Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của lá trâm mốc (folium syzygii cuminii (l ) skeels, myrtaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - LÊ NGỌC DANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ TRÂM MỐC (Folium Syzygii cuminii (L.) Skeels, Myrtaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - LÊ NGỌC DANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ TRÂM MỐC (Folium Syzygii cuminii (L.) Skeels, Myrtaceae) Chuyên ngành: Dược học cổ truyền Mã số: 60 72 04 06 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS VÕ VĂN LẸO Thành phố Hồ Chí Minh – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc i TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học – Năm học 2015 – 2017 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ TRÂM MỐC (Folium Syzygii cuminii (L.) Skeels) Lê Ngọc Danh Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Văn Lẹo Đặt vấn đề Trâm mốc, dân gian hay gọi Vối rừng có tên khoa học Syzygium cumini (L.) Skeels, họ Sim (Myrtaceae), loại mọc hoang trồng vườn làm cảnh, người dân hay dùng trái để ăn, vỏ thân, vỏ cành dùng chữa đau bụng, đầy chướng, táo bón, ăn khơng tiêu, nơn mửa, lỵ, tiêu chảy,… Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dược lý Trâm mốc Đối tượng nghiên cứu Lá Trâm mốc, thu hái huyện Củ Chi,TP Hồ Chí Minh vào tháng 10/2016 Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa cao chiết phân đoạn chất phân lập mơ hình đánh bắt gốc tự DPPH Sử dụng phương pháp chiết xuất, phân bố lỏng – lỏng, sắc ký cột chân không phương pháp tinh chế để phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa mạnh qua sàng lọc Xác định cấu trúc chất phân lập dựa vào liệu khối phổ phổ NMR Kết bàn luận Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa cao phân đoạn phương pháp đánh bắt gốc tự DPPH Thử nghiệm DPPH đo bước sóng λmax 517 nm sau thời gian phản ứng 30 phút Kết cho thấy khả chống oxy hóa cao giảm dần theo thứ tự sau: cao ethyl acetat (HTCO 94,50 %) > cao nước (HTCO 20,58 %) > cao cồn ii (HTCO 18,09 %) > cao cloroform (HTCO 14,87 %) > cao n-hexan (HTCO 6,45 %) Do cao ethyl acetat chọn để khảo sát tiếp thành phần hóa học Chiết xuất – phân lập chất xác định cấu trúc Bột Trâm mốc (10 kg) chiết ngấm kiệt với cồn 80 % thu cao cồn (3,45 kg) Từ cao cồn, chiết phân bố lỏng – lỏng với dung môi thu cao n-hexan (17,6 g), cao cloroform (81,06 g) cao ethyl acetat (236,26 g) Từ 100 g cao ethyl acetat, kỹ thuật sắc ký cột chân không (VLC) phân lập acid ellagic (502,3 mg), acid gallic (40,31 mg), myricetin (11,25 mg), bergenin (509,17 mg) myricitrin (43,0 mg) IC50 chất phân lập cao ethyl acetat xác định so sánh với acid ascorbic, kết sau: myricitrin (3,834 µg/ml) < acid ascorbic (2,454 µg/ml) < cao ethyl acetat (2,273 µg/ml) < myricetin (1,589 µg/ml) < acid ellagic (0,755 µg/ml) < acid gallic (0,656 µg/ml) Riêng bergenin khơng có hoạt tính chống oxy hóa Như khả chống oxy hóa theo thứ tự sau: acid gallic (0,656 µg/ml) > acid gllagic (0,755 µg/ml) > myricetin (1,589 µg/ml) > cao ethyl acetat (2,273 µg/ml) > acid ascorbic (2,454 µg/ml) > myricitrin (3,834 µg/ml) Kết luận Từ cao ethyl acetat thu chất tinh khiết acid ellagic, acid gallic, myricetin, bergenin myricitrin Trong đó, có chất acid ellagic, acid gallic, myricetin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh so với chất đối chiếu acid ascorbic Các kết nghiên cứu thu từ Luận văn cịn góp phần nâng cao giá trị sử dụng Trâm mốc vào mục đích chữa bệnh giúp định hướng cho nghiên cứu hóa học tác dụng dược lý sau iii Thesis of master of pharmacy, course: 2015 – 2017 Major: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy BIOACTIVE-GUIDED ISOLATION FOR THE ANTIOXIDANT CONSTITUENTS OF SYZYGUIM CUMINI Le Ngoc Danh Supervisor: Dr Vo Van Leo Introduction Syzygium cumini (L.) Skeels belongs to the family Myrtaceae It has not been used as a medicine in Vietnam, but in Mediterranean, its leaves have been often used for the treatment of stomachache, flatulent, constipation, vomit, dysentery and diarrhea The reports showed the leaf contains flavonoids, tannin, such as myricitrin, myricetin, acid ellagic, acid gallic In Vietnam, there is no research on the chemical compositions and the pharmacological activities of the leaves of this plant As a result, our aim in this research is to isolate substances for the antioxidant acitivity on DPPH of the folium Syzygii cuminii (L.) Skeels Materials: Folium Syzygii cuminii (L.) Skeels, collected in October, 2016 Methods In-vitro screening of fractions and isolated compounds for the antioxidant activity on DPPH assay Distribution of liquid-liquid extraction, vacuum liquid chromatography and other refined methods for the isolated compounds and fractions having strong antioxidant effects Structure elucidation was based on NMR and MS method Results and discussions Screening the antioxidant activity in-vitro by DPPH assay DPPH method was performed at λmax 517 nm after the reaction of 30 minutes The results showed that the antioxidant activity of extracts was as follows: ethyl acetate extract (94,50 %) > water extract (20,58 %) > chloroform extract (14,87 %) > nhexane extract (6,45 %) Therefore, ethyl acetate extract was chosen for isolation later iv Extraction, isolation and structure elucidation 10 kg of the leaves powder of Syzygium cumini (L.) Skeels was extracted with 80 % alcohol to obtain 3,45 kg of extract Alcohol extract was successively portioned with solvents to obtain n-hexane extract (17,6 g), chloroform extract (81,06 g) and ethyl acetate extract (236,26 g) From 100 g of the ethyl acetat extract, by vacuum liquid chromatography, substances were obtained: acid ellagic (502,3 mg), acid gallic (40,31 mg), myricetin (11,25 mg), bergenin (509,17 mg) and myricitrin (43,0 mg) IC50 values of isolated substances and ethyl acetate extract comparing with ascorbic acid were as follows: myricitrin (3,834 µg/ml) < acid ascorbic (2,454 µg/ml) < cao ethyl acetat (2,273 µg/ml) < myricetin (1,589 µg/ml) < acid ellagic (0,755 µg/ml) < acid gallic (0,656 µg/ml) Bergenin has no effect Therefore, their antioxidant activities were as follows: acid gallic (0,656 µg/ml) > acid ellagic (0,755 µg/ml) > myricetin (1,589 µg/ml) > cao ethyl acetat (2,273 µg/ml) > acid ascorbic (2,454 µg/ml) > myricitrin (3,834 µg/ml) Conclusion Acid ellagic, acid gallic, myricetin, bergenin and myricitrin were obtained from ethyl acetate extract Among them, the antioxidant effect of acid ellagic, acid gallic, myricetin is stronger than ascorbic acid The results also support the value of Syzygium cumini (L.) Skeels in healing purposes and help for the further researches on chemical analyses and pharmacological effects in the future v LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Dược Bộ môn Dược Liệu - Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện, tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức kinh nghiệm q báu để em hồn thành tốt Luận văn Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy TS Võ Văn Lẹo Thầy ln quan tâm, tận tình bảo em q trình thực em cịn nhiều thiếu sót Thầy giúp em có thêm niềm đam mê với nghiên cứu khoa học truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm sống để em tiếp tục theo đuổi ước mơ Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy TS Nguyễn Viết Kình, tận tình giảng giải, giúp đỡ cho em phần biện luận phổ NMR, thầy cho em thấy cách làm việc tư khoa học, rõ ràng, trách nhiệm với cơng việc làm Xin gởi lời cảm ơn đến ThS Huỳnh Lời, ThS Lê Văn Huấn ln giúp đỡ tơi gặp khó khăn Xin gởi lời cảm ơn đến DS Trần Anh Tú đồng hành với tơi suốt q trình thực Luận văn Xin gởi lời cảm ơn đến chị Liên, chị Xuyến, chị Châu, chị Lan, chị Giang tạo điều kiện tốt cho suốt trình thực Luận văn Xin cảm ơn tất bạn lớp cao học Dược học cổ truyền khóa 2015 – 2017 động viên, giúp đỡ chia sẻ vui buồn suốt trình học tập vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .v MỤC LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC CÁC HÌNH xii ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC .3 1.1.1 Đặc điểm họ Myrtaceae (Họ Sim) .3 1.1.2 Đặc điểm thực vật học Trâm mốc 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 Tổng quan thành phần hóa học chi Syzygium 1.2.2 Tổng quan thành phần hóa học Syzygium cumini 13 1.3 TÁC DỤNG VÀ CÔNG DỤNG CỦA CÂY TRÂM MỐC 17 1.3.1 Tác dụng dược lý 17 1.3.2 Thử độc tính .21 1.3.3 Tính vị, cơng 21 1.3.4 Công dụng 21 1.3.5 Bài thuốc có Trâm mốc 21 1.4 TỔNG QUAN VỀ GỚC TỰ DO VÀ HOẠT TÍNH CHỚNG OXY HĨA .22 1.4.1 Đại cương gốc tự 22 1.4.2 Bản chất hóa học gốc tự 23 1.4.3 Sự liên quan gốc tự bệnh tật người 23 1.4.4 Các chất chống oxy hóa 25 1.4.5 Tác động chống oxy hóa flavonoid 26 1.4.6 Thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro 26 1.4.7 Thử nghiệm đánh giá khả đánh bắt gốc tự DPPH .27 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 vii 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 29 2.1.1 Nguyên liệu 29 2.1.2 Nơi thực đề tài 29 2.1.3 Dung mơi hóa chất .29 2.1.4 Dụng cụ, trang thiết bị 29 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.2.2 Nghiên cứu thực vật học 31 2.2.3 Thử tinh khiết 31 2.2.4 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 32 2.2.5 Chiết xuất cao toàn phần 32 2.2.6 Tách phân đoạn chiết phân bố lỏng – lỏng .33 2.2.7 Phương pháp sàng lọc tác dụng chống oxy hóa mơ hình in vitro .33 2.2.8 Phân lập tinh chế chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa .34 2.2.9 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập .36 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38 3.1 NGHIÊN CỨU THỰC VẬT HỌC 38 3.1.1 Đặc điểm hình thái Trâm mốc 38 3.1.2 Vi phẫu Trâm mốc 38 3.1.3 Tách biểu bì 43 3.1.4 Soi bột .43 3.2 THỬ TINH KHIẾT 44 3.3 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 44 3.3.1 Khảo sát sơ thành phần hóa thực vật 44 3.3.2 Chiết xuất phân lập chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa 49 3.3.3 Kiểm tra khả chống oxy hóa cao chiết phân đoạn 52 3.3.4 Phân lập chất từ cao ethyl acetat VLC 54 3.3.5 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập SKLM 58 3.3.6 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập UPLC .60 3.3.7 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập .65 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 20 Phụ lục 18 Phổ DEPT-NMR SY-4 đo DMSO-d6 (125 MHz) Phổ DEPT SY-4 Phổ DEPT SY-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 21 Phụ lục 19 Phổ HMBC-NMR SY-4 đo DMSO-d6 Phổ HMBC SY-4 Phổ HMBC SY-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 22 Phổ HMBC SY-4 Phổ HMBC SY-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 23 Phụ lục 20 Phổ HSQC-NMR SY-4 đo DMSO-d6 Phổ HSQC SY-4 Phổ HSQC SY-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 24 Phụ lục 21 Phổ COSY-NMR SY-4 đo DMSO-d6 Phổ COSY-NMR SY-4 đo DMSO-d6 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 25 Phụ lục 22 Phổ 13C-NMR SY-5 đo DMSO-d6 (125 MHz) Phổ 13C SY-5 Phổ 13C SY-5 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 26 Phổ 13C SY-5 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 27 Phụ lục 23 Phổ DEPT-NMR SY-5 đo DMSO-d6 (125 MHz) Phổ DEPT SY-5 Phổ DEPT SY-5 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 28 Phụ lục 24 Phổ HMBC-NMR SY-5 đo DMSO-d6 Phổ HMBC SY-5 Phổ HMBC SY-5 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 29 Phổ HMBC SY-5 Phổ HMBC SY-5 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 30 Phổ HMBC SY-5 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 31 Phụ lục 25 Phổ HSQC-NMR SY-5 đo DMSO-d6 Phổ HSQC SY-5 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 32 Phổ HSQC SY-5 Phổ HSQC SY-5 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 33 Phụ lục 26 Phổ COSY-NMR SY-5 đo DMSO-d6 Phổ COSY SY-5 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 34 Phổ COSY SY-5 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... sử dụng với đề tài mang tên: “Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa Trâm mốc (Folium Syzygii cuminii (L. ) Skeels, Myrtaceae) ” với mục tiêu sau: - Thử tác dụng chống oxy hóa. .. BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - LÊ NGỌC DANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ TRÂM MỐC (Folium Syzygii cuminii (L. ) Skeels, Myrtaceae) Chuyên ngành:... thạc sĩ dược học – Năm học 2015 – 2017 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ TRÂM MỐC (Folium Syzygii cuminii (L. ) Skeels) Lê Ngọc Danh Người hướng dẫn khoa học: TS Võ