Luận văn : KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum) part 2 doc

x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1: Hàm lượng một số nguyên tố đa vi lượng trong lá Xuân Hoa 4 Bảng 2.2: Kết quả xét nghiệm sinh thiết của chuột được cho uống cao Xuân Hoa 6 Bảng 2.3: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 1 ml/kg thể trọng 7 Bảng 2.4: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5 ml/kg thể trọng 7 Bảng 2.5: Hàm lượng men gan của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5ml/kg thể trọng 7 Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chửa trị bệnh tiêu chảy của bột Xuân Hoa với hai loại kháng sinh Coli-norgen và Cotrimxazol 8 Bảng 4.1: Tóm tắt kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học lá cây Xuân Hoa 43 Bảng 4.2: Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi 43 Bảng 4.3: Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa (3g) 45 Bảng 4.4: Kết quả thử nghiệm các loại cao trong khoảng nồng độ 100-600 μg/ml 49 Bảng 4.5: Kết quả thử nghiệm cao CHCl 3 trong khoảng nồng độ 300-400 μg/ml 50 Bảng 4.6: Kết luận 50 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1: Cây Xuân Hoa 3 Hình 2.2: Salmonella typhimurium 14 Hình 2.3: Escherichia coli 21 Hình 3.1: chuẩn độ đục vi khuẩn 38 Hình 3.2: Các ống nghiệm đã cấy huyền dịch vi khuẩn vào 40 Hình 4.1: Sắc ký bản mỏng cao ete dầu và hợp chất S 47 Hình 4.2: Cấu trúc hóa học của β-Sitosterol và Stigmasterol 48 Hình 4.3: Các ống nghiệm nồng độ trong khoảng 300 - 400 μg/ml trước khi đem ủ 49 Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm trên E. coli 50 Hình 4.5: Kết quả thử nghiệm trên Salmonella 50 xii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ Sơ đồ và biểu đồ Trang Sơ đồ 2.1: Phân loại họ vi khuẩn đường ruột 13 Sơ đồ 3.1: Qui trình tổng quát phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 33 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ điều chế các loại cao thô từ lá Xuân Hoa 35 Sơ đồ 4.1: Tóm tắt quá trình sắc ký cột 3 g cao ete dầu hỏa 46 Biểu đồ 4.1: Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi 44 1 Phần I. MỞ ĐẦU 1.1 . Đặt vấn đề Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) là một cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam và đã được dùng trong dân gian từ những năm 80. Theo kinh nghiệm dân gian, cây được sử dụng chữa nhiều bệnh như: trĩ nội, chảy máu, suy nhược thần kinh và thông dụng nhất là dùng để chữa những rối loạn do nhiễm khuẩn đường tiêu hóa… Ở Trung Quốc người ta sử dụng rễ của cây này để chữa vết thương. Nguyễn Thị Lan Oanh và công sự đã thử nghiệm dịch chiết lá Xuân Hoa cho thấy lá Xuân Hoa không độc với cá chọi. Trần Công Khánh và cộng sự đã thử độc tính cấp diễn trên chuột cho thấy trên độc tính cấp, cao toàn phần lá Xuân Hoa không thể hiện độc tính, không có LD 50 . Hiện nay nhiễm khuẩn đường tiêu hóa diễn ra rất phổ biến. Phương pháp chữa trị chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh dẫn đến nhiều rủi ro do hiện tượng kháng thuốc ở vi sinh vật gây ra. Do đó tìm ra một nguồn vật liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn sẽ cho ta một phương pháp điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nói chung và nhiễm khuẩn đường tiêu hoá nói riêng an toàn và hiệu quả hơn. Xuất phát từ yêu cầu trên chúng tôi thực hiện đề tài: "Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đƣờng ruột của cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum)". 1.2 . Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục đích - Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật các cấu tử hữu cơ có trong lá Xuân Hoa. - Chiết tách hợp chất hữu cơ từ lá Xuân Hoa bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký bản mỏng. - Khảo sát khả năng kháng hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium của lá cây Xuân Hoa. 2 1.2.1. Yêu cầu - Định tính sơ bộ một số cấu tử hữu cơ có trong lá cây Xuân Hoa theo phương pháp phân tích của trường Đại Học Dược Khoa Rumani. - Cô lập các loại cao: ete dầu hỏa, chloroform, n-butanol và cao nước. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC = Minimum Inhibitory concentration) của các loại cao đã cô lập đối với hai chủng vi sinh vật đường ruột E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. - Chiết tách và tinh sạch được các hợp chất từ lá xuân Hoa và xác định cấu trúc hóa học của chúng. 3 Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) 2.1.1.Đặc điểm thực vật học [2],[7] -Tên khoa học: Pseuderanthemum palatiferum. - Họ: Ô rô (Acanthaceae). - Tên thông thường: Xuân Hoa, Hoàn Ngọc, Nhật Nguyệt, Tù Linh, Trạc Mã. - Phân bố: Việt Nam, Lào. 2.1.2 Đặc điểm hình thái [8],[11] Đây là một loài cây bụi, sống đa niên, thân non màu xanh lục, phần già hóa gỗ màu nâu, phân nhiều cành mảnh. Lá mọc đối, có cuống, phiến lá hình lưỡi mác, hai đầu nhọn, dài 12-17 cm, rộng 3,5 - 5 cm, gốc lá hơi men xuống. Cụm hoa dài 10 - 16 cm, ở kẽ lá hoặc đàu cành, gồm các xim ngắn ở các mấu. Hoa lưỡng tính, không đều, 5 lá đài rời tồn tại đến khi tràng hợp, màu trắng, ống tràng hẹp và dài khoảng 2,5 cm, có 5 thùy chia làm hai môi, môi trên gồm hai thùy nhỏ dính liền nhau đến nữa chiều dài của thuỳ, môi dướigồm 3 thùy to, thùy giữa của môi dưới có các chấm màu tím. Hai nhị sinh sản với chỉ nghị ngắn đính trên họng tràng, bao phấn đính gốc, mầu tím, hai nhị lép. Hai chỉ nhị bầu trên nhẵn dài khoảng 1,5 cm, hai lá noãn liền nhau tạo thành bầu hai ô; vòi nhị dài khoảng 2,5 – 2,7 cm, nửa dưới của vòi có lông, 2/3 của vòi trên có màu tím nhạt. Quả nang, hai ô, mỗi ô chứa hai hạt. Cây ra hoa từ tháng 4 – 5. Cây mọc hoang ra hoa gần như quanh năm. Cây được trồng nhiêu nơi như một cây thuốc gia đình. Hình 2.1: Cây Xuân Hoa 4 2.1.3.Thành phần hoá học [1],[9],[13],[17],[19] Bằng các phản ứng định tính hoá học, đã sơ bộ xác định trong lá cây Xuân Hoa có chứa: acid hữu cơ, carotenoid, coumarin, đường tự do, phytosterol, flavonoid, saponin. Ngoài ra lá Xuân Hoa còn chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu với hàm lượng tổng số khá cao (751 – 1365 mg%). Đặc biệt hàm lượng isoleucin và leucin rất cao (25 – 150 mg% và 46 – 85 mg%). Đó là các acid amin giữ vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp protein cơ bắp và chống mỏi mệt cơ thể. Thiếu chúng cơ thể sụt cân nhanh. Lá Xuân Hoa còn giàu valin (29 – 1001 mg%). Thiếu acid amin này, sự phối hợp các chuyển động của bắp thịt bị rối loạn và yếu đi. Valin còn ảnh hưởng đến hoạt động của tuyến tụy, một tuyến tiêu hóa quan trọng. Các nguyên tố đa lượng và vi lượng trong lá cây Xuân Hoa khá cao so với các loại cây khác. Không phát hiện các nguyên tố kim loại nặng như Cd, Pd, As, Cr. Đáng chú ý là hàm lượng vanađi khá cao (3,75 mg/100 g lá tươi) Bảng 2.1: Hàm lượng một số nguyên tố đa vi lượng trong lá Xuân Hoa Chất khoáng đa lượng Hàm lượng (mg/100 g lá tươi) Chất khoáng vi lượng Hàm lượng (mg/100 g lá tươi) Ca 875,5 Fe 38,75 Mg 837,6 Al 37,5 K 587,5 V 3,75 Na 162,7 Cu 0,43 Mn 0,34 Ni 0,19 Những nghiên cứu gần đây của Trần Công Khánh và cộng sự về thành phần hóa học trong lá cây Xuân Hoa đã phân lập được nhiều chất hữu cơ như: Phytol, poriferasterol, beta-D-glucoperanosyl-3-O-sitosterol… 2.1.4.Tính chất dƣợc lý 2.1.4.1.Theo kinh nghiệm dân gian [8],[10] Ở Trung Quốc người ta dùng rễ của cây Xuân Hoa để chữa vết thương, đau loét dạ dày, suy nhược thần kinh. Ở Việt Nam cây Xuân Hoa đã được dùng trong dân gian từ những năm 80. Theo tài liệu truyền tay thì cây Xuân Hoa có một số tác dụng sau: - Khôi phục sức khoẻ cho người ốm yếu, suy nhược thần kinh, làm việc quá sức. 5 - Chữa rối loạn tiêu hoá, tiêu chảy, lỵ, táo bón, đau bụng không rõ nguyên nhân. - Chấn thương chảy máu, dập gãy cơ thể, chấn thương sọ não. - Chữa đau dạ dày, loét thành tá tràng, chảy máu đường ruột, viêm loét đại tràng, trĩ nội. - Viêm thận cấp và mãn, suy thận, đái ra máu, đái buốt, đái rắt. - Chữa các bệnh u ở phổi, u xơ tuyến tiền liệt, đau gan, xơ gan cổ trướng, làm giảm đau khi bị ung thư gan giai đoạn phát bệnh. - Điều chỉnh huyết áp cho người bị huyết áp cao hoặc thấp. Lá Xuân Hoa không có mùi, không vị, hơi nhớt. Người ta thường dùng lá tươi rửa sạch, nhai với mấy hạt muối rồi uống với nước, giã nát lấy nước uống hoặc nấu ăn. Liều lượng phụ thuộc vào từng bệnh, từng người; thông thường ăn từ 3 – 7 lá một ngày chia làm hai lần. Thời gian điều trị tùy thuộc vào bệnh, như khi bị rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, lỵ chỉ ăn 7 – 14 lá là khỏi; đái rắt, đái buốt, đái ra máu thì ăn 14 – 20 lá; viêm đại tràng co thắt thì ăn kết hợp với lá mơ lông trong bữa ăn, từ 1 – 2 tháng. Ngoài ra, lá Xuân Hoa còn được dùng để chữa bệnh cho gia súc như chữa bệnh cho gà rù, chó cảnh sau khi đẻ cho ăn 1 – 2 lá, gà chọi sau khi chọi cho ăn 1 – 3 lá là hồi phục ngay. 2.1.4.2. Tác dụng sinh học [3],[4],[18] Năm 1999, Trần Công Khánh và cộng sự ở ĐH Dược Hà Nội thử nghiệm độc tính cấp diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của cây Xuân Hoa trên chuột.  Thử độc tính cấp Cho chuột uống 0,5 ml dung dịch thuốc Xuân Hoa với các nồng độ khác nhau: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg; 5,56 g/kg; 9,19 g/kg và 11,5 g/kg thể trọng chuột. Đưa thuốc trực tiếp vào dạ dày chuột bằng bơm tiêm 1 ml có kim đầu tù. Quan sát đại thể các phủ tạng sau khi mổ chuột và làm vi thể các cơ quan chịu tác dụng của thuốc: tim, gan, thận, dạ dày, ruột. + Kết quả: Ở các liều: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg trọng lượng chuột, sau khi uống thuốc và suốt qua trình thí nghiệm chuột thuốc không thay đổi trạng thái hoạt động. Chuột vẫn bò tới, bò lui, leo trèo, chùi râu, liếm đuôi, rữa mặt… 6 Các liều cao hơn: 5,56 g/kg; 9,19 g/kg và 11,5 g/kg thể trọng, chuột sau khi uống thuốc chuột có giảm hoạt động, nhưng sau 1 giờ trở lại bình thường, chuột nằm rúc vào nhau, mắt lim dim, thở nhẹ nhàng. Qua đêm, rải rác chuột có đi phân nát. Tất cả chuột ở các liều trên đều không chết. Chuột sống hoàn toàn khỏe mạnh sau 24 giờ. Sau 24 giờ giết ngẫu nhiên 3 chuột ở các liều: 0,83 g/kg; 9,19 g/kg và 11,5 g/kg thể trọng chuột, quan sát đại thể cho thấy các phủ tạng hoàn toàn bình thường. Quan sát vi thể cho kết quả trình bày ở bảng II.2 Bảng 2.2: Kết quả xét nghiệm sinh thiết của chuột được cho uống cao Xuân Hoa Cơ quan Liều Tim Gan Thận Dạ dày Ruột Đánh giá 0,83 g/kg Cơ tim bình thường Các tĩnh mạch xoang và tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ xung huyết. Quản cầu và các ống thận bình thường. Niêm mạc dạ dày và các tuyến bình thường. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thường. Không có tổn thương thực thể ở các tạng. 9,19 g/kg Cơ tim bình thường Tế bào gan hơi to, nguyên sinh chất có thoái hoá nhẹ. Quản cầu xung huyết, các ống thận bình thường. Niêm mạc dạ dày và các tuyến bình thường. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thường. Có thoái hoá nhẹ ở gan. 11,5 g/kg Cơ tim bình thường Tế bào gan hơi to, nguyên sinh chất có thoái hoá nhẹ, tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ xung huyết. Nang Bowmann rộng ra, tế bào thành ống teo nhỏ. Niêm mạc dạ dày và các tuyến bình thường. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thường. Có tổn thương nhẹ ở gan và thận + Kết luận: Cao toàn phần lá Xuân Hoa không gây chết chuột ở tất cả các liều. Chuột sống hoàn toàn qua 48 giờ. Như vậy trên độc tính cấp, cao toàn phần lá Xuân Hoa không thể hiện độc tính, không có LD 50.  Thử tác dụng bảo vệ tế bào gan Tiến hành gây ngộ độc gan chuột nhắc bằng carbon tetrachloride (CCl 4 ) với liều: 1 ml CCl 4 /kg thể trọng và 0,5 ml CCl 4 /kg thể trọng. Sau đó tiến hành xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid thông qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyde (MDA), một sản phẩm tạo ra bởi quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào theo phương pháp của E.A.Makarova, 1989; J.Robak và cộng sự. . " ;Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đƣờng ruột của cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum)& quot;. 1 .2 . Mục đích và yêu cầu của đề tài 1 .2. 1. Mục đích. kháng hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC 25 922 và Salmonella typhimurium của lá cây Xuân Hoa. 2 1 .2. 1. Yêu cầu - Định tính sơ bộ một số cấu tử hữu cơ có trong lá cây Xuân Hoa theo phương. hai chủng vi sinh vật đường ruột E. coli ATCC 25 922 và Salmonella typhimurium. - Chiết tách và tinh sạch được các hợp chất từ lá xuân Hoa và xác định cấu trúc hóa học của chúng. 3 Phần