Xây dựng phương pháp bán định lượng acid salvianolic b trong cao đan sâm bằng HPTLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ QUỲNH Mã sinh viên: 1201499 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP BÁN ĐỊNH LƯỢNG ACID SALVIANOLIC B TRONG CAO ĐAN SÂM BẰNG HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ QUỲNH Mã sinh viên: 1201499 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP BÁN ĐỊNH LƯỢNG ACID SALVIANOLIC B TRONG CAO ĐAN SÂM BẰNG HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Thuận Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới T.S Nguyễn Thị Thuận - người trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình, tạo điều kiện cho suốt trình thực hoàn thành khóa luận Tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới: Tập thể giảng viên, kỹ thuật viên môn Hóa Dược hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện giúp hoàn thành khóa luận Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất, Viện Công nghệ Dược phẩm hỗ trợ trang thiết bị, máy móc giúp hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà trường, giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội, người dìu dắt suốt năm học qua Cuối xin cảm ơn đến gia đình, người thân bạn bè bên quan tâm chăm sóc, giúp đỡ hoàn thành khóa học Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày 19 tháng năm 2017 Sinh viên Lê Thị Quỳnh MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đan sâm 1.1.1 Cây Đan sâm 1.1.2 Dược liệu Đan sâm 1.1.3 Cao Đan sâm 1.1.4 Acid Salvianolic B 1.1.4.1 Công thức cấu tạo 1.1.4.2 Tính chất 1.1.4.3 Tác dụng 1.1.5 Một số nghiên cứu định tính, định lượng acid Salvianolic B 1.2 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 1.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 1.2.2 Các bước tiến hành định lượng sắc ký lớp mỏng 1.2.3 Sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) 10 1.2.4 Ứng dụng HPTLC 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu 12 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.2 Nguyên vật liệu hóa chất 12 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Khảo sát xây dựng phương pháp 13 2.3.2 Thẩm định phương pháp 14 2.3.3 Phân tích mẫu cao thị trường 17 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 17 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích 18 3.1.1 Khảo sát hệ dung môi pha động 18 3.1.2 Khảo sát bước sóng phát 20 3.1.3 Quy trình bán định lượng acid Salvianolic B cao Đan sâm 22 3.2 Thẩm định phương pháp 24 3.2.1 Thẩm định phương pháp với detector videoscan 24 3.2.2 Thẩm định phương pháp với detector densitometer 29 3.2.3 So sánh với phương pháp HPLC theo Dược điển Trung Quốc 33 3.3 Ứng dụng phương pháp để kiểm tra sơ số mẫu cao thu thị trường 34 3.4 Bàn luận 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội nhà hóa phân tích thống C Nồng độ dung dịch EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol HL Hàm lượng HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao LOD Giới hạn phát (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) MeOH Methanol r Hệ số tương quan R Độ thu hồi Rf Hệ số lưu giữ RSD Độ lệch chuẩn tương tối (Relative Standard Deviation) S Diện tích S/N Tín hiệu/nhiễu (Signal/Noise) SAL B Acid Salvianolic B TB Trung bình TCCS Tiêu chuẩn sở TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TW Trung ương UV Tử ngoại (Ultraviolet) VIS Khả kiến (Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các phương pháp định tính, định lượng SAL B dược liệu Bảng 1.2 Bảng so sánh vài thông số HPTLC TLC 11 Bảng 2.1 Các mẫu cao Đan sâm thu thập 12 Bảng 3.1 Kết đánh giá đường chuẩn SAL B - videoscan 26 Bảng 3.2 Độ lặp lại - videoscan 28 Bảng 3.3 Độ thu hồi - videoscan 28 Bảng 3.4 Kết đánh giá đường chuẩn SAL B - densitometer 30 Bảng 3.5 Độ lặp lại - densitometer 32 Bảng 3.6 Độ thu hồi - densitometer 32 Bảng 3.7 Kết hàm lượng SAL B mẫu cao IE phương pháp HPLC 33 Bảng 3.8 Kết hàm lượng SAL B mẫu cao IE phương pháp HPTLC 34 Bảng 3.9 Kết phân tích số mẫu cao thị trường 35 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây rễ Đan sâm Hình 1.2 Công thức cấu tạo acid Salvianolic B Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu 14 Hình 3.1 Kết khảo sát dung môi pha động – mỏng GF254 19 Hình 3.2 Khảo sát hệ pha động mỏng HPTLC 20 Hình 3.3 Khảo sát pha động 6’ HPTLC 20 Hình 3.4 Khảo sát bước sóng phát 21 Hình 3.5: Độ hấp thụ dung dịch chuẩn bước sóng 250 – 320 nm 22 Hình 3.6: Độ hấp thụ vết chuẩn bước sóng 320 – 350 nm 22 Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn bước sóng 314 nm 22 Hình 3.8 Kết thử độ đặc hiệu 24 Hình 3.9 Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu detector videosan 25 Hình 3.10 Vết sắc ký đường chuẩn 25 Hình 3.11: Kết đánh giá khoảng nồng độ hồi quy SAL B-videoscan 26 Hình 3.12 Vết sắc ký xác định LOD, LOQ 27 Hình 3.13 Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ – detecter videoscan 27 Hình 3.14 Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu detector densitometer 30 Hình 3.15: Kết đánh giá khoảng nồng độ hồi quy SAL B - densitometer 31 Hình 3.16 Sắc ký đồ khảo sát LOD, LOQ – densitometer 31 Hình 3.17 Hình ảnh sắc ký đồ mẫu thử chuẩn phương pháp HPLC 33 Hình 3.18 Hình ảnh vết sắc ký mẫu cao phân tích thị trường 35 Hình 3.19 Cách tính diện tích pic phương pháp HPLC HPTLC 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Đan sâm biết đến với tác dụng chống đông, giãn mạch, kháng khuẩn chống viêm Ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam số nước châu Á khác, vị thuốc sử dụng phổ biến từ lâu dạng thuốc y học cổ truyền Hiện Việt Nam nhu cầu sử dụng thuốc có thành phần Đan sâm không ngừng gia tăng, kể điều trị số bệnh viện lớn Trên thị trường, trừ chế phẩm thuốc sắc, ngâm rượu dùng nguyên dược liệu, chế phẩm có Đan sâm chủ yếu dùng dạng cao Đan sâm Trong đó, Việt Nam lại chưa có tiêu chuẩn quy định kiểm nghiệm cao Đan sâm Vì vậy, cần có phương pháp phù hợp để kiểm tra chất lượng nguyên liệu đầu vào Acid Salvianolic B (SAL B) hợp chất Đan sâm Cùng với phenol diterpen khác có Đan sâm, SAL B có vai trò quan trọng hiệu điều trị Đan sâm Vì vậy, Việc xác định hàm lượng SAL B có ý nghĩa quan trọng công tác kiểm tra chất lượng cao Đan sâm Do đó, với mục đích xác định nhanh hàm lượng SAL B cao nguyên liệu tiến tới xa xác định hàm lượng SAL B chế phẩm có Đan sâm thị trường, tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp bán định lượng acid Salvianolic B cao Đan sâm HPTLC” với mục tiêu chính: Xây dựng phương pháp bán định lượng acid Salvianolic B cao Đan sâm phương pháp HPTLC với detector: videoscan densitometer Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để xác định sơ hàm lượng SAL B số mẫu cao chế phẩm thu thị trường CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đan sâm 1.1.1 Cây Đan sâm Tên khoa học: Salvia miltiorhiza Bunge Đan sâm loài thuộc Chi Salvia, Họ hoa môi Lamiaceae, Bộ Lamiales Tên khác: Xích sâm, Huyết sâm, Huyết Sở dĩ có tên rễ giống sâm mà lại có màu đỏ (Đan đỏ) [2], [8] Cây có nguồn gốc từ Trung Quốc, di thực vào nước ta Hiện gây giống Hình 1.1: Cây rễ Đan sâm Tam Đảo [8]  Đặc điểm thực vật Cây thảo lâu năm, cao khoảng 40 - 80 cm Rễ có đường kính 0,5 – 1,5 cm, màu đỏ nâu Lá kép mọc đối, gồm - chét, mặt chét màu xanh tro, có lông Hoa mọc thành chùm đầu cành, dài 10 - 15 cm, với vòng hoa; vòng - 10 hoa, thông thường hoa, màu đỏ tím Tràng hoa môi, môi cong hình lưỡi liềm, môi xẻ ba thuỳ; nhị môi dưới; bầu có vòi dài Quả nhỏ, dài mm, rộng 1,5 m [2], [8]  Thành phần hóa học [2], [8], [10], [25] Các thành phần hóa học Đan sâm nghiên cứu từ đầu năm 30 kỉ trước Hiện có 100 chất hóa học tách chiết xác định từ Đan sâm Dựa tính tan chất hóa học chia nhóm thành phần Đan sâm làm ba loại: thành phần tan nước, thành phần tan dầu hành phần khác Thành phần tan dầu: Chủ yếu diterpenoid gồm nhiều cấu trúc khác nhau, chia làm nhóm: abietan diterpenoid, clerodan diterpenoid, pimaran diterpenoid, lapdan diterpenoid Trong rễ Đan sâm chủ yếu nhóm abietan Hình 3.12 Vết sắc ký xác định LOD, LOQ Hình 3.13 Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ – detecter videoscan Từ hình 3.13 kết phần mềm videoscan xử lý số liệu, nồng độ 0,02; 0,03; 0,04 mg/ml không xác định vết sắc ký pic chuẩn Ở nồng 27 độ 0,05 mg/ml có xác định vết mỏng pic sắc ký Với chiều cao pic 243,8 Chiều cao đường 22,3 Khi tỉ số S/N = 10,9 > 10 nên lựa chọn nồng độ 0.05 mg/ml giới hạn phát định lượng Vậy, giới hạn phát định lượng (LOD, LOQ) acid SAL B detector videoscan là: 0,05 mg/ml với thể tích tiêm mẫu µl  Độ lặp lại phương pháp Độ lặp lại xác định dựa vào kết phân tích lần song song mẫu thử IH Kết thu bảng 3.2 Bảng 3.2 Độ lặp lại - videoscan STT mcân (g) 0,1103 0,1164 0,1078 0,1120 0,1164 0,1181 Spic (mAU) 33245,6 33387,5 32051,7 31728,0 33314,1 33991,1 CSAL B (mg/ml) HLSAL B (%) 0,1905 0,1912 0,1841 0,1824 0,1908 0,1944 TB SD RSD (%) 4,3170 4,1070 4,2705 4,0723 4,0986 4,1161 4,1636 0,1029 2,47 Độ lặp lại phương pháp HPTLC với detector videoscan có RSD = 2,47 < 2,70 Do vậy, phương pháp có độ lặp lại tốt dùng detector videoscan  Độ thu hồi (độ đúng) Kết độ thu hồi phương pháp phát detector videoscan (bảng 3.3) Bảng 3.3 Độ thu hồi - videoscan STT m SAL B thêm vào 0,09 0,09 0,09 Spic (mAU) 47662,3 47895,6 47186,3 CSAL B (mg/ml) R(%) 0,2700 0,2714 0,2671 98,97 99,75 97,38 98,70 1,21 TB SD 28 RSD (%) 1,22 Độ thu hồi phương pháp HPTLC với detector videoscan 98,70 % nằm khoảng (97-103 %), RSD = 1,22 % Như phương pháp có độ nằm khoảng giới hạn cho phép, đạt yêu cầu AOAC Nhận xét: Từ kết thẩm định ta thấy, với detector videoscan phương pháp đạt yêu cầu AOAC phân tích định lượng 3.2.2 Thẩm định phương pháp với detector densitometer  Độ đặc hiệu, chọn lọc (bản mỏng hình 3.8) Quan sát sắc ký đồ dung dịch sau khai triển (hình 3.14) Kết cho thấy: - Mẫu trắng không xuất vết tương ứng với vết SAL B chuẩn - Mẫu thử xuất vết có Rf tương đương với vết thu sắc ký đồ mẫu chuẩn - Mẫu trộn xuất vết có Rf tương đương với vết thu sắc ký đồ mẫu chuẩn Pic thử chuẩn chồng lên nhau, phân tách Kết luận: Khi sử dụng với detector densitometer phương pháp có tính đặc hiệu, chọn lọc với SAL B 29 Hình 3.14 Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu detector densitometer  Đường chuẩn, khoảng nồng độ hồi quy (bản mỏng hình 3.10) Bảng 3.4 Kết đánh giá đường chuẩn SAL B - densitometer Dung dịch C (mg/ml) Diện tích pic (mAU) C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 0,0513 0,1025 0,2050 0,3075 0,4100 0,5125 0,8200 911,48 2683,32 4731,69 6473,95 7611,13 9121,00 11830,00 Phương trình hồi quy y = -11649x2 + 23778x + 97,56 r 0,9976 30 14000 12000 detector densitometer diện tích pic 10000 8000 6000 y = -11649x2 + 23778x + 97,56 r = 0,9976 4000 2000 0 0.2 0.4 0.6 nồng độ chuẩn (mg/ml) 0.8 Hình 3.15: Kết đánh giá khoảng nồng độ hồi quy SAL B - densitometer Qua bảng 3.1 hình 3.15 ta thấy tích kết phân tích detector densitometer mối tương quan Spic nồng độ mối tương quan bậc 2, với hệ số tương quan r = 0,9976 > 0,9950 đường chuẩn đạt yêu cầu tính hồi quy  Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng (LOD, LOQ) Sắc ký đồ dung dịch chuẩn khảo sát LOD, LOQ hình 3.16 Hình 3.16 Sắc ký đồ khảo sát LOD, LOQ – densitometer 31 Kết quả: - Không phát pic SAL B nồng độ 0,02; 0,03 0,04 mg/ml - Phát pic SAL B nồng độ 0,05 mg/ml Ở nồng độ 0,05 mg/ml có tỉ số S/N= 41,5/2,6 ≈16 Kết luận: giới hạn phát định lượng (LOD, LOQ) đối acid SAL B detector densitometer là: 0,05 mg/ml với thể tích tiêm mẫu µl  Độ lặp lại phương pháp Bảng 3.5 Độ lặp lại - densitometer STT mcân (g) Spic (mAU) CSALB (mg/ml) HLSAL B (%) 0,1103 0,1164 0,1078 0,1120 0,1164 0,1181 4670,23 4832,74 4556,11 4571,37 4717,50 4802,49 0,1892 0,1972 0,1837 0,1844 0,1915 0,1957 4,2883 4,2345 4,2593 4,1161 4,1131 4,1420 4,1922 0,08 1,85 TB SD RSD (%) Vậy với detector densitometer phương pháp vừa xây dựng có độ lặp lại tốt (RSD = 1,85 < 2,70)  Độ thu hồi (độ đúng) Bảng 3.6 Độ thu hồi - densitometer STT m SAL B thêm vào Spic (mg) (mAU) 0,09 6357,65 0,09 6370,98 0,09 6370,96 Trung bình (%) SD RSD (%) CSAL B (mg/ml) Độ thu hồi (%) 0,2695 0,2702 0,2702 96,85 97,24 97,24 97,11 0,23 0,24 32 Qua bảng 3.6 cho thấy, độ thu hồi phương pháp với detector densitometer 97,11% nằm khoảng (97-103%), RSD=0,24 Như phương pháp có độ nằm khoảng giới hạn cho phép, đạt yêu cầu AOAC Nhận xét: Từ kết thẩm định ta thấy, với detector densitometer phương pháp đạt yêu cầu AOAC phân tích định lượng 3.2.3 So sánh với phương pháp HPLC theo Dược điển Trung Quốc  Kết định lượng SAL B cao phương pháp HPLC Hình 3.17 Hình ảnh sắc ký đồ mẫu thử chuẩn phương pháp HPLC Bảng 3.7 Kết hàm lượng SAL B mẫu cao IE phương pháp HPLC Mẫu Lượng cân Độ pha loãng (lần) Diện tích pic (mAU.s) Nồng độ (mg/ml) Hàm lượng (%) Trung bình SD Chuẩn 1,07 mg 100 1165459 0,0107 Thử 0,0517g 250 1377359 0,0126 6,24 RSD (%) Thử 0,0515g 250 1385983 0,0127 6,18 6,19 0,04 0,66 33 Thử 0,0497g 250 1333047 0,0122 6,16 Ở mẫu cao, tiến hành song song, định lượng phương pháp HPTLC, xử lý kết detector: videoscan densitometer Kết thu bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết hàm lượng SAL B mẫu cao IE phương pháp HPTLC Detector Mẫu Khối lượng (g) thử 0,1111 thử 0,1042 thử 0,1078 Detector videoscan Diện Độ Nồng Hàm tích pha độ lượng pic loãng (mg/ml) (%) (mAU) 41961, 25 0,3435 7,73 39791, 25 0,3238 7,77 43396, 25 0,3568 8,28 Trung bình 7,92 SD 0,30 RSD (%) 3,85 Detector densitometer Diện Nồng Hàm tích độ lượng pic (mg/ml) (%) (mAU) 5974,8 0,2877 6,47 5817,6 0,2786 6,68 5735,0 0,2738 6,35 Trung bình 6,50 SD 0,17 RSD 2,59 Nhận xét: Hàm lượng SAL B tính theo detector có khác biệt rõ rệt Hàm lượng SAL B tính theo detector videoscan cao so với sử dụng detector densitometer (7,92 % 6,50 %) Hàm lượng acid SAL B trung bình dùng detector densitometer cho kết gần sát với hàm lượng SAL B trung bình sử dụng phương pháp HPLC (6,19 % ) 3.3 Ứng dụng phương pháp để kiểm tra sơ số mẫu cao thu thị trường Sử dụng phương pháp vừa xây dựng phân tích mẫu cao thu thị trường: cao đặc nước, cao đặc cồn, cao khô phun sấy, cao khô thường, cao khô dạng phối hợp chế phẩm Kết thu trình bày hình 3.18 bảng 3.7 34 Hình 3.18 Hình ảnh vết sắc ký mẫu cao phân tích thị trường Bảng 3.9 Kết phân tích số mẫu cao thị trường Mẫu cao IE1 IE2 IE3 Trung bình T1 T2 T3 Trung bình N1 N2 N3 Trung bình F1 F2 F3 Trung bình Định tính + + + + + + + + + + + + Bán định lượng_hàm lượng SAL B 7,73 7,77 8,28 7,92 17,39 16,31 15,88 16,53 2,90 3,09 3,07 3,02 3,79 3,85 4,09 3,91 (+) có phát thấy acid Salvianolic B Kết luận: Tất mẫu có chứa acid Salvianolic B, với hàm lượng khác rõ rệt (bảng 3.9) 35 3.4 Bàn luận Đã có nhiều nghiên cứu phương pháp định tính, định lượng SAL B dược liệu, cao bỏ ngỏ Cao nguyên liệu sản phẩm trình chiết dược liệu từ dung môi thích hợp Tùy vào phương pháp chiết, tỉ lệ dược liệu/cao, thể chất cao mà có hàm lượng chất khác Hàm lượng SAL B cao lớn dược liệu khác loại Do đó, phân tích đối tượng cao cần quy trình xử lí mẫu riêng để đảm bảo việc chiết hoàn toàn SAL B Trong đề tài xây dựng phương pháp phân tích với quy trình xử lí mẫu thích hợp, có khoảng định lượng đủ rộng phù hợp với thay đổi hàm lượng SAL B lớn cao Về cấu tạo, hệ thống HPTLC khác detector Trên thực tế, sở thường có hai detector videoscan densitometer Vì vậy, phương pháp khảo sát sử dụng detector để áp dụng rộng rãi nhiều sở Qua khảo sát, coi kết HPLC làm mốc dùng với detector densitometer cho kết gần với HPLC hơn, videoscan cho kết xa Điều độ chọn lọc videoscan với SAL B densitometer HPLC Videoscan định lượng bước sóng UV - 254 nm, UV – 366 nm, VIS, densitometer HPLC định lượng cực đại hấp thụ SAL B Cũng lí mà densitometer cho kết có độ lặp lại tốt hơn, ổn định (densitometer: RSD = 1,85 %, videoscan: RSD = 2,47 %), kết cho độ tin cậy videoscan Mặc dù densitometer HPLC định lượng cực đại hấp thụ SAL B kết định lượng có khác (hàm lượng SAL B – densitometer, HPLC 6,50; 6,19 %) Độ lệch khác cách xác định diện tích pic phương pháp (Hình 3.19) 36 Hình 3.19 Cách tính diện tích pic phương pháp HPLC HPTLC Từ kết phần thẩm định, phương pháp vừa xây dựng với detector đáp ứng theo yêu cầu AOAC, qua phần so sánh ta thấy sai số phương pháp lớn, Vì vậy, đề xuất áp dụng phương pháp để bán định lượng SAL B cao Đan sâm HPLC cho kết tin cậy hơn, độ xác cao Tuy nhiên phương pháp HPTLC vừa xây dựng tiết kiệm hơn, tốn thời gian (tốn dung môi, hóa chất, lúc định lượng nhiều mẫu cao), thao tác đơn giản dễ áp dụng Chính HPTLC có ý nghĩa lớn cần định lượng sơ bộ, nhanh hàm lượng SAL B cao Hơn nữa, phương pháp áp dụng cao khả áp dụng rộng quy trình xử lí mẫu, thử xác định hàm lượng SAL B lên chế phẩm có thành phần cao đan sâm Kết cho thấy, phương pháp xác định hàm lượng SAL B chế phẩm Vì vậy, hy vọng mở rộng phương pháp lên đối tượng rộng hơn, không bó hẹp cao mà chế phẩm chứa cao Đan sâm Điều có ý nghĩa lớn việc kiểm soát chế phẩm có chứa Đan sâm có thị trường Đặc biệt chế phẩm chủ yếu Thực phẩm chức 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Trong phạm vi khóa luận, hoàn thành mục tiêu đề ra: Đã xây dựng phương pháp bán định lượng acid Salvianolic B cao Đan sâm HPTLC với hai detector: videoscan densitometer Đã thẩm định phương pháp vừa xây dựng detector: videoscan densitometer Với detector (videoscan densitometer), phương pháp vừa xây dựng có độ chọn lọc tốt, khoảng hồi quy đạt yêu cầu (r tương ứng 0,9983 0,9976), độ lặp lại tốt (RSD tương ứng 2,47 1,85), độ thu hồi đạt yêu cầu (R tương ứng 98,70 % 97,11 %) Tuy nhiên, kết lệch so với HPLC Do vậy, phương pháp HPTLC vừa xây dựng giới hạn bán định lượng Đã phân tích số mẫu cao thị trường Kết bán định lượng acid Salvianolic B mẫu cao có khác biệt lớn ĐỀ XUẤT Phương pháp định lượng xây dựng đơn giản Vì vậy, đề xuất áp dụng phương pháp để kiểm tra nhanh chất lượng nguyên liệu chế phẩm, đặc biệt ứng dụng kiểm tra chất lượng thực phẩm chức yêu cầu độ xác không cao, cần có kết nhanh chi phí thấp 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Trần Tử An (2010), Hóa phân tích 2, Nhà xuất Y học tr.205-213 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Trương, Nguyễn Thượng Dong (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, 2006, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 732 – 733 Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, chuyên luận Đan sâm Domesco Đan sâm Tam thất, truy cập ngày 20/04-2016, trang web http://www.domesco.com/c/dan-sam tam-that/ Mai Văn Duẩn (2016), Nghiên cứu định tính, bán định lượng Tanshinon IIa cao Đan sâm HPTLC, Khóa luận Dược sĩ, Trường đại học Dược Hà Nội Fito Pharma (2014), Đan sâm Tam thất, truy cập ngày-10/05, trang web http://www.fitoco.com/product-items/dan-sam-tam-that/ Đinh Thị Thúy Hương (2014), Xây dựng quy trình định lượng anthocyanin thực phẩm chức phương pháp HPLC HPTLC, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2004), Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Hà Nội, tr.818 LTD Tasly Phar International Co Thiên sứ hộ tâm đan, truy cập ngày 15/04/2017, trang web http://www.tasly.com.vn/ct-sp/744/thien-su-hotam-dan 10 Nguyễn Thị Minh Phương (2011), Nghiên cứu phương pháp vân tay sắc ký TLC HPLC góp phần đánh giá chất lượng vị thuốc Đan sâm, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội 11 Tống Xuân Quang (2015), Nghiên cứu thay đổi hàm lượng rutin phát triển hoa hòe nụ hoa hòe chế biến theo y học cổ truyền phương pháp HPTLC, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường đại học dược Hà Nội 12 Traphaco Đan sâm Tam thất, truy cập ngày 15/04/2017, trang web http://www.traphaco.com.vn/san-pham/dan-sam-tam 13 Viện Dược liệu (2002), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập 1, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.732 14 Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.19-59 Tài liệu tiếng Anh: 15 Chao Lin, Zhaoguo Liu, Ying Lu (2016), “Cardioprotective effect of Salvianolic acid B on acute myocardial infarction by promoting autophagy and neovascularization and inhibiting apoptosis”, TOC Vol 68, pp 941-952 16 Hildebert Wagner and Gudrun Ulrich-Merzenich “Evidence and Rational Based Research on Chinese Drugs” Springer-Verlag Wien, Wien, tr.254 17 Hongzhang Huanga, Xueyi Xuanb, Liyuan Xub, Jianrui Yanga, Chongkai Gaoa, Ning Li (2014), “Optimization of liquid chromatographic method for the separation of nine hydrophilic and hydrophobic components in Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma (Danshen) using microemulsion as eluent”, Journal of Chromatography B 955–956 (2014), pp 124–133 18 Li-Na Zhou, Xin Zhang, Wei-Zhuo Xu (2011), “Studies on the Stability of Salvianolic Acid B as Potential Drug Material”, Phytochemical Analysis Vol 22, pp 378-384 19 Machindra J Chavan, Devanand B Shinde and Pravin S Wakte (2011), High-Performance ThinLayer Chromatography (HPTLC), pp.117 20 National Center for Biotechnology Information Salvianolic Acid B, accessed date: 15/04/2017 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/6441188 21 Pharmacopoeia Commission, Pharmacopoeia of People’s Republic of China, vol I, China Medical Science Press, Beijing, 2010, pp.213-214 22 Ping HU, Guo-An LUO, Zhongzhen ZHAO, Zhi-Hong JIANG (2005), “Quality Assessment of Radix Salviae Miltiorrhiza”,Chem Pharm Bull Vol 53-No 5, pp 481-486 23 US Pharmacopeial Convention, Herbal Medicines Compendium, Salvia miltiorrhiza Root and Rhizome - Identification, accessed date: 15/04/2017 https://hmc.usp.org/sites/default/files/documents/Visual%20Representation% 20of%20Chromatographic%20Identification%20Procedures_46.pdf 24 Wenjing Zeng, Wen Shan, Lili Gao, (2015), “Inhibition of HMGB1 release via Salvianolic acid B-mediated SIRT1 up-regulation protects rats against non-alcoholic fatty liver disease”, Nature, Scientific Reports 5, Article number: 16013 25 Yuan-yuan Jiang, Long Wang and Li Zhang (2015), Dan Shen (Salvia miltiorrhiza) in Medicine Volume 1, Springer Netherlands, Dordrecht, pp.97117 26 Yuan-yuan Jiang, Long Wang Li Zhang (2015), Dan Shen (Salvia miltiorrhiza) in Medicine Volume 2, Springer Netherlands, pp.119-129 27 Yujue Wang, Guang Chen and Xiangdong Yu (2016), “Salvianolic Acid B Ameliorates Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury Through Inhibiting TLR4/MyD88 Signaling Pathway”, Inflammation Vol 39, pp 1503-1513 28 Zhu Z, Ding L, Qiu Wf, Wu Hf, Li R(2016), “Salvianolic acid B protects the myelin sheath around injured spinal cord axons”, Neural Regen Res, Vol 11, pp 487-492 ... Xây dựng phương pháp b n định lượng acid Salvianolic B cao Đan sâm HPTLC với mục tiêu chính: Xây dựng phương pháp b n định lượng acid Salvianolic B cao Đan sâm phương pháp HPTLC với detector:... dung nghiên cứu Xây dựng phương pháp b n định lượng acid Salvianolic B cao Đan sâm phương pháp HPTLC với detector videoscan densitometer  Thẩm định phương pháp vừa xây dựng với tiêu chí: Độ đặc.. .B Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ QUỲNH Mã sinh viên: 1201499 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP B N ĐỊNH LƯỢNG ACID SALVIANOLIC B TRONG CAO ĐAN SÂM B NG HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP