Nghiên cứu xây dựng phương pháp sách định dư lượng clenbuterol trong thịt heo bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ

Trang ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ CHÂN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CLENBUTEROL TRONG THỊT HEO BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 07 NĂM 2010 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: TS TRẦN BÍCH LAM Cán chấm nhận xét 1: TS PHẠM THỊ HUỲNH MAI Cán chấm nhận xét 2: PGS.TS NGÔ MẠNH THẮNG Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ, TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 24 tháng 08 năm 2010 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCMCỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc oOo Tp HCM, ngày tháng năm NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ CHÂN Giới tính : Nam
/ Nữ Ngày, tháng, năm sinh : 22 - 12 - 1977 Nơi sinh : Hà Tĩnh Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm đồ uống Khoá (Năm trúng tuyển) : 2008 1- TÊN ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định dư lượng Clenbuterol thịt heo kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ” 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: 2.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định dư lượng Clenbuterol kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ 2.2 Thẩm định phương pháp phân tích để đánh giá giá trị sử dụng phương pháp thực tế 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 25 – 01 - 2010 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 02 – 08 - 2010 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi đầy đủ học hàm, học vị ): .Tiến sĩ Trần Bích Lam Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) Luận văn thạc sĩ CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) Nguyễn Thị Chân Trang LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin chân thành gởi lời cảm ơn TS Trần Bích Lam tận tình hướng dẫn, giúp đỡ góp ý cho tơi thực tốt đề tài Tôi xin chân thành cám ơn thầy cô giáo môn Công nghệ thực phẩm đồ uống – Khoa Kỹ thuật hóa học – Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TPHCM nhiệt tình truyền đạt kiến thức suốt trình học tập Đồng thời, gởi lời cảm ơn Ban Giám đốc anh chị, bạn phòng Phân tích Sắc ký thuộc Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm giúp đỡ, hỗ trợ tơi thời gian công tác thực luận văn Sau cùng, xin cám ơn gia đình động viên, tạo điều kiện giúp học tập thực đề tài tốt nghiệp Nguyễn Thị Chân Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang TÓM TẮT NỘI DUNG Clenbuterol (4-amino-(-)[t-butylaminomethyl]-3,5-dichlorobenzyl alcohol) hợp chất thuộc nhóm -agonist, có tác dụng điều trị bệnh đường hô hấp cho gia súc; ngịai ra, clenbuterol cịn có tác dụng kích thích tăng trưởng, gia tăng q trình chuyển hóa làm tăng thịt nạc giảm hàm lượng mỡ nên thường bị lạm dụng chăn nuôi gia súc Trên giới, Clenbuterol kiểm sóat chặt chẽ việc sử dụng tồn dư lọai thực phẩm, đặc biệt thịt gia súc Theo thị 96/23/EC châu Âu, Clenbuterol xếp vào nhóm A mục I – chất có tác dụng chuyển hóa, bị cấm sử dụng chăn nuôi cần phải kiểm tra dư lượng phương pháp sắc ký đầu dò khối phổ Mục đích đề tài nghiên cứu xây dựng phương pháp thích hợp nhằm phân tích dư lượng Clenbuterol thịt heo phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ có cực tiểu phát đáp ứng giới hạn cho phép 0.1 0.5 g/kg Clenbuterol trích ly tinh cột kỹ thuật chiết pha rắn (SPE), phát định lượng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực nguồn ion hóa điện tử (ESI) chế độ MRM với ion định lượng m/z = 203 ion xác nhận m/z = 259 Phương pháp thẩm định theo định 2002/657/EC liên minh châu Âu (EU) với hiệu suất thu hồi đạt 71.6% đến 106.1% (trong khoảng nồng độ 0.1 – 5ppb), độ lặp lại (RSDr) khoảng 8.07 – 12.45%, độ tái lập (RSDR) khỏang 8.74 – 12.79%, giới hạn phát đạt 0.03g/kg giới hạn định lượng 0.09g/kg Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang ABSTRACT Clenbuterol (4-amino-(-)[t-butylaminomethyl]-3,5-dichlorobenzyl alcohol) is a compound of group -agonists, are effective in treating espiratory disease for cattle, in addition, clenbuterol also stimulates growth and increases metabolism to enhance muscle mass and reduce lipid so often misused in cattle feeding In almost country, clenbuterol is controlled by official inspection in using to feed and resiues in meat In 96/23/EC Directive, clenbuterol was in group A Annex I – substances have anabolic effect, are prohibited in raising and have to determine residues by chromatography coupled mass spectrometry method The aim of this study is to develop a suitable method to determine clenbuterol residue in pork meat by liquid chromatography mass spectrometry obtaining limit of dectection lower maximum residue limit (MRL) 0.1-0.5 g/kg Clenbuterol was extracted and cleaned-up by solid extraction phase (SPE), identified and quantified by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tadem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) operating in positive ion multiple reaction monitoring (MRM) mode The method was validated acording to European Union Commision directive 2002/657/EC, recoveries of method were range of 71.6% to 106.1% (at 0.1 – 5ppb) with repeatability (RSDr value) between 8.07% and 12.45%, reproducibility (RSDR value) between 8.74 and 12.79% Limit of detection (LOD) and limit of quantitation obtained 0.03g/kg and 0.09g/kg, respectively Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Tóm tắt luận văn Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị Chương 1: Mở đầu 1.1 Mở đầu 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Chương 2: Tổng quan 2.1 Giới thiệu hợp chất clenbuterol 2.2.1 Một số tính chất clenbuterol 2.2.2 Chuyển hóa sinh học clenbuterol 2.2.3 Tác động clenbuterol thể người động vật 2.1.4 Tình hình sử dụng ảnh hưởng dư lượng clenbuterol đến người tiêu dùng 11 2.2.5 Quy định giới hạn cho phép clenbuterol thực phẩm 13 2.2.6 Một số phương pháp định lượng clenbuterol công bố 14 2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 19 2.2.1 Pha tĩnh sắc ký pha đảo 20 2.2.2 Pha động sắc ký pha đảo 23 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang 2.2.3 Một số đại lượng phân tích sắc ký 25 2.2.4 Hệ thống sắc ký lỏng 28 2.3 Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ 28 2.3.1 Nguyên lý chung 28 2.3.2 Các loại máy khối phổ 30 2.3.3 Đầu dò khối phổ ba tứ cực 31 2.3.4 Phương pháp trích ly, làm giàu mẫu kỹ thuật chiết pha rắn 36 Chương 3: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 42 3.1 Nguyên liệu hóa chất 43 3.1.1 Nguyên liệu 43 3.1.2 Hóa chất, dụng cụ 43 3.1.3 Thiết bị phân tích thiết bị phụ trợ 44 3.2 Phương pháp nghiên cứu 45 3.2.1 Xây dựng đường chuẩn 45 3.2.2 Khảo sát điều kiện thiết bị phân tích 47 3.2.3 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 47 3.3 Thẩm định phương pháp 51 Chương 4: Kết bàn luận 52 4.1 Khảo sát thơng số đầu dị khối phổ 53 4.1.1 Xác định ion mẹ 53 4.1.2 Khảo sát điện fragmentor 54 4.1.3 Khảo sát lượng bắn phá 55 4.1.4 Khảo sát độ dao động mảnh ion 58 4.2 Khảo sát thông số cho hệ thống sắc ký lỏng 59 4.3 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 62 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang 4.3.1 Khảo sát dung dịch dùng để trích ly 62 4.3.2 Khảo sát nồng độ dung dịch trích ly KH2PO4 64 4.3.3 Khảo sát cột chiết pha rắn (SPE) 65 4.4 Thẩm định phương pháp 67 4.4.1 Khảo sát độ tuyến tính 67 4.4.2 Khảo sát tính chọn lọc phương pháp 70 4.4.3 Khảo sát hiệu suất thu hồi 70 4.4.4 Khảo sát độ lặp lại 72 4.4.5 Khảo sát độ tái lập 73 4.4.6 Khảo sát giới hạn phát giới hạn định lượng 75 4.5 Ước lượng độ không đảm bảo đo 76 4.6 Nghiên cứu tượng khử ion 77 4.7 Kết so sánh với phương pháp khác 79 Chương 5: Kết luận 81 Tài liệu tham khảo Phụ lục Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang 10 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril APCI Ion hóa hóa học áp suất khí APPI Ion hóa photon áp suất khí ESI Ion hóa tia điện EU Cộng đồng châu Âu, liên minh châu Âu GC/MS Sắc ký khí ghép khối phổ HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao LC/MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ LC/MS/MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ lần LC/MSn Sắc ký lỏng ghép khối phổ n lần LOD Giới hạn phát phương pháp LOQ Giới hạn định lượng phương pháp MeOH Methanol Mp Pha động MRL Giới hạn dư lượng tối đa cho phép MRPL Giới hạn yêu cầu tối thiểu mà phương pháp phân tích phải đạt MS Khối phổ ppb Một phần tỷ ppm Một phần triệu RSD Độ lệch chuẩn tương đối Scan Quét phổ, ghi phổ SKPB Sắc ký phân bố SKPĐ Sắc ký pha đảo SKPT Sắc ký pha thường SPE Chiết pha rắn Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang 112 Phụ lục 10: Khảo sát độ tuyến tính - số liệu sắc ký đồ (1/3) Calibration STD C_0.05ppb_01.d C_0.05ppb_02.d C_0.05ppb_03.d C_0.1ppb_01.d C_0.1ppb_02.d C_0.1ppb_03.d C_0.5ppb_01.d C_0.5ppb_02.d C_0.5ppb_03.d C_1ppb_01.d C_1ppb_02.d C_1ppb_03.d C_5ppb_01.d C_5ppb_02.d C_5ppb_03.d C_10ppb_01.d C_10ppb_02.d C_10ppb_03.d C_25ppb_01.d C_25ppb_02.d C_25ppb_03.d C_50ppb_01.d C_50ppb_02.d C_50ppb_03.d C_100ppb_01.d C_100ppb_02.d C_100ppb_03.d Luận văn thạc sĩ Level 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Enabled                            Response 100 102 107 197 202 198 971 964 967 1959 1905 1979 9372 9309 9416 19063 18975 18846 45355 45103 45226 97018 97358 96758 190910 193172 194397 RF 2004.4192 2030.6436 2146.0112 1970.8777 2022.6641 1982.3919 1942.5982 1928.1950 1933.0122 1959.1693 1905.1565 1978.5009 1874.3452 1861.8225 1883.1077 1906.3123 1897.4634 1884.5931 1814.1871 1804.1290 1809.0292 1940.3579 1947.1589 1935.1593 1909.0965 1931.7169 1943.9697 Exp Conc 0.0500 0.0500 0.0500 0.1000 0.1000 0.1000 0.5000 0.5000 0.5000 1.0000 1.0000 1.0000 5.0000 5.0000 5.0000 10.0000 10.0000 10.0000 25.0000 25.0000 25.0000 50.0000 50.0000 50.0000 100.0000 100.0000 100.0000 Nguyễn Thị Chân Trang 113 Phụ lục 10: Đường chuẩn - số liệu sắc ký đồ (2/3) Sắc ký đồ chuẩn 1ppb (1) Sắc ký đồ chuẩn 1ppb (2) Sắc ký đồ chuẩn 1ppb (3) Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang 114 Phụ lục 10: Đường chuẩn - số liệu sắc ký đồ (3/3) Chuẩn 100ppb Chuẩn 50ppb Chuẩn 25ppb Chuẩn 10ppb Chuẩn 5ppb Chuẩn 0.5ppb Chuẩn 0.1ppb Luận văn thạc sĩ Chuẩn 0.05ppb Nguyễn Thị Chân Trang 115 Phụ lục 11: Hiệu suất thu hồi độ lặp lại - số liệu sắc ký đồ (1/2) Data File BLANK_07.d C_10ppb_07.d C_5ppb_04.d C_1ppb_04.d C_0.5ppb_04.d C_0.1ppb_04.d C_0.05ppb_04.d M+C 5ppb_01.d M+C 5ppb_02.d M+C 5ppb_03.d M+C 5ppb_04.d M+C 5ppb_05.d M+C 5ppb_06.d M+C 5ppb_07.d M+C 1ppb_01.d M+C 1ppb_02.d M+C 1ppb_03.d M+C 1ppb_04.d M+C 1ppb_05.d M+C 1ppb_06.d M+C 1ppb_07.d M+C 0.5ppb_01.d M+C 0.5ppb_02.d M+C 0.5ppb_03.d M+C 0.5ppb_04.d M+C 0.5ppb_05.d M+C 0.5ppb_06.d M+C 0.5ppb_07.d M+C 0.1ppb_01.d M+C 0.1ppb_02.d M+C 0.1ppb_03.d M+C 0.1ppb_04.d M+C 0.1ppb_05.d M+C 0.1ppb_06.d M+C 0.1ppb_07.d Compound CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU Sample Type Blank Calibration Calibration Calibration Calibration Calibration Calibration Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Exp Conc (ppb) 10.0000 5.0000 1.0000 0.5000 0.1000 0.0500 Response 18743 9325 1944 980 211 99 8361 9213 7802 8252 9207 10134 8378 1944 1720 1619 1750 1533 1952 1333 832 982 691 878 759 854 933 203 135 134 174 149 166 145 Chuẩn 0.5ppb Final Conc (ppb) 0.000 10.006 4.978 1.038 0.523 0.113 0.053 4.464 4.918 4.165 4.405 4.915 5.140 4.473 1.038 0.918 0.864 0.934 0.818 1.042 0.811 0.438 0.514 0.386 0.469 0.405 0.456 0.497 0.096 0.072 0.072 0.093 0.080 0.089 0.078 Rec (%) 89.3 98.4 83.3 88.1 98.3 102.8 89.5 103.8 91.8 86.4 93.4 81.8 104.2 81.1 87.6 102.8 77.3 93.7 81.1 91.2 99.5 95.5 72.2 71.6 92.7 79.6 88.7 77.6 SD (ppb) RSD (%)  (ppb) 0.352 8.07 0.326 0.095 9.66 0.088 0.046 10.30 0.043 0.010 12.45 0.009 Mẫu trắng M+C_5ppb_01 M+C_0.1ppb_01 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang 116 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang 117 Phụ lục 11: Độ lặp lại - số liệu sắc ký đồ (2/2) M+C_0.5ppb_01 M+C_0.5ppb_02 M+C_0.5ppb_03 M+C_0.5ppb_04 M+C_0.5ppb_05 + MRM (277.0 -> 203.0) M+C 0.5ppb_05.d x10 5.228 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 4.5 5.5 Acquisition Time (min) M+C_0.5ppb_06 M+C_0.5ppb_07 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang 118 Phụ lục 12: Độ tái lập - số liệu sắc ký đồ (1/3) Data File BLANK_07.d C_10ppb_07.d C_5ppb_04.d C_1ppb_04.d C_0.5ppb_04.d C_0.1ppb_04.d C_0.05ppb_04.d M+C 5ppb_01.d M+C 5ppb_02.d M+C 5ppb_03.d M+C 5ppb_04.d M+C 5ppb_05.d M+C 5ppb_06.d M+C 5ppb_07.d M+C 5ppb_08.d M+C 5ppb_09.d M+C 5ppb_10.d M+C 5ppb_11.d M+C 5ppb_12.d M+C 5ppb_13.d M+C 5ppb_14.d M+C 1ppb_01.d M+C 1ppb_02.d M+C 1ppb_03.d M+C 1ppb_04.d M+C 1ppb_05.d M+C 1ppb_06.d M+C 1ppb_07.d M+C 1ppb_08.d M+C 1ppb_09.d M+C 1ppb_10.d M+C 1ppb_11.d M+C 1ppb_12.d M+C 1ppb_13.d M+C 1ppb_14.d M+C 0.5ppb_01.d M+C 0.5ppb_02.d M+C 0.5ppb_03.d M+C 0.5ppb_04.d M+C 0.5ppb_05.d M+C 0.5ppb_06.d M+C 0.5ppb_07.d M+C 0.5ppb_08.d M+C 0.5ppb_09.d M+C 0.5ppb_10.d M+C 0.5ppb_11.d M+C 0.5ppb_12.d M+C 0.5ppb_13.d M+C 0.5ppb_14.d M+C 0.1ppb_01.d M+C 0.1ppb_02.d M+C 0.1ppb_03.d M+C 0.1ppb_04.d M+C 0.1ppb_05.d M+C 0.1ppb_06.d M+C 0.1ppb_07.d M+C 0.1ppb_08.d M+C 0.1ppb_09.d M+C 0.1ppb_10.d M+C 0.1ppb_11.d M+C 0.1ppb_12.d M+C 0.1ppb_13.d M+C 0.1ppb_14.d Luận văn thạc sĩ Compound CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU CLENBU Sample Type Blank Calibration Calibration Calibration Calibration Calibration Calibration Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Exp Conc (ppb) 10.0000 5.0000 1.0000 0.5000 0.1000 0.0500 Response 18743 9325 1944 980 211 99 8361 9213 7802 8252 9207 10134 8378 8331 8535 10080 8375 7393 7815 8863 1944 1720 1619 1750 1533 1952 1333 1505 1425 1773 1909 2050 1741 1546 832 982 691 878 759 854 933 701 790 862 677 945 856 836 203 135 134 174 149 166 145 192 145 142 194 149 166 137 Final Conc (ppb) 0.000 10.006 4.978 1.038 0.523 0.113 0.053 4.464 4.918 4.165 4.405 4.915 5.140 4.473 4.384 4.491 5.304 4.407 3.890 4.112 4.663 1.038 0.918 0.864 0.934 0.818 1.042 0.811 0.866 0.750 0.933 1.005 1.031 0.916 0.814 0.438 0.514 0.386 0.469 0.405 0.456 0.497 0.369 0.416 0.454 0.359 0.497 0.450 0.440 0.096 0.072 0.072 0.093 0.080 0.089 0.078 0.101 0.076 0.075 0.101 0.078 0.087 0.073 Rec (%) SDR (ppb) RSDR (%)  (ppb) 89.3 98.4 83.3 88.1 98.3 102.8 89.5 87.7 89.8 106.1 88.1 77.8 82.2 93.3 0.398 8.74 0.230 0.094 10.37 0.054 0.048 10.88 0.028 0.011 12.79 0.006 103.8 91.8 86.4 93.4 81.8 104.2 81.1 86.6 75.0 93.3 100.5 103.1 91.6 81.4 87.6 102.8 77.3 93.7 81.1 91.2 99.5 73.8 83.2 90.7 71.7 99.5 90.1 88.0 95.5 72.2 71.6 92.7 79.6 88.7 77.6 100.9 76.2 74.6 101.3 78.5 87.4 72.8 Nguyễn Thị Chân Trang 119 Phụ lục 12: Độ tái lập - số liệu sắc ký đồ (2/3) 277.0 -> 203.0 , 277.0 -> 259.0 x10 Ratio=40.5 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn nồng độ 5ppb + MRM (5.134-5.444 min, 46 scans) (277.… x10 203.0 1.75 1.5 1.25 1 0.8 0.6 0.4 0.2 4.5 5.5 Acquisition Time (min) 277.0 -> 203.0 , 277.0 -> 259.0 x10 Ratio=40.6 0.8 0.6 0.4 0.2 4.5 5.5 Acquisition Time (min) 0.75 0.5 0.25 259.0 277.0 200 220 240 260 280 Mass-to-Charge (m/z) + MRM (5.125-5.450 min, 49 scans) (277.… x10 2.25 1.75 1.5 1.25 0.75 0.5 0.25 203.0 259.0 277.0 200 220 240 260 280 Mass-to-Charge (m/z) Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn nồng độ 1ppb + MRM (277.0 -> 203.0) M+C 1ppb_14.d x10 5.263 2.5 1.5 0.5 4.5 Luận văn thạc sĩ 5.5 Acquisition Time (min) Nguyễn Thị Chân Trang 120 Phụ lục 12: Độ tái lập - số liệu sắc ký đồ (3/3) Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn nồng độ 0.5ppb 277.0 -> 203.0 , 277.0 -> 259.0 x10 Ratio=46.0 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn nồng độ 0.1ppb x10 2.5 0.8 0.6 259.0 203.0 1.5 0.4 0.2 0.5 -0.2 4.5 Luận văn thạc sĩ + MRM (5.120-5.383 min, 39 scans) (277.… 5.5 Acquisition Time (min) 277.0 200 220 240 260 280 Mass-to-Charge (m/z) Nguyễn Thị Chân Trang 121 Phụ lục 13: Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ S/N Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang 122 Phụ lục 14: Tính tốn độ khơng đảm bảo đo (1/5) SAI SỐ DO THIẾT BỊ (Tính số lần chích chuẩn; n =18) uTB/TB = SD/(n)1/2 Ci (ppb) Ai ki Ci (ppb) Ai ki SD UTB/TB 1.78E-05 100 5.00E-04 1959 5.10E-04 4.21E-06 0.05 1.00 102 4.90E-04 1905 5.25E-04 107 4.67E-04 1979 5.05E-04 197 5.08E-04 9372 5.34E-04 0.10 5.00 202 4.95E-04 9309 5.37E-04 198 5.05E-04 9416 5.31E-04 974 5.13E-04 19063 5.25E-04 0.50 10.00 964 5.19E-04 18975 5.27E-04 967 5.17E-04 18846 5.31E-04 CHUẨN: Cân 1.143mg chuẩn Clenbuterol vào bình định mức 10ml ta thu chuẩn Co 100ppm Pha chuẩn Co: Cân 1.143mg chuẩn định mức 10ml Cân 1.143 mg chuẩn: u1 uc sqrt(3) u1 x1 u1/x1 0.013 1.7321 0.00751 100.000 7.5056E-05 Sai số bình định mức 10ml: u2 ub sqrt(6) u2 x2 u2/x2 0.025 2.4495 0.0102 10 0.00102 Sai số thay đổi thể tích bình định mức 10ml: u3 t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u3 x3 u3/x3 25 20 10 1.7321 0.0061 10 0.00061 UCo/Co = 0.001189 Pha chuẩn C1: Rút 1ml dd chuẩn Co định mức 10ml thu chuẩn 10ppm Sai số pipet 1ml : sqrt(6) u4 x4 u4/x4 up 0.01 2.4495 0.0041 0.004082 Thay đổi thể tích pipet 1ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u5 x5 u5/x5 25 20 1.7321 0.0006 0.00061 Sai số bình định mức 10ml : ub sqrt(6) u6 x6 u6/x6 0.025 2.4495 0.0102 10 0.00102 Thay đổi thể tích bình định mức 10ml t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u7 x7 u7/x7 25 20 10 1.7321 0.0061 10 0.00061 UC1/C1= 0.004456 Chuẩn C2(100ppb): Rút 1.0ml dd chuẩn C1 định mức 100ml thu chuẩn 100ppb Sai số pipet 1.0ml up sqrt(6) u8 x8 u8/x8 0.01 2.4495 0.0041 0.004082 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang 123 Phụ lục 14: Tính tốn độ khơng đảm bảo đo (2/5) Thay đổi thể tích pipet 1ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) 25 20 1.7321 Sai số bình định mức 100ml ub sqrt(6) u10 x10 0.1 2.4495 0.0408 100 Thay đổi thể tích bình định mức 100ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) 25 20 100 1.7321 u9 0.0006 x9 u9/x9 0.00061 u10/x10 0.00041 u11 0.0606 x11 100 u11/x11 0.00061 UC2/C2= 0.006118 Chuẩn C3 (50ppb): Rút 0.5ml dd chuẩn C1 định mức 100ml thu chuẩn 50ppb Sai số pipet 0.5ml up sqrt(6) u12 x12 u12/x12 0.006 2.4495 0.0024 0.5 0.0049 Thay đổi thể tích pipet 0.5ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u13 x13 u13/x13 25 20 0.5 1.7321 0.00030 0.5 0.00061 Sai số bình định mức 100ml ub sqrt(6) u14 x14 u14/x14 0.1 2.4495 0.0408 100 0.00041 Thay đổi thể tích bình định mức 100ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u15 x15 u15/x15 25 20 100 1.7321 0.0606 100 0.00061 UC3/C3= 0.006690 Chuẩn C4 (25ppb): Rút 0.25ml dd chuẩn C1 định mức 100ml thu chuẩn 25ppb Sai số pipet 0.5ml up sqrt(6) u16 x16 u16/x16 0.006 2.4495 0.0024 0.25 0.0098 Thay đổi thể tích pipet 0.5ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u17 x17 u17/x17 25 20 0.5 1.7321 0.00030 0.25 0.00121 Sai số bình định mức 100ml ub sqrt(6) u18 x18 u18/x18 0.1 2.4495 0.0408 100 0.00041 Thay đổi thể tích bình định mức 100ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u19 x19 u19/x19 25 20 100 1.7321 0.0606 100 0.00061 UC4/C4= 0.010856 Chuẩn C5 (10ppb): Rút 0.1ml dd chuẩn C1 định mức 100ml thu chuẩn 10ppb Sai số pipet 0.1ml up sqrt(6) u20 x20 u21/x21 0.001 2.4495 0.0004 0.1 0.0041 Thay đổi thể tích pipet 0.1ml: Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang 124 Phụ lục 14: Tính tốn độ khơng đảm bảo đo (3/5) t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) 25 20 0.1 1.7321 Sai số bình định mức 100ml ub sqrt(6) u22 x22 0.1 2.4495 0.0408 100 Thay đổi thể tích bình định mức 100ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) 25 20 100 1.7321 u21 0.00006 x21 0.1 u23/x23 0.00061 u22/x22 0.00041 u23 0.0606 x23 100 u23/x23 0.00061 UC5/C5= 0.006118 Chuẩn C6 (5ppb): Rút 0.05ml dd chuẩn C1 định mức 100ml thu chuẩn 5ppb Sai số pipet 0.1ml up sqrt(6) u24 x24 u24/x24 0.001 2.4495 0.0004 0.05 0.0082 Thay đổi thể tích pipet 0.1ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u25 x25 u25/x25 25 20 0.1 1.7321 0.00006 0.05 0.00121 Sai số bình định mức 100ml ub sqrt(6) u26 x26 u26/x26 0.1 2.4495 0.0408 100 0.00041 Thay đổi thể tích bình định mức 100ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u27 x27 u27/x27 25 20 100 1.7321 0.0606 100 0.00061 UC6/C6= 0.009409 Chuẩn C7 (1ppb): Rút 1ml dd chuẩn C2 định mức 100ml thu chuẩn 1ppb Sai số pipet 1ml up sqrt(6) u28 x28 u28/x28 0.01 2.4495 0.0041 0.0041 Thay đổi thể tích pipet 0.1ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u29 x29 u29/x29 25 20 1.7321 0.00061 0.00061 Sai số bình định mức 100ml ub sqrt(6) u30 x30 u30/x30 0.1 2.4495 0.0408 100 0.00041 Thay đổi thể tích bình định mức 100ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u31 x31 u31/x31 25 20 100 1.7321 0.0606 100 0.00061 UC7/C7= 0.007416 Chuẩn C8 (0.5ppb): Rút 1ml dd chuẩn C3 định mức 100ml thu chuẩn 0.5ppb Sai số pipet 1ml up sqrt(6) u32 x32 u32/x32 0.01 2.4495 0.0041 0.0041 Thay đổi thể tích pipet 0.1ml: Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang 125 Phụ lục 14: Tính tốn độ khơng đảm bảo đo 4/5) t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) 25 20 1.7321 Sai số bình định mức 100ml ub sqrt(6) u34 x34 0.1 2.4495 0.0408 100 Thay đổi thể tích bình định mức 100ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) 25 20 100 1.7321 u33 0.00061 x33 u33/x33 0.00061 u34/x34 0.00041 u35 0.0606 x35 100 u35/x35 0.00061 UC8/C8= 0.007895 Chuẩn C9 (0.1ppb): Rút 1ml dd chuẩn C5 định mức 100ml thu chuẩn 0.1ppb Sai số pipet 1ml up sqrt(6) u36 x36 u36/x36 0.01 2.4495 0.0041 0.0041 Thay đổi thể tích pipet 0.1ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u37 x37 u37/x37 25 20 1.7321 0.00061 0.00061 Sai số bình định mức 100ml ub sqrt(6) u38 x38 u38/x38 0.1 2.4495 0.0408 100 0.00041 Thay đổi thể tích bình định mức 100ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u39 x39 u39/x39 25 20 100 1.7321 0.0606 100 0.00061 UC9/C9= 0.007416 Chuẩn C10 (0.05ppb): Rút 1ml dd chuẩn C6 định mức 100ml thu chuẩn 0.05ppb Sai số pipet 1ml up sqrt(6) u40 x40 u40/x40 0.01 2.4495 0.0041 0.0041 Thay đổi thể tích pipet 0.1ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u41 x41 u41/x41 25 20 1.7321 0.00061 0.00061 Sai số bình định mức 100ml ub sqrt(6) u42 x42 u42/x42 0.1 2.4495 0.0408 100 0.00041 Thay đổi thể tích bình định mức 100ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) u43 x43 u43/x43 25 20 100 1.7321 0.0606 100 0.00061 UC10/C10= 0.010300 UC/C = 0.025014 Độ không đảm bảo đo chuẩn: SAI SỐ DO Q TRÌNH XỬ LÝ MẪU Cân xác khoảng 5g mẫu, sau trình xử lý mẫu, định mức lại 1ml hỗn hợp methanol/ nước (1/1) Sai số cân Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân Trang 126 Phụ lục 14: Tính tốn độ khơng đảm bảo đo (5/5) u30 sqrt(3) u44 x44 0.005 1.7321 0.0029 Sai số pipet 1ml up sqrt(6) u45 x45 0.01 2.4495 0.0041 Sai số thay đổi thể tích pipet 1ml: t2(oC) t1(oC) V(ml) sqrt(3) 25 20 1.7321 u44/x44 0.00058 u45/x45 0.0041 u46 0.00061 x46 u46/x46 0.00061 UM/M= 0.004167 Uth/X = 0.025359 Utq/X = 0.050717 Độ không đảm bảo đo tổng quát với độ tin cậy 95% hệ số phủ k=2 Ví dụ: Nồng độ Clenbuterol thịt heo X=5ppb, độ không đảm bảo tổng quát Utq: Utq = 0.253586 (ppb) Độ không đảm bảo đo q trình xử lý mẫu: Độ khơng đảm bảo đo tổng hợp: Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Chân ... TÀI: ? ?Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định dư lượng Clenbuterol thịt heo kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ? ?? 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: 2.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định dư lượng Clenbuterol. .. khối phổ HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao LC/MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ LC/MS/MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ lần LC/MSn Sắc ký lỏng ghép khối phổ n lần LOD Giới hạn phát phương pháp LOQ Giới hạn định lượng. .. phương pháp xác định dư lượng clenbuterol thịt heo kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ, nhằm khắc phục nhược điểm phương pháp GCMS phương pháp có tính sàng lọc ELISA, đồng thời đa dạng hóa phương pháp