Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hĩa thực vật của lá cây Xuân Hoa được thu nhận ở bảng 4.1.
Bảng 4.1: Tĩm tắt kết quả phân tích sơ bộ thành phần hĩa học lá cây Xuân Hoa: Tên hợp chất Thuốc thử Kết quả Loại dung dịch
Ete Cồn Nước Antraglycosid KOH 10% Dung dịch màu đỏ - + -
Flavonoid HClđđ+Mg kim loại Màu đỏ - + - Acd béo Nhỏ dd lên giấy lọc Để vết mờ +
Alkaloid
Mayer Tủa - + -
Dragendorf Tủa - + -
Bouchardat Tủa - + -
Carotenoid H2SO4 Màu xanh nhạt +
Phytosterol Anhydric acetic+H2SO4
Chỗ tiếp xúc cĩ màu nhạt
++
Tinh dầu Bốc hơi tới cắn Mùi thơm nhẹ + Coumarin Soi UV Phát huỳnh quang +
Polyphenol FeCl3 2% Màu xanh đen ++ +
Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt +
Đường khử Thuốc thử Fehling Đỏ gạch ++ +
Antracyanosid HCl, NaOH Khơng màu +
Saponin Lắc mạnh Tạo bọt Bền Bền Liebermann Cĩ vịng tím nâu chuyển sang đỏ ++ + Hợp chất uronic Pha lỗng EtOH 90%
Tủa bơng nhiều ++
Chú thích: ++: rất rõ;+: rõ; -: khơng cĩ Nhận xét:
- Từ dịch chiết ete ethylic đã xác định sự hiện diện của các cấu tử hữu cơ trong lá cây Xuân Hoa là: acid béo, carotenoid, phytosterol, tinh dầu, coumarin, acid hữu cơ.
- Từ dịch cồn đã xác định được các cấu tử hữu cơ: antraglycosid, flavonoid, alkaloid, polyphenol, đường khử, antracyanosid, saponin.
- Từ dịch nước đã xác định được các cấu tử hữu cơ: polyphenol, đường khử, saponin và hợp chất uronic.
4.3. Cơ lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa
Lấy 500 g mẫu khơ, chiết với hệ Soxhlet trong 48 giờ với EtOH 70 %, sau đĩ lọc, dịch lọc được cơ cạn dưới áp suất thấp cịn 1lít, thêm một1 lít nước cất vào dịch lọc.
4.3.1. Điều chế các loại cao
4.3.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa
Cho 1500 ml dung mơi ete dầu hỏa vào 2 lít dung dịch mẫu thu được ở trên (chia thành 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều. Lúc này dung dịch trong bình gạn sẽ chia thành 2 lớp, thu phần dịch ở trên, làm khan với Na2SO4, cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao ete dầu hỏa 5,6 g.
4.3.1.2. Điều chế cao CHCl3
Phần dịch nước cịn lại sau khi đã trích với ete dầu hỏa, cho 1500 ml dung mơi CHCl3 vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên dưới, làm khan với Na2SO4 và cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao CHCl3 9,8 g.
4.3.1.3. Điều chế cao n-butanol
Phần dịch cịn lại sau khi đã trích với CHCl3, được tiếp tục cho 1500 ml n- butanol vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên trên, làm khan với Na2SO4, cơ cạn dung dịch dưới áp suất thấp thu được cao n-Butanol 15,2 g.
4.3.1.4. Điều chế cao nƣớc
Phần nước cịn lại tiến hành cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao H2O 25,7 g. Hiệu suất chiết suất của các loại dung mơi được tính theo cơng thức:
H = 500
A
x 100 %
Trong đĩ:
- H : hiệu suất chiết suất. - A : Khối lượng cao thu được. - 500 : khối lượng mẫu ban đầu.
Bảng 4.2: Hiệu suất chiết suất của các loại dung mơi
Loại dung mơi Khối lượng cao thu được (g) Hiệu suất (%)
Ete dầu hỏa 5,6 1,12
Chloroform 9,8 1,98
n-butanol 15,2 3,04
0 1 2 3 4 5 6
Ete dầu hỏa Chloroform n-butanol Nước
%
Biểu đồ 4.1: Hiệu suất chiết suất của các loại dung mơi 4.3.2. Cơ lập một số hợp chất từ cao ete dầu hỏa
Cao ete dầu hỏa sau khi thu được, lấy 3 g để tiến hành chạy sắc ký cột, chất hấp phụ là silicagel, dung mơi giải ly là hỗn hợp ete dầu hỏa và EtOAc với độ phân cực tăng dần.
Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa cho 15 phân đoạn
Ở phân đoạn 9 với dung mơi giải ly Ete dầu : EtOAc 92 : 8 và phân đoạn 10 với dung mơi giải ly E : EtOAc 90 : 10 sau khi cơ cạn cho cặn màu vàng nhạt (0,235 g). Sắc ký lớp mỏng silicagel trên cặn này với hệ dung ly là CHCl3 : E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là H2SO4 10 %/EtOH cho hai vết màu nâu đen, một vết đậm Rf = 0,23 và một vệt mờ Rf= 0,17.
Kết quả sắc ký cột silicagel trên 3g cao ete dầu hỏa được tĩm tắt ở bảng 4.3 Hiệu suất chiết suất (%)
Ete dầu hỏa Chloroform n-butanol Nước
1,12
5,14
3,04 1,98
Bảng 4.3 : Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa (3g) Phân đoạn Dung ly Thể tích (ml) Trọng lượng cặn (mg) Sắc ký lớp mỏng Ghi chú 1 E(100%) 100 2 E:EtOAc 99:1 200 75 Vệt dài 3 E:EtOAc 98:2 200 86 Vệt dài 4 E:EtOAc 97:3 200 98 Vệt dài 5 E:EtOAc 96:4 200 112 Nhiều vết 6 E:EtOAc 95:5 200 153 Nhiều vết 7 E:EtOAc 94:6 200 256 Nhiều vết 8 E:EtOAc 93:7 200 190 Nhiều vết 9 E:EtOAc 92:8 400 116 2vết,Rf=0,23;Rf=0,17 Khảo sát 10 E:EtOAc 90:10 400 119 2vết,Rf=0,23;Rf=0,17 Khảo sát 11 E:EtOAc 85:15 600 142 Nhiều vết 12 E:EtOAc 80:20 600 155 Nhiều vết 13 E:EtOAc 70:30 200 120 Nhiều vết 14 E:EtOAc 60:40 600 114 Nhiều vết 15 E:EtOAc 50:50 400 250 Nhiều vết
Ghi chú: E = Ete dầu hỏa; EtOAc = ethylacetate; EtOH = ethyl alcol
Ở phân đọan 9,10 tiếp tục quá trình sắc ký cột lần 2 với hệ dung mơi giải ly E : EtOAc 90 : 10 tới 85 : 15 thu được 5 phân đọan sau khi cơ cạn dung mơi phân đoạn 2 và 3 và kết tinh lại trong MeOH cho tinh thể hình kim màu trắng (64mg) đặt tên S. Sắc ký lớp mỏng silicagel trên cặn này với hệ dung ly là CHCl3 : E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là H2SO4 10 %/EtOH cho một vết màu nâu Rf = 0,23.
Sơ đồ 4.1: Tĩm tắt quá trình sắc ký cột 3 g cao ete dầu hỏa
Hình 4.1: Sắc ký bản mỏng cao ete dầu và hợp chất S
Cao ete dầu hỏa Hợp chất S
Sắc ký cột silicagel E : EtOAc 90 : 10 → 85 : 15 Cao ete dầu hỏa (3 g)
Sắc ký cột silicagel
E : EtOAc 100 % → 50 : 50 Thu đđược 15 phân đoạn
Phân đoạn 9, 10 (0,235 g)
Thu được 5 phân đoạn 1 – 5
Bay hơi dung mơi và rữa sạch phân đoạn 2 và 3, kết tinh thu được hợp chất sạch S (64 mg)
4.3.3. Khảo sát cấu trúc hĩa học của hợp chất S
* Sắc ký lớp mỏng: giải ly bằng hệ dung mơi cloroform:ete dầu 9:1, thuốc thử hiện hình là acid sulfuric 10%/EtOH, sấy bản ở 1100C cho một vết duy nhất màu nâu cĩ giá trị Rf = 0,23.
*Nhiệt độ nĩng chảy 154-1560C (MeOH).
* Phổ khối lƣợng MS (Phụ lục số 1)
m/z: 414 (M+); 329; 255; 213; 161; 145; 105; 81; 69. * Phổ hồng ngoại IR (phụ lục số 2)
ν, cm-1:3452,45 (dao động O–H); 2906,52; 2783,90 (Dao động C–H bão hịa);1662,98 (dao động C = C); 12,82,94 (dao động C – O).
* Phổ 1H-NMR, CDCl3, δ, ppm (phụ lục số 3)
5,35 (d, 5Hz, – CH =); 5,14 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz; – CH =); 5,03 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz; – CH=); 3,52 (t, >CH – O –); 0,68 – 1,02 H của 6 nhĩm –CH3.
* Phổ 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT, CDCl3, δ, ppm (phụ lục số 4) 140,77 (>C =); 138,32 (– CH =);129,31 (– CH =); 121,73 (– CH =); 71,83 (CH – O –)
Biện luận cấu trúc S:
S cho phản ứng dương tính với các thuốc thử đặc trưng của triterpen và steroid như Liebermann Burchard, Salkowski và Noller.
Từ các tín hiệu trên phổ IR (3452,45cm-1); 1H-NMR (3,52ppm); 13C-NMR (71,83 ppm) chứng tỏ S cĩ nhĩm – OH.
Phổ 13
C-NMR và 1H-NMR cho thấy S cĩ hai nối đơi, trong đĩ 1 liên kết kiểu >C=CH và liên kết cịn lại kiểu – CH = CH – . Phổ 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT cho biết S cĩ 3 carbon bậc bốn (>C<), 11 carbon bậc 3 (>CH –), 9 carbon bậc hai (– CH2 –) và 6 carbon bậc 1 (– CH3), từ đĩ cơng thức phân tử của S là C29H48O, điều này được khẳng định lại dựa trên phổ khối lượng (M+= 414).
Độ bất bão hồ của S là 6, như vậy cấu trúc S cĩ 4 vịng. Kết hợp với số nguyên tử carbon giúp ta khẳng định S là một hợp chất steroid.
Phổ 1H-NMR cho biết nối đơi – CH = CH – tồn tại dưới dạng trans (dựa vào các mũi cộng hưởng δ 5,13(dd, 8,5Hz; 14,5Hz) và δ 5,03 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz).
Các nhận định ban đầu cho thấy S cĩ thể là stigmasterol, khảo sát kỹ cường độ các mũi cộng hưởng tại các vị trí δ 5,35; δ 5,13 đến 5,03 và δ 3,52 cho thấy các giá trị tích phân gần bằng nhau, kết hợp với phổ 13C- NMR (xuất hiện 42 tín hiệu cộng
hưởng) chúng tơi dự đốn S là hỗn hợp của stigmaterol và β-sitosterol với tỉ lệ 1:1, điều này dựa vào phổ 1H NMR của các vị trí 5,35; 5,13; 5,03.
Các số liệu phổ 13C-NMR và DEPT của S được so sánh với các phổ tương ứng của stigmasterol và β-sitosterol. Kết quả so sánh phổ 13
C-NMR của hợp chất S với stigmasterol và β-sitosterol (phụ lục 5) cho thấy sự trùng khớp ở các vị trí của cả hai hợp chất. Như vậy S là hỗn hợp của stigmasterol và β-sitosterol.
β-Sitosterol Stigmasterol Hình 4.2: Cấu trúc hĩa học của β-Sitosterol và Stigmasterol 4.4. Thử nghiệm vi sinh
Hai ống nghiệm thử dung mơi vi khuẩn mọc làm đục mơi trường, cĩ tạo váng màu trắng trên bề mặt và cĩ cặn trắng bên dưới ống nghiệm. Kết luận dung mơi DMSO khơng ức chế sự phát triển của hai chủng vi khuẩn E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium ở tỉ lệ 0,06 ml/ 2 ml mơi trường
Đối với các loại cao ete dầu hỏa, cao n-butanol và cao nước các ống nghiệm thử nghiệm ở các nồng độ từ 100 đến 600μg/ml vi khuẩn làm đục mơi trường cĩ lắng cặn trắng ở dưới đáy.
Kết luận: Cao ete dầu hỏa, cao n-butanol và cao nước khơng cĩ khả năng ức chế hai chủng vi khuẩn E. coli và Salmonella tới nồng độ 600 μg/ml
Đối với cao chloroform, với các nồng độ 400 – 600 μg/ml quan sát thấy mơi trường khơng bị đục. HO CH3 C2H5 H CH3 H3C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28, 29 H5C2 CH3 CH3 CH3 CH3 H3C HO H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28,29
Bảng 4.4: Kết quả thử nghiệm các loại cao trong khoảng nồng độ 100-600 μg/ml
Loại cao
Ete dầu hỏa CHCl3 n-butanol H2O Nồng dộ (μg/ml)
E.coli Sal E.coli Sal E.coli Sal E.coli Sal
100 + + + + + + + + 200 + + + + + + + + 300 + + + + + + + + 400 + + – – + + + + 500 + + – – + + + + 600 + + – – + + + +
Ghi chú: +:Mơi trường bị đục
–: Mơi trường khơng bị đục.
Tiến hành thử nghiệm tiếp tục ở các nồng độ với khoảng cách nhỏ hơn trong khoảng từ 300 – 400 μg/ml.
Hình 4.3: Các ống nghiệm nồng độ trong khoảng 300 - 400 μg/ml trước khi đem ủ.
Sau khi ủ, ở nồng độ 330 μg/ml E. coli khơng làm đục mơi trường nuơi cấy. Cịn đối với Salmnella thì khơng làm đục mơi trường ở nồng độ 340 μg/ml.
Bảng 4.5: Kết quả thử nghiệm cao chloroform trong khoảng nồng độ 300-400 μg/ml Nồng độ (μg/ml) E. coli Salmonella 310 + + 320 + + 330 – + 340 – – 350 – – 360 – – 370 – – 380 – – 390 – –
Ghi chú: +: Mơi trường nuơi cấy bị đục –: Mơi trường nuơi cấy khơng bị đục
Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm trên E. coli.
Hình 4.5: Kết quả thử nghiệm trên Salmonella.. Bảng 4.6: Kết luận Vi khuẩn MIC (μg/ml) E. coli ATCC 25922 330 Salmonella typhimurium 340 310 320 330 340 350 360 370 380 390 (μg/ml). 310 320 330 340 350 360 370 380 390 (μg/ml)
Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
I. Kết luận
5.1. Khảo sát thành phần hĩa học
Đã sơ bộ phân tích thành phần hĩa học các hợp chất cĩ trong lá Xuân Hoa. Đã xác định được sự hiện diện của các cấu tử hữu cơ: flavonoid, tanin, terpenoid, saponin...
Từ 500g bột lá khơ cây Xuân Hoa đã điều chế được cao ete dầu hỏa là 5,6g (hiệu suất 1,12%), cao chloroform 9,8g (hiệu suất 1,98%), cao n-butanol 15,2g (hiệu suất 3,04%) và cao nước 25,7g (hiệu suất 5,14%).
Từ cao ete dầu hỏa đã tiến hành phân lập và thu được 64 mg hợp chất S (hiệu suất 2,13 % tính trên trọng lượng cao ete dầu hỏa).
Cấu trúc của hợp chất được xác định dựa trên các phương pháp phổ nghiệm như khối phổ, phổ hồng ngoại, phổ 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT. Hợp chấy S được nhận danh là hỗn hợp của Stigmasterol và β-sitosterol tỉ lệ 1 : 1.
5.2. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn
Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn trên hai đối tượng vi sinh là E. coli
ATCC 25922 và Salmonella typhimurium với 4 loại cao: ete dầu hỏa, chloroform, n- butanol và cao nước.
Kết quả cho thấy chỉ cĩ cao chloroform cĩ khả năng ức chế sự phát triển của hai chủng vi sinh vật trên.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chloroform đối với hai chủng vi sinh vật lần lượt: E. coli ATCC 25922 là 330 μg/ml và Salmonella typhimurium là 340μg/ml.
II. Đề nghị
Trong khoảng thời gian ngắn làm khĩa luận tốt nghiệp những kết quả thu được chỉ là những kết quả bước đầu. Nếu cĩ thời gian, xin đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để cĩ thể tìm hiểu thêm về tác dụng sinh học và thành phần hĩa học của cây Xuân Hoa. Đặt biệt là phân lập, xác định cấu trúc hĩa học các hợp chất hữu cơ trên cao chloroform và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên một số dịng vi khuẩn đường ruột khác. Từ đĩ làm cơ sở cho việc chuẩn hĩa và tạo ra chế phẩm cĩ khả năng thay thế kháng sinh trong điều trị các bệnh nhiểm khuẩn đường tiêu hĩa.
Phụ lục 5: So sánh phổ 13
C-NMR của S với -Sitosterol và Stigmasterol
STT Hợp chất S -Sitosterol Stigmasterol
13C-NMR DEPT carbon Vị trí 13C-NMR Loại carbon car bon Vị trí 13C-NMR Loại carbon
1 140,77 Biến mất 5 140,10 >C= 5’ 140,67 >C=
2 138,32 Mũi dương - - - 22’ 138,25 -CH=
3 129,31 Mũi dương - - - 23’ 129,19 -
4 121,73 Mũi dương 6 121,60 =CH- 6’ 121,62 -CH=
5 71,83 Mũi dương 3 71,00 -CH-OH 3’ 71,72 -CH-OH
6 56,89 Mũi dương - - - 14’ 56,83 >CH- 7 56,79 Mũi dương 14 56,70 >CH- - - - 8 56,09 Mũi dương 17 55,80 >CH- - - - 9 255,99 Mũi dương - - - 17’ 55,91 >CH- 10 51,25 Mũi dương - - - 24’ 51,21 >CH- 11 50,17 Mũi dương 9 50,10 >CH- 9’ 50,12 >CH- 12 45,87 Mũi dương 24 45,60 >CH- - - - 13 42,31 Mũi âm 4 42,10 -CH2- 12’ 42,25 -CH2- 14 42,24 Biến mất 13 42,10 >C< 13’ 42,18 >C< 15 40,49 Mũi dương - - - 20’ 40,45 >CH- 16 39,71 Mũi âm 12 39,60 -CH2- 4’ 39,66 -CH2- 17 37,28 Mũi âm 1 37,10 -CH2- 1’ 37,24 -CH2- 18 36,53 Biến mất 10 36,40 >C< 10’ 36,40 >C< 19 36,16 Mũi dương 20 36,00 >CH- - - - 20 33,98 Mũi âm 22 33,80 -CH2- - - - 21 31,93 Mũi dương 8 31,80 >CH- 8’ 31,87 >CH- 22 31,89 Mũi dương - - - 25’ 31,87 >CH- 23 31,67 Mũi âm 7 31,80 -CH2- - - - 24 31,58 Mũi âm 2 31,50 -CH2- 7’ 31,61 -CH2- 25 29,67 Mũi dương 25 29,00 >CH- - - - 26 28,92 Mũi âm - - - 2’ 28,92 -CH2- 27 28,25 Mũi âm 16 28,20 -CH2- 16’ 28,20 -CH2- 28 26,13 Mũi âm 23 26,00 -CH2- - - - 29 25,41 Mũi âm - - - 28’ 25,40 -CH2- 30 24,38 Mũi âm 15 24,10 -CH2- 15’ 24,35 -CH2- 31 23,10 Mũi âm 28 23,00 -CH2- - - - 32 21,23 Mũi dương - - - 26’ 21,22 -CH3 33 21,09 Mũi âm 11 21,10 -CH2- 11’ 21,06 -CH2- 34 21,09 Mũi dương - - - 21’ 21,09 -CH3 35 19,82 Mũi dương 26 19,70 -CH3 - - - 36 19,40 Mũi dương 19 19,30 -CH3 18’ 19,39 -CH3 37 19,00 Mũi dương 27 19,00 -CH3 27’ 18,98 -CH3 38 18,79 Mũi dương 21 18,60 -CH3 - - - 39 12,25 Mũi dương - - - 29’ 12,26 -CH3 40 12,06 Mũi dương - - - 19’ 12,04 -CH3