Nghiên cứu xây dựng phương pháp LC MS MS định lượng methylprednisolon trong huyết tương người

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI DS NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS ĐỊNH LƢỢNG METHYLPREDNISOLON TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI DS NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS ĐỊNH LƢỢNG METHYLPREDNISOLON TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ CHUYÊN NGÀNH 60720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đoàn Cao Sơn TS Tạ Mạnh Hùng HÀ NỘI 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đoàn Cao Sơn, TS Tạ Mạnh Hùng - Viện Kiểm nghiệm thuốc TW tận tình hướng dẫn, quan tâm tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán Trung tâm đánh giá Tương đương sinh học – Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, giúp đỡ suốt trình học tập thực luận văn Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc – Trung tâm Kiểm nghiệm Hà Nội tạo điều kiện cho tham gia chương trình đào tạo thạc sỹ Dược trường Đại học Dược Hà Nội Tôi chân thành cảm ơn Ban giám hiệu thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho trau dồi kiến thức kinh nghiệm quí báu suốt trình học tập trường Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia đình, toàn thể bạn bè giúp đỡ động viên trình học tập nghiên cứu Hà Nội, Ngày tháng năm 2017 Nguyễn Thị Hồng Hạnh MỤC LỤC Danh mục k hiệu chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ .1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 PHÂN TÍCH THUỐC TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG LCMS/MS 1.1.1 Kỹ thuật xử l mẫu : 1.1.2 Kỹ thuật phân tích LC-MS/MS: 1.1.3 Các yêu cầu, tiêu thẩm định phương pháp LC-MS/MS phân tích thuốc dịch sinh học: 1.2 MPN VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG HUYẾT TƢƠNG 10 1.2.1 Tổng quan MPN : 10 1.2.2 Các phương pháp phân tích MPN huyết tương : 12 Chƣơng : ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 16 2.2 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 17 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích : 17 2.3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ xác định MPN chuẩn nội : 17 2.3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc k : 18 2.3.1.3 Khảo sát quy trình xử l mẫu huyết tương : 18 2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng MPN : 19 2.3.2.1 Thẩm định độ chọn lọc phương pháp : 19 2.3.2.2 Xây dựng đường chuẩn : 19 2.3.2.3 Xác định giới hạn định lượng (LLOQ) : 19 2.3.2.4 Thẩm định độ đúng, độ xác ngày khác ngày : 19 2.3.2.5 Xác định tỷ lệ thu hồi chất chuẩn chuẩn nội : 20 2.3.2.6 Nghiên cứu độ ổn định MPN : 20 2.3.3 Ứng dụng phương pháp xây dựng để định lượng MPN mẫu tương đương sinh học : 21 2.3.4 Xử l số liệu : 22 Chƣơng 3: KẾT QUẢN NGHIÊN CỨU 23 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 23 3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ định lượng MPN chuẩn nội : 23 3.1.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ định lượng MPN: 23 3.1.1.2 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội : 26 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc k : 27 3.1.3 Xây dựng quy trình xử l mẫu huyết tương: 29 3.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 34 3.2.1 Độ chọn lọc phương pháp : 35 3.2.2 Xác định giới hạn định lượng dưới: 38 3.2.3 Xây dựng đường chuẩn: 39 3.2.4 Độ – độ xác ngày khác ngày: 40 3.2.5 Xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất nội chuẩn: 42 3.2.6 Nghiên cứu độ ổn định: 43 3.2.6.1 Độ ổn định nhiệt độ phòng thời gian ngắn: 44 3.2.6.2 Độ ổn định sau chu kỳ đông – rã đông: 44 3.2.6.3 Độ ổn định mẫu sau xử l (trong autosampler) : 45 3.2.6.4 Độ ổn định dài ngày: 46 3.3 ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỊNH LƢỢNG MPN TRÊN MẪU TĐSH VIÊN NÉN MPN 47 Chƣơng 4: BÀN LUẬN 51 4.1 Phương pháp xử l mẫu : 51 4.2 Phương pháp phân tích MPN huyết tương người : 52 4.3 Về áp dụng phương pháp xây dựng để định lượng MPN mẫu TĐSH viên nén MPN 16mg: 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .55 I KẾT LUẬN: .55 Về xây dựng phƣơng pháp phân tích: 55 Về thẩm định phƣơng pháp phân tích: 55 Ứng dụng phƣơng pháp mẫu thử TĐSH viên nén MPN 16mg: 55 II KIẾN NGHỊ .56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ANOVA : Phân tích phương sai (Analysis of Variance) AUC : Diện tích đường cong (Area Under Curve) BP : Dược điển Anh (The British Pharmacopoeia) Cmax : Nồng độ thuốc tối đa (Maximum Concentration) Cmin : Nồng độ thuốc tối thiểu (Minimum Concentration) DĐH : Dược động học EMA : Cơ quan quản l thuốc Châu âu (European Medicine Agency) HPLC : Sắc k lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HQC : Mẫu kiểm tra nồng độ cao (High Quality Control Sample) IS : Chuẩn nội (Internal Standard) LC/MS : Sắc k lỏng khối phổ (Liquid Chromatography – Mass spectrometry) LLOQ : Giới hạn định lượng (Lower Limit of Quantification) LQC : Mẫu kiểm tra nồng độ thấp (Low Quality Control Sample) MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol MPN : Methylprednisolon MQC : Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình (Middle Quality Control Sample) MS : Khối phổ (Mass Spectrometry) NTN : Người tình nguyện RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SKD : Sinh khả dụng TĐSH : Tương đương sinh học Tmax : Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa ULOQ : Giới hạn định lượng (Upper limit of Quantification) US-FDA : Cục quản l thuốc thực phẩm Mỹ (The United States Food and Drug Admistration) USP : Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopoeia) Xtb : Trung bình DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Tên bảng STT Trang Bảng 1.1: Các thông số dược động học MPN số nghiên cứu BA/BE đơn liều 11 Bảng 1.2: Một số phương pháp phân tích MPN huyết tương 13 Bảng 3.1: Điều kiện sắc k 33 Bảng 3.2: Điều kiện khối phổ để định lượng MPN IS 33 Bảng 3.3: Cách chuẩn bị dung dịch CC-W 34 Bảng 3.4: Cách chuẩn bị mẫu QC huyết tương Bảng 3.5: Ảnh hưởng mẫu trắng thời điểm trùng thời gian lưu MPN 35 Bảng 3.6: Ảnh hưởng mẫu trắng thời điểm trùng thời gian lưu IS 37 37 Bảng 3.7: Kết xác định giới hạn định lượng Bảng 3.8: Sự tương quan nồng độ MPN huyết tương tỷ lệ đáp ứng pic MPN/IS 38 11 Bảng 3.9: Kết khảo sát độ đúng, độ xác ngày 40 12 Bảng 3.10: Kết khảo sát độ đúng, độ xác khác ngày 41 13 Bảng 3.11: Kết xác định tỷ lệ thu hồi IS Bảng 3.12: Kết xác định tỷ lệ thu hồi MPN 42 Bảng 3.13: Độ ổn định nhiệt độ phòng Bảng 3.14: Kết nghiên cứu độ ổn định MPN mẫu huyết tương sau chu kỳ đông – rã đông Bảng 3.15: Kết nghiên cứu độ ổn định MPN mẫu huyết tương sau xử l autosampler 44 18 Bảng 3.16: Kết độ ổn định dài ngày mẫu huyết tương 47 19 Bảng 3.17: Nồng độ MPN huyết tương NTN NTN sau uống liều mẫu thuốc thử (A) thuốc chứng (B) 16 mg MPN 49 20 Bảng 3.18: Các thông số dược động học MPN người tình nguyện sau uống viên nén MPN 16 mg 50 10 14 15 16 17 39 43 45 46 DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN STT Tên hình Trang Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC Hình 1.2: Sơ đồ cấu tạo hệ thống phổ khối tứ cực chập ba Hình 3.1: Phổ khối [MPN-H]+ 23 Hình 3.2: Giản đồ điện phận thấu kính hội tụ 24 Hình 3.3: Giản đồ cường độ tín hiệu mảnh ion tạo thành từ [MPN-H]+ 25 Hình 3.4: Phổ khối phân tích mảnh [MPN-H]+ mức 20 V Hình 3.5: Sắc k đồ MPN IS với hệ pha động methanol - acid formic 0,1% (90-10) (a); methanol – amonia cetat mM (90-10) (b); acetonitril – amoni acetat mM có tỷ lệ (50-50) (c) (70-30) (d) Hình 3.6: Sắc k đồ MPN IS với hệ pha động acetonitril - amoni acetat mM (90-10): (e) 26 28 28 Hình 3.7: Sắc k đồ mẫu huyết tương trắng tủa protein acetonitril (a) methanol (b) 30 10 Hình 3.8: Sắc k đồ mẫu huyết tương trắng chiết lỏng – lỏng dung môi lựa chọn 31 11 Hình 3.9: Sắc k đồ mẫu huyết tương chuẩn chứa MPN IS chiết lỏng – lỏng dung môi lựa chọn 31 12 13 14 15 Hình 3.10: Sắc k đồ mẫu huyết tương trắng Hình 3.11: Sắc k đồ mẫu huyết tương trắng có pha IS nồng độ 2,5 ng/ml Hình 3.12: Sắc k đồ mẫu chuẩn MPN IS huyết tương nồng độ 2,5 ng/ml Hình 3.13: Đường cong nồng độ thuốc trung bình theo thời gian NTN sau uống liều mẫu thuốc thử chứng 35 36 36 48 ĐẶT VẤN ĐỀ Ở nước ta việc nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng (SKD) tương đương sinh học (TĐSH) thực phổ biến nhằm đảm bảo tính an toàn hiệu thuốc lưu hành nước Hiện nhà nước ban hành quy chế quy định nghiên cứu SKD TĐSH như: Quy định thuốc hồ sơ đăng k phải có đầy đủ kết nghiên cứu SKD [3], thuốc generic có quy định danh mục thuốc phải đánh giá TĐSH [4] Methylprednisolon (MPN) thuốc chống viêm, chống dị ứng thuộc nhóm glucocorticoid, thuốc có nhu cầu sử dụng lớn Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm nên số người mắc bệnh khớp, dị ứng chiếm tỷ lệ cao Methylprednisolon sản xuất nhiều dạng bào chế, thuốc bột đông khô pha tiêm, có số lượng lớn chế phẩm viên nén mg, 16 mg Theo thống kê Cục quản l Dược cuối năm 2016 có tới 50 số đăng k chế phẩm viên nén methylprednisolon hàm lượng mg , 16 mg doanh nghiệp dược Việt Nam, Ấn độ, Hàn Quốc sản xuất Đại đa số chế phẩm viên nén lưu hành thị trường Việt Nam chưa có nghiên cứu so sánh SKD, TĐSH với thuốc đối chứng Do vậy, cần thiết phải thực nghiên cứu so sánh SKD, TĐSH thuốc để nâng cao chất lượng thuốc sản xuất lưu hành thị trường Việt Nam, thực sản xuất cung ứng thuốc có chất lượng, an toàn, hiệu với giá thành phù hợp tới tay người bệnh thực sánh quốc gia thuốc Đánh giá sở cho việc lựa chọn thuốc thay hay hiệu chỉnh liều dùng bác sĩ thực hành lâm sàng Để thực nghiên cứu SKD TĐSH, cần phải xây dựng thẩm định phương pháp phân tích methylprednisolon huyết tương người Hiện nay, phân tích methylprednisolon huyết tương người gặp nhiều khó khăn nồng độ thuốc máu thấp, mẫu phức tạp có nhiều thành phần tạp chất gây ảnh hưởng tới trình phân tích Ở Việt Nam chưa có phương pháp phân tích methylprednisolon huyết tương công bố Bảng 3.15: Kết nghiên cứu độ ổn định MPN mẫu huyết tương sau xử lý autosampler Nồng độ (ng/ml) STT Mẫu HQC (≈ 8,0 ng/ml) (≈ 400 ng/ml) Ban đầu Sau 44 Ban đầu Sau 44 7,8 7,4 415,8 401,4 7,4 7,4 410,5 394,3 7,8 7,6 401,8 407,1 7,5 6,9 403,6 405,6 8,0 6,8 429,1 403,5 6,6 6,8 406,8 417,6 TB 7,5 7,1 411,3 405 CV (%) 6,3 5,0 2,5 1,9 Độ lệch (%) - Mẫu LQC -4,9 -1,6 Kết Bảng 3.15 cho thấy, nồng độ MPN mẫu QC khác biệt không 10% so với nồng độ ban đầu Do vậy, kết luận MPN ổn định mẫu huyết tương sau xử lý bảo quản phận tiêm mẫu tự động 44 3.2.6.4 Độ ổn định dài ngày: - Nghiên cứu độ ổn định MPN mẫu huyết tương bảo quản nhiệt độ -35 ± 5oC 28, 78 103 ngày theo phương pháp trình bày phần 2.3.2.6 Kết đánh giá trình bày Bảng 3.16 46 Bảng 3.16: Kết độ ổn định dài ngày mẫu huyết tương Nồng độ (ng/ml) Mẫu LQC (≈ 8,0 ng/ml) STT Ban đầu Sau 28 ngày Sau 78 ngày Sau 103 ngày 7,6 381,9 413,1 416,8 406,4 7,2 7,5 410,4 409,5 416,8 419,6 6,9 7,3 7,4 401,9 405,4 401,1 402,2 7,0 7,6 6,7 7,7 383,1 406,0 414,6 384,7 7,5 6,5 6,7 6,6 405,8 395,9 415,6 406,4 7,1 7,4 7,0 8,4 385,3 399,8 410,5 399,3 TB 7,3 7,2 7,0 7,6 394,7 404,9 412,6 403,1 CV(%) 2,8 6,3 3,7 7,6 3,2 1,6 1,5 2,8 Độ lệch (%) -1,0 -4,1 3,6 2,6 4,5 2,1 - - 3.3 - Mẫu HQC (≈ 400 ng/ml) Ban đầu Sau 28 ngày Sau 78 ngày Sau 103 ngày 7,3 7,3 7,0 7,4 7,7 7,5 Kết nghiên cứu cho thấy, nồng độ MPN mẫu bảo quản điều kiện -35 ± 0C vòng 28, 78 103 ngày so với nồng độ MPN mẫu pha khác không 5% Như MPN ổn định huyết tương bảo quản điều kiện -35 ± 0C vòng khoảng 100 ngày Như vậy, phương pháp xây dựng có đủ độ chọn lọc độ tin cậy để áp dụng cho nghiên cứu TĐSH ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỊNH LƢỢNG MPN TRÊN MẪU TĐSH VIÊN NÉN MPN Lấy mẫu máu NTN sau uống thuốc thử thuốc chứng thời điểm khác nghiên cứu TĐSH thiết kế mục 2.3.3, tiến hành phân tích theo quy trình xây dựng, thẩm định Tổng thời gian từ bắt đầu lấy mẫu kết thúc trình phân tích (phân tích xong số mẫu huyết tương NTN) nhỏ thời gian đánh giá độ ổn định mẫu (khoảng 100 ngày) Kết phân tích trình bày Bảng 3.17 Hình 3.12 47 Hình 3.13: SKĐ pic MPN đường cong nồng độ thuốc trung bình theo thời gian NTN sau uống liều mẫu thuốc thử chứng 48 Bảng 3.17: Nồng độ MPN huyết tương NTN NTN sau uống liều mẫu thuốc thử (A) thuốc chứng (B) 16 mg MPN - Thời gian (h) NTN NTN Thuốc thử (A) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,33 15,8 4,8 2,4 40,7 0,67 41,8 19,0 20,6 112,5 1,0 79,1 42,0 93,8 115,8 1,5 101,2 62,8 113,9 98,0 2,0 95,5 89,5 100,2 83,5 2,5 96,1 116,3 78,8 70,5 75,7 105,9 78,4 68,2 65,0 75,5 54,3 44,6 38,2 53,1 42,7 31,8 26,7 36,0 29,1 21,8 14,9 21,5 14,5 12,8 10 7,2 9,8 8,6 6,6 12 3,7 6,3 5,0 3,6 24 0,0 0,0 0,0 0,0 Thuốc chứng Thuốc thử Thuốc chứng (B) (A) (B) Từ kết nghiên cứu trên, thấy:  Giá trị nồng độ thuốc thời điểm trước uống thuốc ng/ml với thuốc thử thuốc chứng Như vậy, khoảng thời gian lấy mẫu máu NTN trước uống thuốc huyết tương NTN MPN trạng thái ổn định  Cmax nằm khoảng từ 101,2 – 113,9 ng/ml với thuốc thử (A) 115,8 – 116,3 ng/ml với thuốc chứng (B), nhỏ nồng độ ULOQ (500 ng/ml) đường chuẩn Mẫu có nồng độ thấp 3,7 ng/ml với thuốc thử (A) 3,6 ng/ml với thuốc chứng (B), lớn giá trị LLOQ (2,5 ng/ml) Tất mẫu NTN uống MPN có nồng độ MPN nằm khoảng tuyến tính khảo sát, không điểm đường chuẩn Như vậy, phương pháp xây 49 - dựng phù hợp với thực tế thử nghiệm đánh giá tương đương sinh học Từ kết định lượng MPN huyết tương NTN (Bảng 3.17), xác định thông số DĐH thuốc theo phương pháp ghi mục 2.3.3 Kết xác định trình bày bảng 3.18 Bảng 3.18: Các thông số dược động học MPN người tình nguyện sau uống viên nén MPN 16 mg NTN Thông số DĐH NTN Thuốc thử (A) Thuốc chứng (B) Thuốc thử (A) Thuốc chứng (B) Cmax (ng/ml) 101,2 116,8 113,9 115,8 Cmin (ng/ml) 3,7 6,3 5,0 3,6 409,6 442,8 407,8 399,3 Tmax (h) 420,7 1,5 462,5 2,5 424,2 1,5 410,7 T1/2 (h) 2,1 2,2 2,3 2,2 AUC0-t (ng.h/ml) AUC0-∞ (ng.h/ml) - Đường cong biểu diễn nồng độ thuốc – thời gian thuốc thử thuốc chứng có điểm lấy mẫu phân bố phù hợp Tmax T1/2 tương tự với nghiên cứu tham khảo Các thông số dược động học thuốc thử thuốc chứng có tương đồng 50 Chƣơng 4: BÀN LUẬN Vận dụng kiến thức cấu trúc hóa học, tính chất vật lý hoạt chất MPN, lý thuyết bản, đồng thời tham khảo nghiên cứu định lượng MPN đặc biệt kết nghiên cứu thực tiễn xử lý mẫu huyết tương phân tích mẫu hệ thống LC-MS/MS, xây dựng phương pháp phân tích định lượng MPN huyết tương người dựa kỹ thuật LC-MS/MS Phương pháp thẩm định đầy đủ đạt yêu cầu phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học theo hướng dẫn hành US-FDA Kết áp dụng phương pháp nghiên cứu TĐSH MPN cho thấy phương pháp xây dựng phù hợp có tính khả thi Từ trình thực nghiệm có số bàn luận sau: Phƣơng pháp xử lý mẫu : Việc xây dựng quy trình xử lý mẫu cho tỷ lệ thu hồi cao ổn định đóng vai trò quan trọng phân tích chất huyết tương mẫu huyết tương phức tạp nên đưa thẳng vào hệ thống phân tích Để phân tích MPN có nồng độ thấp huyết tương NTN mà mẫu có thành phần tương đối phức tạp nên cần xử lý mẫu để loại bỏ thành phần tạp chất có mẫu, tạo điều kiện trình phân tách định lượng MPN phương pháp LC-MS/MS Do MPN hoạt chất có tính tan tốt dung môi hữu cơ, áp dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng để xử lý phân tách mẫu Sau trình khảo sát xác định dung môi chiết thích hợp tert-butyl methyl ether theo quy trình: Lắc học ngang phút, ly tâm 3000 vòng/phút phút, hút lớp phía trên, bốc dòng khí nitơ nhiệt độ 40oC, thu cắn, sau thêm pha động, lắc xoáy 30 giây hòa tan cắn để hòa tan cắn Phương pháp chiết cho thấy mẫu sau chiết độ thu hồi cao, ổn định có độ tinh mẫu (đường nhiễu) đáp ứng tốt sử dụng phương pháp phân tích LC/MS-MS Với quy trình xử lý mẫu xây dựng, tỷ lệ thu hồi MPN cao, đạt (96,6% - 111,3% ba khoảng nồng độ thấp, trung bình, cao), thời gian bay dung môi tương đối ngắn (khoảng 3-5 phút) phù hợp cho việc xử lý hàng loạt mẫu ngày phân tích Ngoài quy trình xử lý mẫu 4.1 51 xây dựng đơn giản, tiết kiệm, phù hợp với điều kiện trang thiết bị chưa đại Việt Nam Do vậy, qui trình dễ áp dụng, triển khai xử l lượng mẫu cần phân tích lớn nghiên cứu SKD TĐSH So với kỹ thuật xử lý mẫu Xingjiang Hu cộng [27], cho mẫu huyết tườn tủa protein methanol sau sử dụng chiết pha rắn Đây kỹ thuật tương đối phức tạp chi phí cao, trang thiết bị đại (bộ chiết pha rắn tự động kết nối với phân tích mẫu) Kỹ thuật xử lý luận văn (chiết lỏng – lỏng dung môi hưu cơ) đơn giản hơn, dễ dàng triển khai mang lại hiệu kinh tế cao nghiên cứu SKD đánh giá TĐSH Trong nghiên cứu phân tích MPN phương pháp LC/MS/MS [23] Sridhar Siddiraju cộng (nghiên cứu Ấn độ) sử dụng phương pháp xử l mẫu chiết lỏng – lỏng tert-butyl methyl ether việc xử l mẫu nghiên cứu lại cho hiệu suất chiết không cao từ 74,9 – 75,5% Tương tự nghiên cứu [22] Shuang-Qing Zhang cộng mẫu xử l phương pháp chiết lỏng - lỏng với tert-butyl methyl ether, nhiên độ thu hồi thấp từ 76,8% đến 79,2% Phƣơng pháp phân tích MPN huyết tƣơng ngƣời : Trước có số phương pháp định lượng MPN huyết tương công bố số tài liệu, nhiên phương pháp số hạn chế thời gian phân tích dài giới hạn định lượng (LLOQ) độ nhạy Tác giả Ursula Geister cộng [25] xây dựng phương pháp HPLCUV để định lượng MPN huyết tương Phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực phòng thí nghiệm thiết bị phân tích đơn giản rẻ so với thiết bị MS Giới hạn định lượng 2,5 ng/ml độ từ 96,1% – 103,5% đạt yêu cầu phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học Tuy nhiên, thời gian phân tích dài 13 phút nên khó áp dụng phương pháp để phân tích lượng mẫu lớn nghiên cứu đánh giá TĐSH SKD Một số phương pháp khác có giới hạn định lượng tương đối cao khó áp dụng nghiên cứu TĐSH SKD thuốc có hàm lượng thấp, đơn liều: 4.2 52 Phương pháp HPLC – UV [21] Sayed M H Al-Habet cộng (nghiên cứu Anh) sử dụng detector UV = 254 nm có ưu điểm thiết bị phân tích phổ biến áp dụng nhiều sở phân tích Tuy nhiên phương pháp có nhược điểm thời gian phân tích dài (trên 8,5 phút) giới hạn định lượng (LLOQ) cao 25 ng/ml, độ nhạy 10 ng/ml, không phù hợp với việc phân tích định lượng MPN mẫu huyết tương thử TĐSH với liều thấp 4, 8, 16 mg Trong nghiên cứu phân tích MPN huyết tương phương pháp LC/MS/MS [23] Sridhar Siddiraju cộng (nghiên cứu Ấn độ) có ưu điểm thời gian phân tích mẫu ngắn 2,8 phút LLOQ = 10,1 ng/ml chưa phù hợp với nghiên cứu SKD TĐSH chế phẩm hàm lượng thấp Tương tự phương pháp LC/MS/MS [22] Shuang-Qing Zhang cộng có LLOQ 20 ng/ml chưa thích hợp để phân tích mẫu cần độ nhạy thấp mẫu TĐSH viên nén MPN cần độ nhạy khoảng 2-3 ng/ml, thời gian phân tích mẫu phút tương đối dài Phương pháp LC/MS/MS [27] Xingjiang Hu cộng (nghiên cứu Trung Quốc) có độ thu hồi cao ổn định Tuy nhiên phương pháp có giới hạn định lượng (LLOQ) 5,25 ng/ml lại xử l mẫu cách tủa protein sau chiết pha rắn, thời gian xử l mẫu thời gian phân tích mẫu 5,5 phút tương đối dài việc phân tích nghiên cứu mẫu TĐSH Để khắc phục điều này, tiến hành xây dựng phương pháp định lượng MPN dựa kỹ thuật LC-MS/MS sử dụng nguồn ion kiểu phun điện tử có gia nhiệt phận phân tích khối loại tứ cực chập ba hãng Thermo Scientific Phương pháp thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn FDA-Mỹ thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học Kết thẩm định cho thấy, phương pháp xây dựng có độ chọn lọc cao với MPN; có giới hạn định lượng thấp (2,5 ng/ml) phù hợp với phân tích mẫu MPN huyết tương cần độ nhạy 2-3 ng/ml; khoảng nồng độ tuyến tính rộng (2,5 – 500,0 ng/ml) áp dụng nghiên cứu TĐSH với chế phẩm MPN có hàm lượng cao; độ cao (giá trị trung bình từ 91,7% - 118,9%); độ lặp lại tốt với giá trị CV nhỏ (dưới 10%); tỷ lệ thu hồi hoạt chất cao ổn định (96,6% 111,3% ba khoảng nồng độ), đạt yêu cầu phương pháp phân tích 53 dịch sinh học theo FDA-Mỹ Với thời gian phân tích mẫu khoảng phút, phương pháp tương đối phù hợp việc định lượng nhiều mẫu ngày Phương pháp xây dựng có độ nhạy cao, thời gian phân tích ngắn, khoảng tuyến tính rộng nên ứng dụng nhiều nghiên cứu liên quan tới định lượng MPN dịch sinh học Ngoài ra, kết áp dụng phương pháp xây dựng nghiên cứu TĐSH MPN người cho thấy khoảng tuyến tính xây dựng phù hợp (các mẫu thử có nồng độ MPN nằm khoảng tuyến tính xây dựng) Về áp dụng phƣơng pháp xây dựng để định lƣợng MPN mẫu TĐSH viên nén MPN 16mg: Khi phân tích mẫu huyết tương NTN thiết kế thử TĐSH viên nén MPN 16 mg thấy kết phân tích mẫu có nồng độ nằm khoảng tuyến tính mà khảo sát (2,5 – 500 ng/ml) Cmax nằm khoảng từ 101,2 – 113,9 ng/ml với thuốc thử (A) 115,8 – 116,3 ng/ml với thuốc chứng (B), nhỏ nồng độ ULOQ (500 ng/ml) đường chuẩn Mẫu có nồng độ thấp Cmin 3,7 ng/ml với thuốc thử (A) 3,6 ng/ml với thuốc chứng (B), lớn giá trị LLOQ (2,5 ng/ml) Tất mẫu NTN uống MPN có nồng độ MPN nằm khoảng tuyến tính khảo sát, không điểm đường chuẩn Như vậy, phương pháp xây dựng phù hợp với thực tế thử nghiệm đánh giá tương đương sinh học Đường cong biểu diễn nồng độ thuốc – thời gian thuốc thử thuốc chứng có điểm lấy mẫu phân bố phù hợp Tmax T1/2 tương tự với nghiên cứu tham khảo Các thông số dược động học thuốc thử thuốc chứng có tương đồng Như vậy, kết nghiên cứu đáp ứng mục tiêu đề tài, xây dựng thẩm định phương pháp định lượng MPN huyết tương người thiết bị LC/MS-MS áp dụng phương pháp để định lượng MPN số mẫu thử TĐSH viên nén MPN 4.3 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN: Sau trình thực nghiệm, rút số kết luận sau: Về xây dựng phƣơng pháp phân tích: Đã xây dựng được điều kiện phân tích định lượng MPN huyết tương người LC-MS/MS sau: o Chất chuẩn nội: Prednisolon o Điều kiện sắc ký: C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm); nhiệt độ cột 400C; pha động Acetonitril - dung dịch amoni acetat mM (90 : 10); tốc độ dòng 0,35 ml/phút ; thể tích tiêm mẫu: 5µl; nhiệt độ autosampler 20 oC o Điều kiện khối phổ: Kiểu khối phổ: MS/MS, nguồn ion hóa HESI(+), mảnh 20 V với MPN 23 V với prednisolon Đã xây dựng quy trình chiết tách MPN từ huyết tương người phương pháp chiết lỏng – lỏng sử dụng dung môi tert-butyl methyl ether Về thẩm định phƣơng pháp phân tích: Đã tiến hành đầy đủ theo hướng dẫn FDA-Mỹ thẩm định phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học Kết thẩm định cho thấy phương pháp xây dựng chọn lọc với MPN, có giới hạn định lượng nhỏ (2,5 ng/ml), khoảng nồng độ tuyến tính rộng (2,5 – 500,0 ng/ml), độ cao (giá trị trung bình từ 91,7% - 118,9%); độ lặp tốt với giá trị CV nhỏ (dưới 10%), tỷ lệ thu hồi hoạt chất cao ổn định (96,6% - 111,3% ba khoảng nồng độ), MPN ổn định điều kiện bảo quản khác (5 nhiệt độ phòng, 44 autosampler, sau vòng đông rã 103 ngày nhiệt độ -40 0C) Ứng dụng phƣơng pháp mẫu thử TĐSH viên nén MPN 16mg: Đã ứng dụng phương pháp để định lượng MPN mẫu thử tương đương sinh học viên nén Methylprednisolon 16 mg Phương pháp phân tích xây dựng phù hợp với nghiên cứu đánh giá TĐSH viên nén MPN 16 mg 55 II KIẾN NGHỊ Sau thực đề tài, có số kiến nghị sau: o Phương pháp định lượng MPN huyết tương người mà xây dựng áp dụng nghiên cứu SKD TĐSH chế phẩm chứa dược chất MPN o Kỹ thuật LC-MS/MS có ưu điểm bật độ nhạy, tính đặc hiệu thời gian phân tích ngắn Do nên áp dụng kỹ thuật nghiên cứu SKD TĐSH, đặc biệt cho chế phẩm có liều dùng thấp 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Tử An (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất Y học, tr 84 – 110 Trần Tử An cộng (2007), Hóa phân tích, Nhà xuất Y học, tập 2, tr 107-121, 295-318 Bộ Y tế, Thông tư 44/2014/TT-BYT, ngày 25 tháng 11 năm 2014, Quy định việc đăng ký thuốc Bộ Y tế, Thông tư 08/2010/TT-BYT, ngày 26 tháng năm 2010, Hướng dẫn báo cáo số liệu nghiên cứu sinh khả dụng / tương đương sinh học đăng ký thuốc Bộ Y tế, Dược thư quốc gia (2009), chuyên luận Methylprednisolon Tào Duy Cần (2008), Thuốc biệt dược, NXB Y học Đào Văn Đôn (2010), Nghiên cứu định lượng Trimetazidin huyết tương người sắc ký lỏng – khối phổ, Luận văn thạc sỹ dược học, Học viện Quân Y Tạ Mạnh Hùng (2006), Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học viên nang Cefaclor Stada ® 250 sản xuất Việt Nam, Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học, Trường đại học Dược Hà Nội Tạ Mạnh Hùng (2016), “Nghiên cứu định lượng Atenolol đồng phân đối quang số chế phẩm thuốc dịch sinh học”, Luận án tiến sĩ dược học, Trường đại học Dược Hà Nội 10 Đào Đình Thức (2007), Một số phương pháp phổ ứng dụng hóa học, NXB ĐHQG HN 11 Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2012), Sách dược lý học tập 2, NXB Y học, tr 290 – 291 12 Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn bào chế (2003), Sinh dược học bào chế TÀI LIỆU TIẾNG ANH 13 Chinese Pharmacopoeia Commission, The pharmacopoeia of the People’s Republic of China (2005), Guidances invivo bioavailability and bioequivalence studies for drug preparations, Volume II, Appendix XXB, A.207-A.210 57 14 British Pharmacopoeia (2013) 15 European Pharmacopoeia Fifth edition (2007), p 2626-2627 16 Food and Drug administration – United states (2001), Guidance for industry – Bioanalytical method validation 17 Japanese Pharmacopoeia XIV (2002), p.826 18 Leon Shargel, Andrew Yu «Applied biopharmaceutical and pharmacokinetics», Fifth Edition, Mc Graw Hill, p 169-202 19 Martinedale – The Complete Drug Reference (36th Edition) 20 Robert L Taylor, Stefan K Grebe and Ravinder J Singh, “Quantitative, highly sensitive liquid chromatography – tandem mass spectrometry method for detection of synthetic corticosteroids” 21 Sayed M H AL-HABET and Howard J Rogers+, Br J clin Pharmac (1989), “Methylprednisolone pharmacokinetics after intravenous and oral administration”, p 27, p 285 – 290 22 Shuang-Qing Zang, Helen R Thorsheim, Suman Penugonda, Venkateswaran C Pillai, Quentin R Smith, and Reza Mehvar “Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of methylprednisolone in rat plasma and liver after administration of its liver-targeted dextran prodrug” J Chromatogr B Analyt Techol Biomed Life Sci Author manuscript: available in PMC (2010) Arp 23 Sridhar Siddiraju, Mercy Lazar Lal Prasanth, Tadiboyina Sirisha, Asian Journal of pharmaceutical sciences II (2016), “A novel LC-MS/MS assay for methylprednisolone in human plasma and its pharmacokinetic application”, p 459-468 24 United States Pharmacopoeia 34 – NF 29 25 Ursula Geister, Richard Guserle, Eva Bungers, Dieter Schaarschmidt and Karlheinz Doser (Gemany) (2000), “Bioavailabitity investigation of two different oral formulations of Methylprednisolone” , p 286-292 26 U.S Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug evaluation and Researsch (2003): Guidance for IndustryBioavailability and Bioequivalence Studies for Orally Administered Drugs Products-General Consideration 58 27 Xingjiang Hu, Yunliang Zheng, Guolan Wu, Jian Liu, Junchun Chen, Mingzhu Huang, Huili Zhou, Lihua Wu and Jianzhong Shen-Tu (2014), “An Economical Online Solid-Phase Extraction LC-MS/MS Method for Quantifying Methylprednisolone” 59 ... lượng methypresnisolon huyết tương người với mục tiêu sau: Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng MPN huyết tương LC- MS/ MS Thẩm định phương pháp xây dựng theo hướng dẫn thẩm định phân tích thuốc... Việt Nam chưa có phương pháp phân tích methylprednisolon huyết tương công bố Do vậy, luận văn thực với mục tiêu xây dựng phương pháp LCMS /MS phân tích methylprednisolon huyết tương người, kỹ thuật... để áp dụng nghiên cứu đánh giá TĐSH thuốc methylprednisolon góp phần nâng cao chất lượng thuốc sản xuất lưu hành Việt Nam Do tiến hành Nghiên cứu xây dựng phương pháp LC- MS/ MS định lượng methypresnisolon