nghiên cứu phân lập, tinh chế acid salvianolic b từ rễ đan sâm để làm nguyên liệu thiết lập chuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BẠCH THỊ THẮM NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TINH CHẾ ACID SALVIANOLIC B TỪ RỄ ĐAN SÂM ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BẠCH THỊ THẮM NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TINH CHẾ ACID SALVIANOLIC B TỪ RỄ ĐAN SÂM ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đoàn Cao Sơn HÀ NỘI 2020 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn tới giáo viên hướng dẫn PGS.TS Đoàn Cao Sơn -Viện trưởng, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Bộ Y tế, người thầy trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian tâm huyết giúp tơi hồn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, phòng Quản lý đào tạo sau đại học, mơn Hóa phân tích trường Đại học Dược Hà Nội thầy cô trực tiếp giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập trường trình thực luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn ThS Nguyễn Tuấn Anh, ThS Trần Thị Thu Trang người giúp đỡ trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc đồng nghiệp Khoa Kiểm nghiệm Đông dược Dược liệu - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp cách thuận lợi Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ủng hộ động viên tơi suốt q trình học tập vừa qua Hà Nội, ngày 26 tháng năm 2020 Học viên Bạch Thị Thắm MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .3 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Tổng quan dược liệu Đan sâm .3 1.1.2 Tổng quan acid salvianolic B 1.2 Vài nét chất đối chiếu (chất chuẩn) 1.3 Tổng quan phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế 1.3.1 Vài nét chiết xuất dược liệu 1.3.2 Vài nét phân lập tinh chế 1.4 Tình hình chiết xuất, phân lập tinh chế acid Salvianolic B .8 1.4.1 Tình hình nghiên cứu acid salvianolic B giới .8 1.4.2 Tình hình nghiên cứu acid salvianolic B nước .10 1.5.Vài nét phân tích định tính, định lượng acid salvianolic B 12 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu .14 2.2 Nguyên vật liệu 14 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ .14 2.2.2 Dung mơi, hóa chất, chất chuẩn 15 2.3 Nội dung nghiên cứu 16 2.3.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu Đan sâm .16 2.3.2 Phân lập tinh chế acid salvianolic B 16 2.3.3 Xác định cấu trúc, định danh xác định hàm lượng 16 2.3.4 Xây dựng thẩm định phương pháp HPLC định tính, định lượng acid salvianolic B .16 2.3.5 Xây dựng thẩm định phương pháp HPLC xác định giới hạn tạp chất liên quan acid salvianolic B 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Phương pháp kiểm tra chất lượng nguyên liệu Đan sâm 16 2.4.2 Phân lập tinh chế acid salvianolic B 16 2.4.3 Xác định cấu trúc chất tinh chế 18 2.4.4 Xác định hàm lượng acid salvianolic B tinh chế .18 2.4.5 Xác định giới hạn tạp chất liên quan acid salvianolic B tinh chế 20 2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 21 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22 3.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu Đan sâm 22 3.1.1 Mô tả .22 3.1.2 Định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng 22 3.1.3 Định tính, định lượng acid salvianolic B phương pháp HPLC .23 3.2 Xây dựng quy trình phân lập, tinh chế AS-B từ dược liệu Đan sâm 25 3.2.1 Xây dựng quy trình chiết xuất AS-B từ dược liệu Đan sâm 25 3.2.2 Xây dựng quy trình chiết lỏng-lỏng 25 3.2.3 Xây dựng quy trình phân lập acid salvianolic B 27 3.2.4 Tinh chế 36 3.3 Xác định cấu trúc nhận dạng chất tinh chế 39 3.3.1 Tính chất 39 3.3.2 Phổ hồng ngoại 39 3.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 40 3.3.4 Phổ khối 44 3.4 Xác định độ tinh khiết AS-B tinh chế .46 3.4.1 Xây dựng thẩm định phương pháp định tính, định lượng AS-B tinh chế HPLC 46 3.4.2 Xác định giới hạn tạp chất liên quan acid salvianolic B tinh chế 56 CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN 63 4.1 Về quy trình chiết xuất, phân lập acid salvianolic B từ dược liệu Đan sâm 63 4.2 Về xác định cấu trúc nhận dạng chất tinh chế 64 4.3 Về định tính, định lượng, giới hạn tạp chất liên quan acid salvianolic B tinh chế phương pháp HPLC 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril AS-B Acid salvianolic B BuOH Butanol BP Dược điển Anh 13 13-Carbon nuclear magnetic resonance (Phổ carbon) C-NMR CHCl3 Cloroform C18 Octadecyl silance silica CP Chinese Pharmacopeia (Dược điển Trung Quốc) DAD Diod Array Detector DĐVN Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxide EtOAc Ethyl acetat HLPC Proton nuclear magnetic resonance (Phổ hydro) High Performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) IR Infrared Spectrophotometry (Phổ hấp thụ hồng ngoại) LC-MS Liquid chromatography - Mass Spectometry (Sắc ký lỏng khối phổ) LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of Quantitation (Giới hạn định lượng) MeOH Methanol NMR PA nuclear magnetic resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) Pure Analysis (Đạt tinh khiết phân tích) RP Reversed phase (Pha đảo) RSD Realative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) SKĐ Sắc ký đồ TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) USP United State Pharmacopeia (Dược điển Mỹ) UV-VIS Tử ngoại – khả kiến VKNTTW Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương World Health Organization (Tổ chức y tế giới) H-NMR WHO DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1: Một số điều kiện định tính acid salvianolic B TLC 12 Bảng 1.2: Một số điều kiện định tính định lượng acid salvianolic B 13 HPLC Bảng 2.1: Các dung mơi hóa chất sử dụng đề tài 15 Bảng 2.2: Các chuẩn sử dụng đề tài 15 Bảng 2.3: Các phương pháp phân tích AS-B sử dụng đề tài 18 Bảng 3.1: Cách chuẩn bị dung dịch chuẩn AS-B 24 Bảng 3.2: Kết tính thích hợp hệ thống định lượng AS-B dược liệu 24 Bảng 3.3: Kết định lượng AS-B dược liệu 25 Bảng 3.4: Kết định lượng AS-B mẫu thử (cắn A) 34 Bảng 3.5: Kết định lượng AS-B mẫu thử (cắn B) 35 Bảng 3.6: Kết kiểm tra khả lặp lại quy trình phân lập 36 Bảng 3.7: Độ lặp lại trình tinh chế 38 Bảng 3.8: Tổng hợp kết đo phổ 1H-NMR 43 Bảng 3.9: Thời gian lưu acid salvianolic B độ đặc hiệu 49 Bảng 3.10: Kết khảo sát độ thích hợp hệ thống 50 Bảng 3.11: Kết khảo sát khoảng tuyến tính 51 Bảng 3.12: Kết độ 52 Bảng 3.13: Kết độ lặp lại 53 Bảng 3.14: Kết độ ổn định hệ thống độ xác trung gian 53 Bảng 3.15 Kết khảo sát độ xác trung gian 54 Bảng 3.16 Kết khảo sát độ xác 54 Bảng 3.17: Kết xác định hàm lượng AS-B tinh chế 55 Bảng 3.18: Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký 58 Bảng 3.19: Kết xác định LOD 60 Bảng 3.20: Kết giá trị đáp ứng mẫu thử nồng độ LOD 61 Bảng 3.21: Kết xác định hàm lượng tạp chất 62 DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1: Hình ảnh dược liệu Đan sâm Hình 1.2: Cấu trúc số diterpenoid Hình 1.3: Cấu trúc số acid phenolic Hình 1.4: Công thức cấu tạo acid salvianolic B Hình 1.5: Sơ đồ dự kiến phân lập tinh chế acid salvianolic B 11 Hình 3.1: Hình ảnh dược liệu Đan sâm (mẫu nghiên cứu) 22 Hình 3.2: Hình ảnh sắc ký lớp mỏng định tính Đan sâm 22 Hình 3.3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn (a) mẫu thử (b), kết chồng phổ 23 DAD (c) Hình 3.4: Hình ảnh TLC khảo sát phân bố AS-B pha dung mơi 26 Hình 3.5: Hình ảnh TLC khảo sát điểm pH acid hóa dung dịch chiết nước 27 Hình 3.6: Hình ảnh TLC khảo sát dung mơi sắc ký cột pha thuận 28 Hình 3.7: Hình ảnh TLC khảo sát tỷ lệ dung môi cho sắc ký cột pha đảo 29 Hình 3.8: Sắc ký đồ phân đoạn khơng phát có mặt AS-B 30 Hình 3.9: Sắc ký đồ phân đoạn có xuất vết AS-B 31 Hình 3.10: Sắc ký đồ TLC so sánh F1, F2, F3 31 Hình 3.11: Sắc ký đồ phát có mặt AS-B phân lập tinh 33 Hình 3.12: Sắc ký đồ HPLC cắn A dung dịch chuẩn acid salvianolic B 34 Hình 3.13: Sắc ký đồ HPLC cắn B dung dịch chuẩn acid salvianolic B 35 Hình 3.14: Hình ảnh TLC khảo sát dung môi rửa giải qua cột pha đảo 36 Hình 3.15: Sắc ký đồ phát có mặt AS-B lọ giai đoạn 37 tinh chế Hình 3.16: Sơ đồ tóm tắt q trình chiết xuất phân lập AS-B đề tài 39 Hình 3.17: Phổ IR mẫu thử mẫu chuẩn acid salvianolic B 40 Hình 3.18: Phổ 1H-NMR acid salvianolic B chuẩn (MeOH-d4, 41 500Mhz) Tên hình Hình 3.19: Phổ 13C-NMR acid salvianolic B chuẩn (MeOH-d4, Trang 41 125Mhz) Hình 3.20: Phổ 1H – NMR chất tinh chế (MeOH-d4, 500Mhz) 42 Hình 3.21: Phổ 13C – NMR chất tinh chế (MeOH-d4, 125Mhz) 42 Hình 3.22: Cơng thức cấu tạo phân tử acid salvianolic B 44 Hình 3.23: Phổ khối mẫu chuẩn acid salvianolic B chất tinh chế 45 Hình 3.24: Sắc ký đồ độ đặc hiệu phương pháp định lượng AS-B 48 Hình 3.25: Kết so phổ cắn tinh chế với chuẩn acid salvianolic B 49 Hình 3.26: Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp 58 Hình 3.27: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữ nồng độ diện 59 tích pic AS-B Hình 3.28: Sắc ký đồ mẫu thử tạp chất liên quan 61 Sắc ký đồ thẩm định quy trình định tính, định lƣợng AS-B Sắc ký đồ thẩm định phƣơng pháp xác định giới hạn tạp chất Phụ lục III: Chuyên luận Đan sâm (DĐVN V) ... lập, tinh chế acid salvianolic B từ rễ Đan sâm để làm nguyên liệu thiết lập chuẩn? ?? với mục tiêu: - Phân lập tinh chế acid salvianolic B từ dược liệu Đan sâm để làm nguyên liệu thiết lập chuẩn. . .B? ?? GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO B? ?? Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI B? ??CH THỊ THẮM NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TINH CHẾ ACID SALVIANOLIC B TỪ RỄ ĐAN SÂM ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN LUẬN VĂN... lớn để phân lập tinh chế hoạt chất tan nước khác [19] Năm 2010, Hyoung Jae Lee nghiên cứu phân lập tinh chế acid salvianolic B từ rễ Đan sâm quy mô 200 gam rễ đan sâm/ lần chiết Đầu tiên rễ Đan sâm