BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƢỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********* KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƢỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. PHAN PHƢỚC HIỀN TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN ThS. MAI ĐÌNH TRỊ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM ƠN Thành kính khắc ghi công ơn cha mẹ sinh thành, đã nuôi dưỡng và giáo dục con nên người. Em xin gửi lòng biết ơn đến: - Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban giám đốc Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Hóa Sinh - Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban chủ nhiệm, Thầy và Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học. đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài. Em xin trân trọng biết ơn: - TS. Phan Phước Hiền. - ThS. Mai Đình Trị. đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt cho em những kinh nghiệm, kiến thức quí báu, tạo mọi điều kiện tốt cho em hoàn thành khóa luận này. Em xin gửi lời cám ơn đến: - ThS. Huỳnh Kim Diệu, Trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quí báu cho luận văn. - Cô Nguyễn Thị Huyên, phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường – Khoa Công Nghệ Môi Trường đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn này. - Ths. Lê Tiến Dũng, Phân Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên đã giúp đỡ em trong suốt thời gian làm luận văn. Chân thành cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Tp. Hồ Chí Minh Trần Kim Hùng Nguyên iv TÓM TẮT TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 3/2005. "KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum)". Đề tài được tiến hành tại - Phòng Hóa Lý - Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh và Phòng Hóa Lý-Phân Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên. - Phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường - Khoa Công Nghệ Môi Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Giáo viên hướng dẫn: TS. PHAN PHƯỚC HIỀN ThS. MAI ĐÌNH TRỊ Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) là một cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam và đã được dùng trong dân gian từ những năm 80. Theo kinh nghiệm dân gian, cây được sử dụng chữa nhiều bệnh như: trĩ nội, chảy máu, suy nhược thần kinh và thông dụng nhất là dùng để chữa những rối loạn do nhiễm khuẩn đường tiêu hóa… Nhằm khẳng định một phần những công dụng dân gian trên một cách có khoa học và tìm kiếm những cây thuốc có thể thay thế kháng sinh trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) của cây Xuân Hoa với hai chủng vi sinh vật đại diện là E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Những kết quả đạt được: - Tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật cho thấy trong lá cây Xuân Hoa chứa chủ yếu các chất hữu cơ: phytosterol, polyphenol, đường khử, hợp chất uronic và saponin… - Lá Xuân Hoa được chiết tách bằng 4 loại dung môi: etthanol, chloroform, ete dầu hỏa và n-butanol. Sau khi chiết tách tiến hành loại dung môi, thu được 4 loại cao tương ứng với bốn loại dung môi. - Sau khi thu được các loại cao, tiến hành thử nghiệm khả năng kháng hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Kết quả thu cho thấy chỉ có cao chloroform có khả năng kháng hai chủng vi sinh vật thử nghiệm với nồng độ ức chế tối thiểu lần lượt là MIC Salmonella = 340 μg/ml MIC E. coli = 330 μg/ml - Cao ete dầu hỏa sau khi tiến hành chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng thu được hợp chất S là hỗn hợp của hai chất β-Sitosterol và Stigmasterol. v MỤC LỤC Nội dung Trang Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách các từ viết tắt ix Danh sách các bảng x Danh sách các hình xi Danh sách các sơ đồ và biểu đồ xii Phần I. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích 2 1.3. Yêu cầu 2 Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) 3 2.1.1.Đặc điểm thực vật học 3 2.1.2 Đặc điểm hình thái 3 2.1.3.Thành phần hoá học 4 2.1.4.Tính chất dược lý 4 2.1.4.1.Theo kinh nghiệm dân gian 4 2.1.4.2. Tác dụng sinh học 5 2.2. Vi khuẩn đường ruột 9 2.2.1.Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột 9 2.2.1.1. Định nghĩa 9 2.2.1.2. Hình thể 9 2.2.1.3.Tính chất nuôi cấy 9 2.2.1.4.Tính chất sinh vật hoá học 9 2.2.1.5. Sức đề kháng 10 vi 2.2.1.6. Độc tố 10 2.2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên 11 2.2.1.8. Phân loại 12 2.2.1.9. Khả năng gây bệnh 13 2.3. Salmonella 13 2.3.1. Đặc điểm sinh học 14 2.3.1.1. Hình thái 14 2.3.1.2. Tính chất nuối cấy 14 2.3.1.3. Tính chất sinh vật hoá học 15 2.3.1.4. Sức đề kháng 15 2.3.1.5. Độc tố 15 2.3.1.6. Cấu tạo kháng nguyên 15 2.3.1.7. Phân loại 16 2.3.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh 16 2.3.2.1. Khả năng gây bệnh 16 2.3.2.2. Cơ chế gây bệnh thương hàn 17 2.3.2.3. Nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn 18 2.3.3. Miễn dịch 18 2.3.4. Chuẩn đoán vi sinh vật bệnh thương hàn 18 2.3.4.1 Cấy máu 18 2.3.4.2. Cấy phân 19 2.3.4.3. Chuẩn đoán gián tiếp 19 2.3.5. Phòng bệnh 20 2.3.5.1. Phương pháp phòng bệnh chung không đặc hiệu 20 2.3.5.2. Phương pháp phòng bệnh đặc hiệu 20 2.3.6. Điều trị 20 2.4. Escherichia coli 21 2.4.1. Đặc điểm sinh học 21 2.4.1.1. Hình thái 21 2.4.1.2. Tính chất nuôi cấy 21 2.4.1.3. Tính chất hoá sinh 22 vii 2.4.1.4. Sức đề kháng 22 2.4.1.5. Cấu tạo kháng nguyên 22 2.4.1.6. Phân loại 23 2.4.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh 23 2.4.3. Chuẩn đoán vi sinh vật 24 2.4.3.1. Chuẩn đoán trực tiếp 24 2.4.3.2. Chuẩn đoán gián tiếp 24 2.4.4. Phòng bệnh 24 2.4.5. Chữa bệnh 24 Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1. Vật liệu 26 3.1.1. Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 26 3.1.1.1. Nguyên liệu 26 3.1.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26 3.1.1.3. Hóa chất cần thiết 26 3.1.1.4. Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm 27 3.2. Phương pháp nghiên cứu 28 3.2.1. Xử lý nguyên liệu 28 3.2.2. Xác định độ ẩm 28 3.2.3. Xác định tro toàn phần 28 3.3. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học thực vật 28 3.3.1. Nguyên tắc 28 3.3.2. Cách tiến hành 28 3.4. Phương pháp cô lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa 34 3.4.1. Điều chế các loại cao 34 3.4.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa 34 3.4.1.2 Điều chế cao CHCl 3 34 3.4.1.3. Điều chế cao n-Butanol 34 3.4.1.4. Điều chế cao nước 34 3.4.2. Cô lập một số hợp chất trong cao ete dầu hỏa 36 3.4.3. Xác định cấu trúc của hợp chất đã cô lập được 36 viii 3.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn 36 3.5.1. Chuẩn bị môi trường 36 3.5.2. Pha loãng cao Xuân Hoa 36 3.5.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ đục 38 3.5.4. Chuẩn bị mầm cấy 38 3.5.5. Thử nghiệm 39 Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 4.1. Nguyên liệu 41 4.1.1. Xác định độ ẩm 41 4.1.2. Xác định độ tro 41 4.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 41 4.3. Cô lập một số hợp chất từ cây Xuân Hoa 43 4.3.1. Điều chế các loại cao 43 4.3.1.1.Điều chế cao ete dầu hỏa 43 4.3.1.2. Điều chế cao CHCl3 43 4.3.1.3. Điều chế cao n-butanol 43 4.3.1.4. Điều chế cao nước 43 4.3.2. Cô lập một số hợp chất từ cao ete dầu hỏa 44 4.3.3. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất S 47 4.4. Thử nghiệm vi sinh 48 Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 I. Kết luận 51 5.1. Khảo sát thành phần hóa học 51 5.2. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn 51 II. Đề nghị 51 Phụ lục 1: Phổ MS của hợp chất S 52 Phụ lục 2: Phổ IR của hợp chất S 53 Phụ lục 3: Phổ 1 H-NMR của hợp chất S 54 Phụ lục 4: Phổ 13 C của hợp chất S 55 Phụ lục 5: So sánh phổ 13 C-NMR của S với β-sitosterol và stigmasterol 56 ix CÁC TỪ VIẾT TẮT NMR : Nuclear Magnetic Resonnance, cộng hưởng từ hạt nhân. DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Tranfer. IR : Infrared, hồng ngoại. MS : Mass Spectrometry, khối phổ. J : Hằng số ghép cặp. s : Singlet, mũi đơn. d : Doublet, mũi đôi. t : Triplet, mũi ba. q : Quartet, mũi bốn. m : Multiplet, mũi đa. SGOT : Glutamic oxalacetic transaminase. SGPT : Glutamic pyruvic transaminase. LD 50 : Lethal dose - 50, liều gây chết 50% số cá thể. . 3/2005. "KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum)& quot;. Đề tài được tiến hành tại - Phòng Hóa Lý -. lập một số hợp chất từ cao ete dầu hỏa 44 4.3.3. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất S 47 4.4. Thử nghiệm vi sinh 48 Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 I. Kết luận 51 5 .1. Khảo sát thành phần. chất sinh vật hoá học 9 2.2 .1. 5. Sức đề kháng 10 vi 2.2 .1. 6. Độc tố 10 2.2 .1. 7. Cấu trúc kháng nguyên 11 2.2 .1. 8. Phân loại 12 2.2 .1. 9. Khả năng gây bệnh 13 2.3. Salmonella 13 2.3 .1.