MỤC LỤC MỞ ĐẦU 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Nhiễm khuẩn huyết 3 1.1.1. Lịch sử, khái niệm và tình trạng nhiễm khuẩn huyết 3 1.1.2. Dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết 6 1.1.3. Tác động lâm sàng của nhiễm khuẩn huyết và các yêu cầu y tế chưa được đáp ứng 7 1.1.4 Dịch tễ học nhiễm khuẩn huyết 8 1.2. Tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết 9 1.2.1. Các tác nhân không phải do vi sinh vật 9 1.2.2. Nhiễm khuẩn huyết do vi sinh vật 9 1.3. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết 13 1.3.1. Chẩn đoán nhiễm trùng huyết bằng phương pháp cấy máu 14 1.3.2. Lai huỳnh quang tại chỗ 15 1.3.3. Các kỹ thuật khuếch đại DNA 15 1.3.4. Giải trình tự 17 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Vật liệu 19 2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm 19 2.1.2. Thiết bị 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1. Tách chiết DNA từ vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm cấy máu bằng phương pháp đun sôi 20 2.2.2. Tách chiết DNA vi khuẩn trong mẫu máu của bệnh nhân nghi nhiễm khuẩn huyết 20 2.2.3. Xác định nồng độ DNA 21 2.2.4. Cắt DNA bằng enzyme lamda exonuclease 21 2.2.5. PCR 21 2.2.6. Điện di trên gel agarose 22 2.2.7. Giải trình tự 22 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1. Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi đặc hiệu gen đích 24 3.2. Kết quả kiểm tra các cặp mồi bằng thực nghiệm 27 3.2.1. Kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ các chủng vi khuẩn 27 3.2.2. Kết quả PCR kiểm tra từng cặp mồi đơn trên các chủng vi khuẩn đích 28 3.2.3. Kết quả xác định trình tự các sản phẩm PCR từ các chủng vi khuẩn Pa, Ec, Ab, Kp và Sa 29 3.2.4. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi 31 3.2.5 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích trong phản ứng multiplex PCR 33 3.3. Kết quả tối phản ứng multiplex PCR xác định đồng thời 5 vi khuẩn đích 35 3.3.1. Kết quả tối ưu nồng độ mồi của phản ứng multiplex PCR 35 3.3.2. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi của phản ứng multiplex PCR 37 3.3.2. Kết quả lựa chọn Mastermix trong phản ứng multiplex PCR 38 3.3. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các chủng nhiễm khuẩn thuần 39 3.4. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm 40 3.4.1. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy máu 40 với kết quả của phương pháp cấy máu 42 3.4.2. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các mẫu lâm sàng 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 57
I HC QUC GIA H NI TRNG I HC KHOA HC T NHIấN KHOA SINH HC - - Phm Th Thựy NGHIấN CU XY DNG PHNG PHP MULTIPLEX PCR XC NH MT S TC NHN GY NHIM KHUN HUYT Chuyờn ngnh: Sinh hc thc nghim Cỏn b hng dn : TS Ló Th Huyn PGS.TS Nguyn Quang Huy H Ni, 2016 MC LC DANH MC BNG DANH MC HèNH M U Nhim khun huyt l mt tỡnh trng bnh lý rt thng gp lõm sng v cú nguy c gõy t vong cao Ch riờng Hoa k thỡ mi nm cú khong 751.000 ngi mc bnh v 215.000 trng hp t vong chim 9,3% tng s ca t vong ti t nc ny S lng bnh nhõn t vong nhim khun huyt tng ng vi s lng bnh nhõn nhi mỏu c tim cp tớnh v cao hn nhiu so vi AIDS v ung th vỳ Mc dự cú nhiu tin b y hc hin i nh vaccine, khỏng sinh hay iu kin chm súc c bit nhng t l bnh nhõn nhim khun huyt cha du hiu thuyờn gim Bnh nhõn mc nhim khun huyt thng cú tin trin bnh nhanh, c bit l cỏc i tng tr em v ngi gi Vỡ vy, vic phỏt hin sm tỏc nhõn gõy bnh cú ý ngha quan trng iu tr kp thi v gúp phn hn ch bin tớnh, gim t l t vong bnh nhõn mc nhim khun huyt Hin nay, cy mỏu kt hp vi xột nghim sinh húa l phng phỏp ph bin nht phỏt hin mm bnh Phng phỏp ny tin hnh n gin, d thao tỏc vi chi phớ thp nhng cú nhc im l tn nhiu thi gian, khụng loi tr c trng hp õm tớnh gi, cú khong 60% trng hp nhim khun huyt cú kt qu cy mỏu õm tớnh Vic phỏt hin DNA ca vi khun mu mỏu ca bnh nhõn c cho l mt phng phỏp cú nhy v chớnh xỏc cao Tuy nhiờn, cho n hin cha cú phng phỏp phỏt hin DNA ca vi khun no c cho l chun ng dng vo chn oỏn nhim khun huyt Vỡ vy, nghiờn cu xõy dng mt phng phỏp chn oỏn nhanh, cú nhy v c hiu cao ang l nhu cu bc thit hin Multiplex PCR cú th coi l gii phỏp cho nhng trờn Phng phỏp ny s dng nhiu cp mi cựng mt phn ng cho phộp phỏt hin nhiu loi tỏc nhõn gõy nhim khun huyt thi gian ngn vi chớnh xỏc cao Xut phỏt t nhng thc t trờn, chỳng tụi ó tin hnh ti: Nghiờn cu xõy dng phng phỏp multiplex PCR xỏc nh mt s tỏc nhõn gõy nhim khun huyt nhm gúp phn vo vic chn oỏn v iu tr cho cỏc bnh nhõn nghi ng mc nhim khun huyt ti Vit Nam Ni dung chớnh ca ti bao gm: La chn v thit k cỏc mi c hiu cỏc gen ớch ca cỏc chng vi khun gõy nhim khun huyt Ti u iu kin phn ng multiplex PCR Th nghim phng phỏp multiplex PCR trờn mu bnh phm ca bnh nhõn nhim khun huyt CHNG TNG QUAN TI LIU 1.1 Nhim khun huyt 1.1.1 Lch s, khỏi nim v tỡnh trng nhim khun huyt Trong lch s, nhim khun huyt l mt bnh rt khú khn xỏc nh v chn oỏn T 100 trc cụng nguyờn, cỏc hc gi La Mó (116 TCN-27 TCN) ó mụ t v nhim khun huyt nh sau: nhng sinh vt nh, khụng th nhỡn thy bng mt, cú y khụng khớ v qua hi th gõy cỏc bnh nguy him Tip ú cỏc nh s hc, nh trit hc, nhõn chng hc v tiờu biu l mt hc gi thi kỡ phc hng Niccolo Machiavelli (1469-1527) bỏo cỏo ca mỡnh cng ó ln lt mụ t y v nhim khun huyt [1] Ngy nay, chỳng ta ó bit rng st lao phi khụng phi nhim khun huyt Tuy nhiờn mt thi gian di, st lao phi c cho l nhim khun huyt bi giai on y hc cha phỏt trin, vic mụ t nhim khun huyt rt khú c chp nhn cho n triu chng bnh tr nờn rừ rng v khú khn iu tr cựng vi tớnh s nghiờm trng ca bnh thỡ ngi ta bt u quan tõm hn v n lc tỡm hiu a khỏi nim v nhim trựng huyt Theo nh s mụ t ca bỏc s ngi M William Osler (1849-1919) nghiờn cu bnh nhõn cht bi nhng phn ng ca c th ỏp ng li tỏc nhõn xõm nhim hn l nhim trựng ó a khỏi nim u tiờn v nhim khun huyt l mt h thng cỏc ỏp ng ca c th vt ch vi tỏc nhõn xõm nhim [1] Nm 1972, khỏi nim ny c khng nh li mt hi ngh quc t v y t cho rng: ú l s ỏp ng ca c th vi bnh tt [2] Trong khỏi nim chung li cho rng s nhim c l mt hỡnh thc ca nhim khun huyt Tuy nhiờn thc t s hin din ca nhiu vi sinh vt gõy bnh hay c t ca chỳng mỏu hoc mụ dn ti s ph nh ca nhng khỏi nim chung ny ng thi kộo theo vụ s n lc phỏt trin v dch t hc, cỏc cụng c chn oỏn v xột nghim xỏc nh nhim trựng huyt [3] Vo nm 1992, American College of Chest Physicians (ACCP) v Socity Critical Care Medicine (SCCM) cựng cụng b cỏc khỏi nim ca nhim trựng huyt (Bng 1, Hỡnh 1) õy l mt nhng khỏi nim ph bin nht v nhim khun huyt cỏc n v chm súc sc khe y t c bit, cỏc trung tõm dch v chm súc sc khe chuyờn sõu khỏc trờn khp th gii Vic mụ t biu hin ca cỏc phn ng viờm ton thõn v a nh ngha c th cho nhim trựng huyt, nhim trựng huyt nng, sc nhim trựng v hi chng ri lon chc nng a c quan l nhng quan trng lnh vc nhim trựng huyt Bng 1: Tiờu t tờn ca ACCP / SCCM [4] Tiờu t tờn Du hiu, Triu chng ca ACCP / SCCM Nhit c th > 38C hoc Pa 59 Ph lc 6: Kt qu phõn tớch Blast >Ab Kt qu Blast 60 Ph lc 7: Kt qu phõn tớch Blast >Ec Kt qu Blast 61 Ph lc 8: Kt qu phõn tớch Blast >Kp Kt qu blast Ph lc 9: Kt qu phõn tớch Blast 62 >Sa (MecA) Kt qu Blast Ph lc 10: Kt qu phõn tớch Blast 63 ... vào việc chẩn đoán điều trị cho bệnh nhân nghi ngờ mắc nhiễm khuẩn huyết Việt Nam Nội dung đề tài bao gồm: Lựa chọn thi t kế mồi đặc hiệu gen đích chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết Tối ưu... nguyên nhân phổ biến lựa chọn vào đơn vị chăm sóc đặc biệt (ICU) [11] Tỷ lệ tử vong liên quan đến nhiễm trùng huyết cao dù cải thi n kết chăm sóc sức khỏe đồng thời nhiễm trùng huyết nguyên nhân... phẫu thuật, nhiễm trùng huyết hội chứng sốc độc tố S aureus (MRSA) kháng Methicillin S aureus (MSSA) mẫn cảm với Methicillin nguyên nhân gây tỷ lệ lớn nhiễm trùng bệnh viện dẫn tới điều trị khó