đồng .
* Bài tập hành vi cộng đồng.
Hệ thống thí nghiệm gồm một bể nhựa trong suốt (30 x 100 cm) được ngăn thành 3 khoang, gồm khoang ở giữa (30 x 20cm), khoang phải bằng khoang trái (30 x 40 cm). Ba khoang này được nối với nhau bằng hai cửa nằm trên bề mặt sàn (10 x 10 cm). Tại khoang phải và trái có chứa một hộp lưới 10 x 10 x10 cm). Phía trên hộp lưới được đậy nắp và quây kín để tránh chuột trèo lên. Phía trên hộp nhựa 100 cm là một camera ghi lại hành vi của chuột.
Chuột thí nghiệm được đặt vào khoang giữa, và được tự do đi lại giữa các khoang trong vòng 5 phút để làm quen với môi trường mới. Sau đó chuột bị đưa vào khoang giữa. Một chuột khỏe mạnh được nhốt trong hộp lưới tại ngăn bên phải. Hộp lưới bên trái để trống. Sau đó, chuột thí nghiệm được tự do đi lại trong cả 3 khoang và tiếp xúc với chuột khỏe mạnh được nhốt trong hộp lưới tại ngăn bên phải trong vòng 10 phút. Camera theo dõi thời gian chuột ở trong mỗi ngăn.
Bài tập được thực hiện 1 lần duy nhất.
Chú ý:
- Giữa các lần tập cần lau sạch mê lộ bằng ethanol 70%. - Chuột trong hộp lưới phải cùng giới với chuột thử nghiệm.
Chỉ tiêu đánh giá: Chuột là động vật có tính cộng đồng rất cao. Chúng luôn có nhu cầu tiếp xúc với đồng loại. Hành vi này thay đổi rất lớn đối với chuột bị tự kỷ. Chuột tự kỷ có xu hướng ít tiếp xúc với đồng loại hơn, số lần vào ra các khoang giảm. Do đó, nếu cao rau đắng biển có tác dụng cải thiện tương tác xã hội, chuột sẽ có xu hướng kéo dài thời gian tiếp xúc với đồng loại.
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
- Các kết quả nghiên cứu dược lý được biểu diễn dưới dạng: giá trị trung bình cộng/ trừ độ lệch chuẩn RSD: M + RSD (M: giá trị trung bình từng lô, RSD: độ lệch chuẩn).
- Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu thành phần hóa học
3.1.1. Định tính saponin bằng các phản ứng hóa học
Quan sát hiện tương tạo bọt:
Dịch thử: hòa tan 1g cao rau đắng biển vào trong 100ml nước cất.
Lấy 5ml dịch thử cho vào ống nghiệm, lắc mạnh trong vòng 5 phút. Để yên và quan sát. Nếu cột bọt bền vững trong 30 phút thì dương tính.
Kết quả: phản ứng dương tính.
Tiến hành các phản ứng tạo màu.
- Chuẩn bị dịch thử: hòa tan 1g cao rau đắng biển vào trong 100ml ethanol
Phản ứng salkowski:
Cho vào ống nghiệm 3ml dịch thử bốc hơi cách thủy đến cắn, thêm 1ml chloroform, cho từ từ 1ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiêm. Quan sát. Nếu thấy màu đỏ tía xuất hiện ở mặt phân cách giữa 2 chất lỏng thì phản ứng dương tính.
Kết quả: phản ứng dương tính.
Phản ứng Lieberman- burchard:
Cho vào ống nghiệm 5ml dịch thử, bốc hơi cách thủy đến cắn, thêm 1ml anhydride acetic. Cho thêm 1 giọt H2SO4 đặc. Nếu thấy xuất hiện màu đỏ nâu thì phản ứng dương tính.
Kết quả: phản ứng dương tính.
Bảng 3.1 : Kết quả định tính saponin bằng các phản ứng hóa học
STT Phản ứng định tính Hiện tƣợng Kết quả
1 Quan sát hiện tượng tạo bọt Cột bọt bền vững trong
30 phút +++
2 Phản ứng Salkowski
Màu đỏ tía xuất hiện ở mặt phân cách giữa mặt
phân cách 2 chất lỏng
+++
3 Phản ứng Liberman- burchard Xuất hiện màu đỏ nâu +++
Chú thích: (+) : phản ứng dương tính
(+++) : phản ứng dương tính rất rõ
Nhận xét: cả 3 phản ứng hóa học định tính saponin đều dương tính rõ. Kết luận: cao khô phân đoạn n- butanol từ cao chiết ethanol của cây rau đắng biển chứa saponin
Phản ứng để sơ bộ phân biệt saponin steroid và saponin triterpenoid
Dịch thử: hòa tan 1g cao rau đắng biển vào trong 100ml nước cất.
Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1N, ống thứ hai 5ml NaOH 0,1N. Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dung dịch thử rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống nghiệm trong 15giây. Để yên và quan sát thấy cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền vững như nhau trong khoảng 30
phút.
Kết quả được thể hiện trong hình 3.1
Hình 3.1: Kết quả phản ứng phân biệt saponin steroid và saponin triterpenoid
Kết luận: sơ bộ xác định saponin trong cao rau đắng biển là saponin triterpenoid
3.1.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
- Dịch chấm sắc ký: 0,1g cao khô phân đoạn n- butanol từ cao chiết ethanol của cây rau đắng biển trong 10ml methanol siêu âm trong 15 phút.
- Bản mỏng: Silicagel 60 GF254(Merck), kích thước 2x10cm, hoạt hóa ở 1100
C trong 1 giờ.
- Hệ dung môi khai triển: Tham dò khả năng tách vết trên các hệ dung môi sau: Hệ 1: chloroform- methanol- nước (65:35:10)
Hệ 2: chloroform- methanol- nước ( 7:3:1) Hệ 3: ethyl acetat- acid acetic- nước (8:2:1)
Hệ 4: n- butanol- ethanol- (10:2) bão hòa nước Hệ 5: ethyl acetat- methanol- nước (7:2:1) Hệ 6: n- butanol- acid acetic- nước ( 4:1:5) Hệ 7: n- butanol- methanol- nước (4:1:1) - Phát hiện vết:
+ Quan sát dưới đèn tử ngoại có bước sóng 254 nm và 366 nm
+ Hiện màu bằng thuốc thử salkowski ( dung dịch acid sulfuric 10% trong cồn) sấy ở 1100C trong 10 phút
-Tiến hành: Chấm dịch methanol lên trên bản mỏng, sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng ra, để bay hơi hết dung môi trong tủ hốt. Phát hiện vết dưới ánh sáng tử ngoại. Sau đó phun thuốc thử hiện màu và quan sát dưới ánh sáng thường.
- Kết quả:
Kết quả thăm dò trên 7 hệ dung môi cho thấy hệ 5: ethyl acetat- methanol- nước (7:2:1) cho kết quả tách tốt nhất. Sau đó tiếp tục khai triển sắc ký cao phân đoạn n- butanol từ cao chiết ethanol cây rau đắng biển trên hệ dung môi số 5.
Hình 3.2: Sắc ký đồ cao rau đắng biển
Chú thích:
(a): ánh sáng thường (b): λ = 254nm
Bảng 3.2: Kết quả định tính bằng SKLM của cao rau đắng biển
Chú thích: (+): mờ (++): rõ ( +++): rất rõ
Nhận xét:
Sau khi thăm dò trên 7 hệ dung môi cho thấy hệ 5: ethyl acetat- methanol- nước (7:2:1) cho kết quả tách tốt nhất và dịch chấm sắc ký phân đoạn n- butanol từ cao chiết ethanol rau đắng biển khai triển với hệ 5 cho kết quả như sau:
STT Rf x100
Màu chưa phun thuốc thử Màu sau khi phun thuốc thử Ánh sáng
thường UV 254 UV 366
Ánh sáng thường 1 92 Cam(++) Đen (++) Đen(+++) Nâu (+) 2 80 Nâu đen(+) Đen (++) Đen(+++)
3 75 Nâu đen(+++) Đen (+++) Đen (+++) Nâu(++) 4 70 Nâu đen(+) Đen (++)
5 65 Nâu đen(+) Đen (++)
6 63 Xanhdương(++)
+ Khi chưa phun thuốc thử:
- Ánh sáng thường: có 5 vết (Rf x100= 92, 80, 75, 70, 65)
- Ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm: có 5 vết (Rf x100= 92, 80, 75, 70, 65) - Ánh sáng tử ngoại bước sóng 366nm: có 4 vết (Rf x100= 92, 80, 75, 63) + Khi phun thuốc thử:
- Ánh sáng thường: có 3 vết (Rf x100= 92, 75, 60) Trong các vết nhận thấy có một số vết đáng lưu ý:
Vết có Rf x100= 75 dễ quan sát thấy trong cả 4 cách hiện vết. Vết có Rf x100= 63 có màu xanh dương rõ ở bước sóng 366nm. Vết có trị số Rf x100= 60 sau khi phun thuốc thử có màu tím rõ.
3.2. Nghiên cứu tác dụng dƣợc lý
3.2.1. Đánh giá tác dụng trên khả năng vận động của chuột bằng máy đếm vận động tự nhiên hồng ngoại.
Sau khi tiến hành thử nghiệm đánh giá khả năng vận động tự nhiên , kết quả được thể hiện ở hình 3.3:
Hình 3.3: Kết quả đánh giá khả năng vận động của chuột bằng máy đếm vận động tự nhiên hồng ngoại .
Nhận xét:
Kết quả thể hiện ở hình 3.3 cho thấy: lô chứng sinh lý, các lôVPA (500 mg/kg) + BM liều 27 mg/kg và 54 mg/kg có số lần vận động theo chiều dọc cao hơn so với lô chứng bệnh lý. Trong đó
- Lô chứng sinh lý có số lần vận động theo chiều dọc cao hơn đáng kể (gấp khoảng 2,4 lần) so với lô chứng bệnh lý đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,01.
- Lô VPA (500 mg/kg) + BM liều 27 mg/kg có số lần vận động theo chiều dọc cao hơn so với lô chứng bệnh lý nhưng sự cao hơn này không có ý nghĩa thống kê ( p > 0,05).
- Lô VPA (500 mg/kg) + BM liều 54 mg/kg có số lần vận động theo chiều dọc cao hơn so với lô chứng sinh lý và cao hơn rõ rệt so với lô chứng bệnh lý ( gấp 2,8 lần) đạt ý nghĩa thống kê p < 0,001.
Như vậy, cao khô phân đoạn n- butanol từ cao chiết ethanol rau đắng biển liều 54mg/kg có tác dụng cải thiện khả năng vận động tự nhiên trên chuột tự kỷ ( p < 0.001) còn mức liều 27 mg/kg không thể hiện tác dụng, nói cách khác cao rau đắng biển có tác dụng cải thiện khả năng vận động tự nhiên trên chuột tự kỷ và tác dụng này phụ thuộc liều.
3.2.2. Đánh giá tác dụng cải thiện tương tác xã hội bằng bài tập hành vi cộng đồng.
Sau khi tiến hành thử nghiệm đánh giá khả năng tương tác xã hội trên chuột thí nghiệm bằng bài tập hành vi cộng đồng, kết quả được trình bày ở bảng 3.3:
Bảng 3.3: Kết quả đánh giá tương tác xã hội bằng bài tập hành vi cộng đồng
Lô thí nghiê ̣m
Thời gian (giây)
P so trong cùng nhóm P so với nhóm bê ̣nh lý Tiếp xúc với
chuô ̣t cùng giới
Không tiếp xúc với chuô ̣t cùng
giới Sinh lý 295,40 ± 21,95 195,20 ± 19,78 < 0,05 < 0,01 Bê ̣nh lý 159,90 ± 22,23 281,10 ± 43,85 < 0,05 - BM (27 mg/kg) 233,11 ± 36,67 221,44 ± 33,49 > 0,05 > 0,05 BM (54 mg/kg) 299,18 ± 19,25 176,73 ± 25,38 < 0,01 < 0,001 - Nhận xét:
Kết quả thể hiện ở bảng 3.3 cho thấy : lô chứng sinh lý, lô VPA (500 mg/kg) + BM liều 27 mg/kg và 54 mg/kg kéo dài thời gian tiếp xúc với chuột cùng giới và rút ngắn thời gian không tiếp xúc với chuột cùng giới so với lô chứng bệnh lý.
- Lô VPA (500 mg/kg) + BM liều 27 mg/kg: kéo dài thời gian tiếp xúc với chuột cùng giới và rút ngắn thời gian không tiếp xúc chuột cùng giới so
với lô chứng bệnh lý nhưng sự thay đổi này không có ý nghĩa thống kê ( p > 0.05)
- Lô VPA (500 mg/kg) + BM liều 54 mg/kg: kéo dài thời gian tiếp xúc với chuột cùng giới và rút ngắn thời gian không tiếp xúc chuột cùng giới so với lô chứng bệnh lý đạt ý nghĩa thống kê p<0,001.
Như vậy, cao khô phân đoạn n- butanol từ cao chiết ethanol rau đắng biển liều 54mg/kg kéo dài thời gian tiếp xúc với chuột cùng giới trên chuột tự kỷ (p < 0,001), tức cao rau đắng biển có hiệu quả tăng cường khả năng tương tác xã hội trên chuột tự kỷ và phụ thuộc liều sử dụng.
Từ kết quả của hai thử nghiệm trên cho thấy hiệu quả cải thiện hội chứng tự kỷ của cao khô phân đoạn n- butanol từ cao chiết ethanol rau đắng biển thể hiện trên hai tiêu chí là cải thiện khả năng vận động tự nhiên và tăng cường khả năng tương tác xã hội.
3.3.Bàn luận
3.3.1. Về thành phần hóa học
Từ mẫu nghiên cứu là: cao khô phân đoạn n – butanol từ cao chiết ethanol cây Rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst chúng tôi đã tiến hành định tính các hợp chất saponin bằng phản ứng hóa học và bằng sắc ký lớp mỏng.
Kết quả định tính bằng các phản ứng hóa học cho thấy các hợp chất saponin trong mẫu nghiên cứu là các saponin tritepenoid. Kết quả nghiên cứu thu được cũng giống với nhiều công trình nghiên cứu thành phần hóa học chứng minh các hợp chất saponin của rau đắng biển thuộc nhóm saponin tritepenoid [21][27].
Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng: sau khi tiến hành thăm dò trên 7 hệ dung môi, chúng tôi nhận thấy hệ dung môi ethyl acetat- methanol- nước (7:2:1) cho kết quả tách tốt nhất. Sắc ký đồ của mẫu nghiên cứu được khai triển trên hệ dung môi này có 7 vết, trong đó đáng chú ý là vết số 7có trị số Rf x100 = 0,6 có màu tím rõ sau khi hiện màu (bằng thuốc thử là dung dịch acid sulfuric 10% trong cồn, sấy ở 1100C trong 10 phút) có thể là vết hợp chất bacosid trong mẫu nghiên cứu.
Kết quả nghiên cứu này đã góp phần xây dựng tiêu chuẩn cho cao khô phân đoạn n – butanol từ cao chiết ethanol cây Rau đắng biển.
3.3.2. Về tác dụng dược lý
Khả năng cải thiện hội chứng tự kỷ của phân đoạn n – butanol từ cao chiết ethanol cây Rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã dùng 2 thử nghiệm, bao gồm bài tập hành vi cộng đồng để đánh giá khả năng tương tác xã hội và thử nghiệm đánh giá khả năng vận động tự nhiên trên mô hình chuột tự kỷ. Kết quả từ hai mô hình dược lý thực nghiệm sử dụng trong nghiên cứu cho thấy phân đoạn n – butanol từ cao chiết ethanol cây Rau đắng biển có tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ thể hiện trên 2 tiêu chí:
- Trên khả năng vận động
Kết quả thử nghiệm cho thấy, sau khi uống BM ở cả hai mức liều 27 mg/kg và 54 mg/kg chuột đều tăng số lần vận động theo chiều dọc so với lô chứng bệnh lý nhưng ở mức liều 27 mg/kg sự tăng số lần vận động theo chiều dọc so với lô chứng bệnh lý là không có ý nghĩa thống kê, với mức liều 54 mg/kg làm tăng đáng kể số lần vận động theo chiều dọc ( gấp 2,8 lần) so với lô chứng bệnh lý đạt ý nghĩa thống kê p< 0,001. Như vậy, cao rau đắng biển ở mức liều 54 mg/kg có tác dụng cải thiện khả năng vận động còn mức liều 27 mg/kg thì chưa thể hiện tác dụng. Nói cách khác, cao rau đắng biển có tác dụng cải thiện khả năng vận động và tác dụng phụ thuộc liều sử dụng.
- Trên khả năng tương tác xã hội
Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 28 ngày uống BM ở cả hai mức liều 27 mg/kg và 54 mg/kg lô thử nghiệm kéo dài thời gian tiếp xúc với chuột cùng giới và rút ngắn thời gian không tiếp với chuột cùng giới so với lô chứng bệnh lý nhưng ở mức liều 27 mg/kg sự thay đổi này không đáng kể ( p > 0,05), sự thay đổi do mức liều 54 mg/kg đạt ý nghĩa thống kê là p< 0,001. Như vậy, có thể thấy cao rau đắng biển thể hiện tác dụng cải thiện khả năng tương tác xã hội ở mức liều 54 mg/kg còn với mức liều 27 mg/kg thì tác dụng này không thể hiện. Cao rau đắng biển có tác dụng cải thiện khả năng tương tác xã hội và tác dụng phụ thuộc
liều dùng.
Kết quả nghiên cứu dược lý đề tài thu được cũng phù hợp với một số công trình nghiên cứu chứng minh tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ của rau đắng biển trên thế giới[29].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng mô hình gây tự kỷ cho chuột bằng Valproate (VPA) - Valproate (VPA) hiện nay cũng được sử dụng phổ biến trên thế giới để gây mô hình bệnh tự kỷ trên động vật[10][29]. Mặt khác, dựa trên nhiều côn trình nghiên cứu chứng minh các tác dụng dược lý của cây rau đắng biển chủ yếu là do các hợp chất saponin có trong loài thực vật này vì thế chúng tôi sử dụng phân đoạn n – butanol từ cao chiết ethanol cây Rau đắng biển nhằm làm giàu hợp chất saponin trong mẫu nghiên cứu để thử tác dụng sinh học. Kết quả cao khô phân n – butanol từ cao chiết ethanol cây Rau đắng biển thể hiện tác