Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu đều được xử lý bằng các phần mềm có sẵn trong thiết bị HPTLC. Ảnh chụp sắc ký đồ được chuyển sang xử lý bằng phần mềm VideoScan. Phần mềm này sẽ dựa trên hình ảnh sắc ký đồ vừa được chụp để ghi lại thành các pic và tính toán diện tích pic (hoặc chiều cao) tương ứng.
Dựa trên các kết quả thu được từ detector, tính toán các thông số thống kê nhờ phần mềm tin học Microsoft Office Excel 2010.
18
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích
3.1.1. Khảo sát hệ dung môi pha động
Dựa vào bản chất của chất phân tích và một số tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến hành khảo sát 6 hệ pha động:
Hệ 1: Toluen: Diclomethan: Ethylacetat: Methanol: acid formic (2:3:4:0,5:2) [23]
Hệ 2: Toluen: EtOAc: HCOOH (5:4:1) [10]
Hệ 3: Toluen: EtOAc: Aceton: HCOOH (5:2:2:1) [10]
Hệ 4: Nước: MeOH: EtOAc (10: 13,5:100)
Hệ 5: Toluen: CHCl3: EtOAc: MeOH: HCOOH (2:3:4:0,5:2) [21]
Hệ 6: Toluen: EtOAc: Aceton: HCOOH (2:4:3:1)
Tiến hành trên bản mỏng silica gel GF254. Quan sát kết quả sau khi khai triển dưới ánh sáng UV (366 nm) ở hình 3.1.
Từ kết quả ở hình 3.1 cho thấy:
Hệ 4 Rf thấp, chưa tách được chất phân tích.
Hệ 2, 3, 5 tách được chất phân tích, Rf đạt, tuy nhiên đây đang khảo sát trên bản TLC, khi đưa lên bản HPTLC thì Rf còn giảm hơn. Khi đó sẽ không còn phù hợp.
Hệ 1 và 6 tách được chất phân tích, Rf khá cao. Chúng tôi hướng tới khảo sát trên bản HPTLC với 2 hệ này. Tuy nhiên hệ 1 phức tạp hơn nên chúng tôi lựa chọn hệ 6 để khảo sát trên bản HPTLC.
19
Hệ 1 Hệ 2 Hệ 3
Hệ 4 Hệ 5 Hệ 6
Hình 3.1. Kết quả khảo sát dung môi pha động – bản mỏng GF254
20
Khảo sát hệ pha động 6 trên bản mỏng HPTLC được kết quả như hình 3.2.
Hình 3.2. Khảo sát hệ pha động 6 trên bản mỏng HPTLC
Kết quả khi chạy hệ pha động 6 trên bản HPTLC thì Rf của SAL B thấp (Rf = 0,17 < 0,2).
Do vậy, chúng tôi điều chỉnh tỉ lệ pha động 6 thành toluen, EtOAc, aceton, acid formic = 3:4:2:1 (pha động 6’).
Hình 3.3. Khảo sát pha động 6’ trên bản HPTLC
Kết quả sau khi điều chỉnh pha động (hình 3.3) cho thấy hệ pha động 6’ (toluen, EtOAc, aceton, acid formic = 3:4:2:1) phù hợp nhất để định lượng SAL B.
3.1.2. Khảo sát bước sóng phát hiện
Detector videoscan
Quan sát bản mỏng ở các bước sóng 254 nm, 366 nm và ánh sáng khả kiến. Kết quả thu được thể hiện trong hình 3.4.
21
(a) UV-254
(b) UV-366
(c) VIS
Hình 3.4. Khảo sát bước sóng phát hiện
Kết quả cho thấy:
- Ánh sáng khả kiến không cho phép xác định được các vết trên bản mỏng.
- Cả 2 bước sóng 254 nm và 366 nm đều cho phép quan sát được các vết trên bản mỏng, tuy nhiên ở bước sóng 366 nm cho các vết SAL B rõ và gọn hơn. Chính vì vậy chúng tôi lựa chọn bước sóng 366 nm làm bước sóng phát hiện vết với detector videoscan.
22
Detector densitometer
Do detecter này không có chức năng quét phổ nên chúng tôi tiến hành dò cực đại hấp thụ ở dải bước sóng 250 – 350 nm (hình 3.5 và 3.6).
Hình 3.5: Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn ở bước sóng 250 – 320 nm
Hình 3.6: Độ hấp thụ của vết chuẩn ở bước sóng 320 – 350 nm
Từ hình 3.5 và 3.6 ta thấy ở khoảng bước sóng 290 – 320 nm cho độ hấp thụ của dung dịch chuẩn SAL B là cao nhất. Dựa vào kết quả chi tiết, nhận thấy với cùng một vết chuẩn thì ở bước sóng 314 nm có độ hấp thụ lớn nhất và chọn lọc nhất. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn bước sóng 314 nm để phát hiện chất phân tích (Hình 3.7).
Hình 3.7. Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn ở bước sóng 314 nm
23
Từ các khảo sát trên, chúng tôi rút ra quy trình bán định lượng SAL B trong cao và chế phẩm chứa cao đan sâm như sau:
Chuẩn bị:
- Bản mỏng: HPTLC silica gel GF254 (20 x 10 mm), hoạt hóa ở 105°C trong 30 phút.
- Dung môi khai triển: Toluen: EtOAc: Aceton: Acid formic (3:4:2:1).
- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,1 g cao Đan sâm phân tán trong 0,5 ml H2O. Thêm khoảng 5 ml MeOH, lắc vortex trong 4 phút, sau đó đem li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn dịch trong cho vào bình định mức 25 ml. Thêm tiếp 5 ml MeOH vào phần bã, lặp lại quy trình trên thêm 2 lần. Dồn dịch chiết vào bình định mức 25 ml trên, sau đó bổ sung đủ thể tích. Lọc dịch chiết qua màng 0,45 µm.
- Dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 4 mg acid Salvianolic B. Hòa tan với MeOH trong bình định mức 5 ml. Ta được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 0,8 mg/ml.
Từ dung dịch chuẩn gốc ta pha loãng ra dãy nồng độ : 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,8 mg/ml
Cách tiến hành
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 2µl các dung dịch thử và dãy đường chuẩn, mỗi vết dài 4 mm, khoảng cách giữa mỗi vết là 4 mm. Sau khi khai triển sắc kí, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí, đo cường độ hấp thụ của mỗi vết ở ánh sáng thích hợp: UV 366 nm với detector videoscan, 314 nm với detector densitometer.
Bán định lượng SAL B
Các tính toán dựa trên phương trình đường chuẩn SAL B. Từ đó ta tính được nổng độ SAL B trong mẫu thử. Hàm lượng phần trăm của acid Salvianolic B trong cao được tính theo công thức
24 HL % =
(kl/kl)
Trong đó, HL là hàm lượng acid Salvianolic B trong cao, Cthử là nồng độ dung dịch thử, mcân là khối lượng cao.
3.2. Thẩm định phương pháp
3.2.1. Thẩm định phương pháp với detector videoscan.
Độ đặc hiệu, chọn lọc
Quan sát bản mỏng đã khai triển 4 dung dịch: chuẩn, trắng, thử, thử + chuẩn (hình 3.8) và sắc ký đồ của mỗi vết (hình 3.9).
Hình 3.8. Kết quả thử độ đặc hiệu
C: vết chuẩn; Tr: vết trắng; T: vết thử; T+C: vết thử+ chuẩn.
Nhận xét:
- Mẫu trắng không xuất hiện vết và pic tương ứng với vết SAL B chuẩn. - Mẫu thử xuất hiện vết có màu sắc và Rf tương đương với vết thu được trên
sắc ký đồ của mẫu chuẩn
- Mẫu trộn xuất hiện vết có màu sắc và Rf tương đương với vết thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn. Pic của thử và chuẩn chồng lên nhau, không có sự phân tách.
Kết luận: khi sử dụng với detector videoscan, phương pháp có tính đặc hiệu với SAL B.
25
Hình 3.9. Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu bằng detector videosan
Đường chuẩn, khoảng nồng độ hồi quy
Xây dựng đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tương ứng, thu được kết quả như bảng 3.1 và hình 3.12.
26
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá đường chuẩn của SAL B - videoscan
Dung dịch C (mg/ml) Diện tích pic (mAU)
C1 0,0513 1329,8 C2 0,1025 12180,8 C3 0,2050 26701 C4 0,3075 39600,8 C5 0,4100 47349,5 C6 0,5125 56784,1 C7 0,8200 75577,1 PT hồi quy y = - 81829x2 + 164693x – 4951,3 r 0,9983
Hình 3.11: Kết quả đánh giá khoảng nồng độ hồi quy của SAL B-videoscan
Qua bảng 3.1 và hình 3.11 ta thấy tích kết quả phân tích bằng detector
videoscan thì mối tương quan giữa Spic và nồng độ đều là mối tương quan bậc 2 với hệ số tương quan r = 0,9983 > 0,9950 đường chuẩn đạt yêu cầu về tính hồi quy.
Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng (LOD, LOQ)
Khảo sát 4 nồng độ chuẩn: 0,02; 0,03; 0,04; 0,05 mg/ml. Kết quả thu được thể hiện trong hình 3.12. y = -81829x2 + 164693x - 4951,3 r = 0,9983 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 d iệ n t íc h p ic (nồng độ chuẩn (mg/ml) detector videoscan
27
Hình 3.12. Vết sắc ký xác định LOD, LOQ
Hình 3.13. Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ – detecter videoscan
Từ hình 3.13 và kết quả khi phần mềm videoscan xử lý số liệu, ở nồng độ 0,02; 0,03; 0,04 mg/ml không xác định được vết sắc ký cũng như pic của chuẩn. Ở nồng
28
độ 0,05 mg/ml có xác định được vết trên bản mỏng cũng như là pic sắc ký. Với chiều cao pic là 243,8. Chiều cao của đường nền là 22,3. Khi đó tỉ số S/N = 10,9 > 10 nên chúng tôi lựa chọn nồng độ 0.05 mg/ml là giới hạn phát hiện và định lượng.
Vậy, giới hạn phát hiện và định lượng (LOD, LOQ) đối với acid SAL B ở detector videoscan là: 0,05 mg/ml với thể tích tiêm mẫu là 2 µl.
Độ lặp lại phương pháp
Độ lặp lại được xác định dựa vào kết quả phân tích 6 lần song song của mẫu thử IH. Kết quả thu được như bảng 3.2.
Bảng 3.2. Độ lặp lại - videoscan
STT mcân (g) Spic
(mAU) CSAL B (mg/ml) HLSAL B (%)
1 0,1103 33245,6 0,1905 4,3170 2 0,1164 33387,5 0,1912 4,1070 3 0,1078 32051,7 0,1841 4,2705 4 0,1120 31728,0 0,1824 4,0723 5 0,1164 33314,1 0,1908 4,0986 6 0,1181 33991,1 0,1944 4,1161 TB 4,1636 SD 0,1029 RSD (%) 2,47
Độ lặp lại của phương pháp HPTLC với detector videoscan có RSD = 2,47 < 2,70. Do vậy, phương pháp có độ lặp lại tốt khi dùng detector videoscan
Độ thu hồi (độ đúng)
Kết quả độ thu hồi của phương pháp phát hiện ở detector videoscan (bảng 3.3)
Bảng 3.3. Độ thu hồi - videoscan
STT m SAL B thêm vào Spic
(mAU) CSAL B (mg/ml) R(%) 1 0,09 47662,3 0,2700 98,97 2 0,09 47895,6 0,2714 99,75 3 0,09 47186,3 0,2671 97,38 TB 98,70 SD 1,21
29
RSD (%) 1,22
Độ thu hồi của phương pháp HPTLC với detector videoscan là 98,70 % nằm trong khoảng (97-103 %), RSD = 1,22 %. Như vậy phương pháp có độ đúng nằm trong khoảng giới hạn cho phép, đạt yêu cầu của AOAC.
Nhận xét: Từ các kết quả thẩm định trên ta thấy, với detector videoscan phương pháp đã đạt các yêu cầu của AOAC về phân tích định lượng.
3.2.2. Thẩm định phương pháp với detector densitometer
Độ đặc hiệu, chọn lọc (bản mỏng hình 3.8)
Quan sát sắc ký đồ của 4 dung dịch sau khi khai triển (hình 3.14). Kết quả cho thấy:
- Mẫu trắng không xuất hiện vết tương ứng với vết SAL B chuẩn.
- Mẫu thử xuất hiện vết có Rf tương đương với vết thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn
- Mẫu trộn xuất hiện vết có Rf tương đương với vết thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn. Pic của thử và chuẩn chồng lên nhau, không có sự phân tách.
Kết luận: Khi sử dụng với detector densitometer phương pháp có tính đặc hiệu, chọn lọc với SAL B .
30
Hình 3.14. Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu bằng detector densitometer
Đường chuẩn, khoảng nồng độ hồi quy. (bản mỏng hình 3.10)
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá đường chuẩn SAL B - densitometer.
Dung dịch C (mg/ml) Diện tích pic (mAU)
C1 0,0513 911,48 C2 0,1025 2683,32 C3 0,2050 4731,69 C4 0,3075 6473,95 C5 0,4100 7611,13 C6 0,5125 9121,00 C7 0,8200 11830,00
Phương trình hồi quy y = -11649x2 + 23778x + 97,56 r 0,9976
31
Hình 3.15: Kết quả đánh giá khoảng nồng độ hồi quy của SAL B - densitometer
Qua bảng 3.1 và hình 3.15 ta thấy tích kết quả phân tích bằng detector
densitometer thì mối tương quan giữa Spic và nồng độ đều là mối tương quan bậc 2, với hệ số tương quan r = 0,9976 > 0,9950 đường chuẩn đạt yêu cầu về tính hồi quy
Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng (LOD, LOQ).
Sắc ký đồ của các dung dịch chuẩn khảo sát LOD, LOQ như hình 3.16.
Hình 3.16. Sắc ký đồ khảo sát LOD, LOQ – densitometer
y = -11649x2 + 23778x + 97,56 r = 0,9976 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 d iệ n t íc h p ic nồng độ chuẩn (mg/ml) detector densitometer
32
Kết quả:
- Không phát hiện được pic của SAL B ở nồng độ 0,02; 0,03 và 0,04 mg/ml.
- Phát hiện được pic của SAL B ở nồng độ 0,05 mg/ml. Ở nồng độ 0,05 mg/ml có tỉ số S/N= 41,5/2,6 ≈16.
Kết luận: giới hạn phát hiện và định lượng (LOD, LOQ) đối của acid SAL B ở detector densitometer là: 0,05 mg/ml với thể tích tiêm mẫu là 2 µl.
Độ lặp lại phương pháp
Bảng 3.5. Độ lặp lại - densitometer
STT mcân (g) Spic (mAU) CSALB (mg/ml) HLSAL B (%)
1 0,1103 4670,23 0,1892 4,2883 2 0,1164 4832,74 0,1972 4,2345 3 0,1078 4556,11 0,1837 4,2593 4 0,1120 4571,37 0,1844 4,1161 5 0,1164 4717,50 0,1915 4,1131 6 0,1181 4802,49 0,1957 4,1420 TB 4,1922 SD 0,08 RSD (%) 1,85
Vậy với detector densitometer phương pháp vừa xây dựng có độ lặp lại tốt (RSD = 1,85 < 2,70).
Độ thu hồi (độ đúng)
Bảng 3.6. Độ thu hồi - densitometer
STT m SAL B thêm vào (mg)
Spic
(mAU) CSAL B (mg/ml) Độ thu hồi (%)
1 0,09 6357,65 0,2695 96,85 2 0,09 6370,98 0,2702 97,24 3 0,09 6370,96 0,2702 97,24 Trung bình (%) 97,11 SD 0,23 RSD (%) 0,24
33
Qua bảng 3.6 cho thấy, độ thu hồi của phương pháp với detector densitometer là 97,11% nằm trong khoảng (97-103%), RSD=0,24. Như vậy phương pháp có độ đúng nằm trong khoảng giới hạn cho phép, đạt yêu cầu của AOAC.
Nhận xét: Từ các kết quả thẩm định trên ta thấy, với detector densitometer phương pháp đã đạt các yêu cầu của AOAC về phân tích định lượng.
3.2.3. So sánh với phương pháp HPLC theo Dược điển Trung Quốc
Kết quả định lượng SAL B trong cao bằng phương pháp HPLC
Hình 3.17. Hình ảnh sắc ký đồ của mẫu thử và chuẩn bằng phương pháp HPLC
Bảng 3.7. Kết quả hàm lượng SAL B mẫu cao IE bằng phương pháp HPLC
Mẫu Chuẩn Thử 1 Thử 2 Thử 3 Lượng cân 1,07 mg 0,0517g 0,0515g 0,0497g
Độ pha loãng (lần) 100 250 250 250
Diện tích pic (mAU.s) 1165459 1377359 1385983 1333047
Nồng độ (mg/ml) 0,0107 0,0126 0,0127 0,0122
Hàm lượng (%) 6,24 6,18 6,16
Trung bình 6,19
SD 0,04
34
Ở cùng một mẫu cao, tiến hành song song, định lượng bằng phương pháp HPTLC, xử lý kết quả bằng 2 detector: videoscan và densitometer. Kết quả thu được ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả hàm lượng SAL B mẫu cao IE bằng phương pháp HPTLC
Detector Detector videoscan Detector densitometer Mẫu Khối lượng (g) Độ pha loãng Diện tích pic (mAU) Nồng độ (mg/ml) Hàm lượng (%) Diện tích pic (mAU) Nồng độ (mg/ml) Hàm lượng (%) thử 1 0,1111 25 41961, 1 0,3435 7,73 5974,8 9 0,2877 6,47 thử 2 0,1042 25 39791, 9 0,3238 7,77 5817,6 3 0,2786 6,68 thử 3 0,1078 25 43396, 7 0,3568 8,28 5735,0 8 0,2738 6,35 Trung bình 7,92 Trung bình 6,50 SD 0,30 SD 0,17 RSD (%) 3,85 RSD 2,59
Nhận xét: Hàm lượng SAL B tính theo 2 detector có sự khác biệt rõ rệt. Hàm lượng SAL B tính theo detector videoscan cao hơn so với khi sử dụng detector densitometer (7,92 % và 6,50 %). Hàm lượng acid SAL B trung bình khi dùng detector densitometer cho kết quả gần sát với hàm lượng SAL B trung bình khi sử dụng phương pháp HPLC hơn (6,19 % ).
3.3. Ứng dụng phương pháp để kiểm tra sơ bộ một số mẫu cao thu được trên thị trường thị trường
Sử dụng phương pháp vừa xây dựng phân tích các mẫu cao thu được trên thị trường: cao đặc trong nước, cao đặc trong cồn, cao khô phun sấy, cao khô thường, cao khô dạng phối hợp trong chế phẩm. Kết quả thu được trình bày trong hình 3.18 và bảng 3.7.
35
Hình 3.18. Hình ảnh vết sắc ký của các mẫu cao phân tích trên thị trường
Bảng 3.9. Kết quả phân tích một số mẫu cao trên thị trường
Mẫu cao Định tính Bán định lượng_hàm lượng SAL B
IE1 + 7,73 IE2 + 7,77 IE3 + 8,28 Trung bình 7,92 T1 + 17,39 T2 + 16,31 T3 + 15,88 Trung bình 16,53 N1 + 2,90 N2 + 3,09 N3 + 3,07 Trung bình 3,02 F1 + 3,79 F2 + 3,85 F3 + 4,09 Trung bình 3,91
(+) có phát hiện thấy acid Salvianolic B
Kết luận: Tất cả các mẫu đều có chứa acid Salvianolic B, với hàm lượng khác nhau rõ rệt (bảng 3.9)
36
3.4. Bàn luận
Đã có nhiều nghiên cứu về các phương pháp định tính, định lượng SAL B trong dược liệu, nhưng trong cao thì vẫn còn bỏ ngỏ. Cao nguyên liệu chính là sản phẩm của quá trình chiết dược liệu từ dung môi thích hợp. Tùy vào phương pháp chiết, tỉ