chất trong nguyên liệu mà phân tích, dùng các dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần: ether, ethanol và nước. Sau đĩ xác định các nhĩm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng.
3.3.2. Cách tiến hành
Chuẩn bị dịch chiết:
- Dịch chiết ether:
Chiết 25 g mẫu bằng diethyl ether trong bể siêu âm cho đến khi dịch ether nhạt màu. Gộp dịch chiết, lọc và cơ lại cịn khoảng 50 ml.
- Dịch chiết cồn:
Bã sau khi chiết bằng ether được chiết nĩng bằng cồn 960 trong bể siêu âm đến khi dịch gần khơng màu. Gộp dịch chiết, lọc và cơ lại cịn khoảng 50 ml.
- Dịch chiết nƣớc:
Bã sau khi chiết bằng cồn 960, đem chiết nĩng trong bể siêu âm 5 phút (3 lần) với thể tích nước vừa đủ ngập mẫu. Gộp dịch chiết, lọc và cơ lại cịn khoảng 50ml.
Xác định các nhĩm hợp chất:
Xác định các nhĩm hợp chất trong dịch ether:
Chất béo Anthraglycosid
Triterpenoid tự do Alkaloid
Flavonoid Coumarin
Tinh dầu Carotenoid
Acid hữu cơ
Xác định các nhĩm hợp chất trong dịch cồn:
Alkaloid Antraglycosid
Tanin Đường khử
Xác định các nhĩm hợp chất trong dịch nƣớc: Alkaloid Antraglycosid Saponin Flavonoid Tanin Polyuronic Đường khử Phương pháp định tính:
Acid hữu cơ:
Lấy 2 ml dịch thử cho vào ống nghiệm. Pha lỗng với 1 ml nước cất, thêm một ít tinh thể NaCO3. Nếu cĩ bọt khí sủi lên từ các tinh thể NaCO3 - Cĩ acid hữu cơ.
Alkaloid:
Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử trong chén sứ, hịa cắn với 4 ml HCl 1%. Chia đều trong 4 ống nghiệm, nhỏ lần lượt vào đĩ các thuốc thử sau cùng với kết quả nhận định là cĩ alkaloid:
Thuốc thử Valse-Mayer: Tủa trắng – vàng nhạt Bertrand : Tủa trắng
Bouchardat : Tủa đỏ nâu Dragendorff : Tủa đỏ cam (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Antraglycosid:
Phản ứng Bortrager: Cho 5 ml dịch thử vào một ống nghiệm nhỏ, thêm vào đĩ NaOH 10 %, lắc kỹ. Nếu lớp kiềm cĩ màu từ hồng tới đỏ - Cĩ anthraglycosid.
Carotenoid:
Phản ứng 1: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ, nhỏ vào đĩ vài giọt thuốc thử Carr-Price (SbCl3 bão hịa trong CHCl3). Dung dịch cĩ màu đỏ - Cĩ carotenoid.
Phản ứng 2: Thêm vào cắn vài giọt H2SO4 đậm đặc. Dung dịch cĩ màu xanh dương - Cĩ carotenoid.
Chất béo:
Nhỏ vài giọt dịch ether lên cùng một chỗ trên giấy xác định chất béo, sấy nhẹ cho hết dung mơi, hết mùi tinh dầu (nếu cĩ). Chỗ nhỏ để lại vết mờ - Cĩ chất béo.
Đƣờng khử:
Bốc hơi 5 ml dịch thử đến cắn. Hịa cắn với 3 ml nước cất trên bếp cách thủy. Để nguội và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu cĩ tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm - Cĩ các hợp chất khử (chủ yếu là đường khử).
Coumarin:
Phản ứng 1: Nhỏ vài giọt dịch thử lên một miếng giấy lọc, sấy nhẹ. Nhỏ lên đĩ hai giọt KOH 10 % trong cồn, tiếp tục sấy nhẹ cho khơ. Che một nửa vết chấm bằng một miếng kim loại, soi UV365 nm. Sau vài phút lấy miếng kim loại ra; nhận xét sự thay đổi cường độ phát quang của nửa mặt bị che: sáng dần lên đến khi sáng tương đương với nửa khơng bị che – cĩ coumarin.
Phản ứng 2: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử. Hịa cắn với 2 ml cồn 700, chia đều vào hai ống nghiệm nhỏ, thêm vào ống thứ nhất 0,5 ml KOH 10 % và ống thứ hai một lượng nước cất tương đương. Đun cách thuỷ cả hai ống nghiệm trong 2 phút, để nguội soi UV365 nm. Dung dịch trong ống một cĩ huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ hai - cĩ coumarin.
Flavonoid:
Phản ứng Cyanidin: Lấy khoảng 10 ml dịch thử cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn khơ. Hịa cắn với 2 ml cồn 250 gạn dịch cồn cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm vào đĩ một ít bột Mg kim loại và thêm từ từ 0,5 ml HCl đậm đặc. Sau phản ứng dung dịch cĩ màu từ hồng tới đỏ - cĩ flavonoid.
Anthocyanosid: Lấy 1 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm nhỏ, thêm 3 giọt HCl
10 %, nếu dung dịch cĩ màu từ hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hĩa bằng dung dịch NaOH 10 % - Cĩ anthocyanosid.
Proanthocyanidin: Lấy 5 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm, thêm 2 ml HCl
10 %, đun cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch cĩ màu hồng tới đỏ - cĩ proanthocyanidin.
Polyuronic:
Nhỏ từng giọt một 2 ml dịch thử vào một ống nghiệm cĩ chứa 10 ml cồn 950 . Nếu cĩ nhiều tủa bơng được tạo thành - cĩ polyuronid.
Saponin:
Lấy 5 ml dịch thử cho vào chén sứ bốc hơi tới cắn. Hịa cắn với 5 ml cồn 250 trên bếp cách thủy. Lọc, cho dịch lọc vào ống nghiệm. Thêm 5 ml nước, lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu cĩ bọt bền - cĩ saponin.
Tanin:
Bốc hơi tới cắn dịch thử trong chén sứ, hịa cắn với 4 ml nước cất trên bếp cách thủy. Lọc, chia dịch chiết vào hai ống nghiệm:
Ống 1: Pha lỗng với nước cất theo tỉ lệ 1:2, thêm hai giọt thuốc thử FeCl3 5 %, lắc đều. Nếu dung dịch cĩ màu xanh rêu hay xanh đen - cĩ polyphenol.
Ống 2: Thêm 5 giọt dung dịch gelatin mặn, lắc đều so sánh với ống chứng. Nếu cĩ tủa bơng trắng - cĩ tanin.
Tinh dầu:
Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ; nếu cắn cĩ mùi thơm nhẹ cho vào đĩ một ít cồn cao độ, bốc hơi tới cắn. Cắn cĩ mùi thơm nhẹ đặc trưng – cĩ tinh dầu.
Triterpenoid:
Phản ứng Libermann-Burchard: bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử, hịa cắn với 0,5 ml anhydrid acetic và 0,5 ml CHCl3, chuyển dung dịch vào ống nghiệm, nhỏ từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc theo thành ống đặt nghiêng. Nếu vịng ngăn cách cĩ màu đỏ nâu hay đỏ đến tím; lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím - cĩ triterpennoid tự do (phytosterol). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sơ đồ 3.1: Qui trình tổng quát phân tích sơ bộ thành phần hĩa thực vật FeCl3 TT Fehling A, B Nguyên liệu Mg/HClđđ Chiết bằng ether Bã nguyên liệu Dịch Ether KOH 10% Chiết bằng cồn Lớp kiềm Lớp ether Dịch chiết cồn Bã nguyên liệu Dịch cồn Dịch ether Dịch acid Bã nguyên liệu Dịch acid H2SO4 10% vết trên giấy lọc KOH 10% Flavonoid Acid béo Anthraglycosid Cắn cĩ mùi thơm Liebermann H2SO4đđ Tinh dầu Phytosterol Carotenoid
TT Mayer, Bouchardat, Dragendoft
Alkaloid KOH, HCl TT Fehling A, B TT Mayer, Bouchardat Na2CO3 Na Acetat + FeCl3 3% Mg/HClđđ KOH 10% Liebermann Anthraglycosid Sterolic Flavonoid Tanin Acid hữu cơ Alkaloid Đường khử Anthocyan Saponin Tạo bọt Cồn cao độ TT Mayer, Bouchardat H2SO4 1% H/c uronic Đường khử Tanin Alkaloid Saponin
3.4. Phƣơng pháp cơ lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa
Lấy 500 g mẫu khơ, chiết với hệ Soxhlet trong 48 giờ với EtOH 70 %, sau đĩ lọc, dịch lọc được cơ cạn dưới áp suất thấp cịn 1lít, thêm một1 lít nước cất vào dịch lọc.
3.4.1. Điều chế các loại cao
3.4.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa
Cho 1500 ml dung mơi ete dầu hỏa vào 2 lít dung dịch mẫu thu được ở trên (chia thành 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều. Lúc này dung dịch trong bình gạn sẽ chia thành 2 lớp, thu phần dịch ở trên, làm khan với Na2SO4, cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao ete dầu hỏa.
3.4.1.2 Điều chế cao CHCl3
Phần dịch nước cịn lại sau khi đã trích với ete dầu hỏa, cho 1500 ml dung mơi CHCl3 vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên dưới, làm khan với Na2SO4 và cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao CHCl3.
3.4.1.3. Điều chế cao n-Butanol
Phần dịch cịn lại sau khi đã trích với CHCl3, được tiếp tục cho 1500 ml n- butanol vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên trên, làm khan với Na2SO4, cơ cạn dung dịch dưới áp suất thấp thu được cao n-Butanol.
3.4.1.4. Điều chế cao nƣớc
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ điều chế các loại cao thơ từ lá Xuân Hoa
Lá khơ 500 g
- Xay nhỏ, đun Soxhlet 72h với EtOH 70 %; 4lít, lọc
Bã Dịch trích EtOH
- Cơ dưới áp suất thấp cịn 1 lít, thêm 1 lit nước cất
- Tận trích với ete dầu hỏa 1,5 lít.
Pha nước Dịch trích CHCl3
Cao ete dầu hỏa
Pha nước Dịch trích
Ete dầu hỏa
Cao CHCl3 Dịch trích n - Butanol Cao n - Butanol Pha nước Cao nước Tận trích với CHCl3; 2 lít - Làm khan với Na2SO4, Lọc
- Cơ cạn dưới áp suất thấp
- Lọ c
- Cơ cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p
- Làm khan với Na2SO4 - Lọc
- Cơ cạn dưới áp suất
thấ p (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Lọ c
- Cơ cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p
Tận trích với n-Butanol - Cơ cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p
-Làm khan với Na2SO4, lọc - Cơ cạn dưới áp suấtthấp
- Cơ cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p
3.4.2. Cơ lập một số hợp chất trong cao ete dầu hỏa
Thực hiện sắc ký cột trên cao ete dầu hỏa, chất hấp phụ silicagel, dung mơi giải ly là ete dầu hỏa, EtOAc và hỗn hợp của chúng với độ phân cực tăng dần.
Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung mơi giải ly là CHCl3 : E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là dung dịch H2SO4 10 %/EtOH.
Các phân đoạn giống nhau trên sắc ký lớp mỏng được gộp lại. Tiến hành sắc ký