Nghiên cứu xây dựng phương pháp multiplex pcr xác định một số tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  - - Phạm Thị Thùy NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  - - Phạm Thị Thùy NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lã Thị Huyền PGS.TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội - 2016 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Luận văn cơng trình nghiên cứu thực cá nhân, thực hướng dẫn khoa học PGS TS Nguyễn Quang Huy TS Lã Thị Huyền Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Phạm Thị Thùy Lời cảm ơn Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới: PGS TS Nguyễn Quang Huy – Trưởng khoa Sinh học - Trường đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội TS Lã Thị Huyền – Phụ trách phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam tận tình hướng dẫn tơi q trình nghiên cứu để hồn thành luận văn thạc sĩ Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Sinh học – Trường đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội nói chung thầy cô giáo chuyên ngành Sinh học thực nghiệm học nói riêng bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Hóa sinh, khoa Vi sinh khoa phòng liên quan Bệnh viện Thanh Nhàn cung cấp mẫu thí nghiệm cho tơi Tôi xin gửi lời cảm ơn tới cô chú, anh chị bạn cơng tác phịng phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật tồn thể cô chú, anh chị bạn đồng nghiệp Khoa Hóa sinh – Bệnh viện 198 nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn tất người thân, bạn bè động viên giúp đỡ thời gian qua Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Phạm Thị Thùy MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhiễm khuẩn huyết 1.1.1 Khái niệm, lịch sử tình hình nhiễm khuẩn huyết giới Việt Nam 1.1.2 Dấu hiệu nhiễm khuẩn huyết 1.2 Tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp 1.2.1 Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus 1.2.2 Acinetobacter baumannii 1.2.3 Klebsiella pneumoniae 11 1.2.4 Pseudomonas aeruginosa 12 1.2.5 Escherichia coli 14 1.3 Các phương pháp chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết 15 1.3.1 Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết phương pháp cấy máu 15 1.3.2 Lai huỳnh quang chỗ 15 1.3.3 Các kỹ thuật khuếch đại DNA 16 1.3.4 Giải trình tự 18 1.4 Multiplex PCR ứng dụng 19 1.4.1 Giới thiệu chung multiplex PCR 19 1.4.2 Các loại phản ứng multiplex PCR 19 1.4.3 Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR 20 1.4.4 Ưu điểm phương pháp multiplex PCR 21 1.4.5 Tối ưu hóa thành phần cho phản ứng multiplex PCR .22 1.4.6 Ứng dụng phản ứng multiplex PCR 24 1.4.7 Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR việc xác định tác nhân nhiễm khuẩn huyết 25 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu 27 2.1.1 Hóa chất sinh phẩm 27 2.1.2 Thiết bị 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Thiết kế primer 29 2.2.2 Tách chiết DNA 29 2.2.3 Phương pháp làm giàu DNA vi khuẩn 30 2.2.4 Xác định nồng độ DNA 31 2.2.5 Phương pháp điện di DNA gel agarose 31 2.2.6 Phương pháp PCR 32 2.2.7 Phương pháp giải trình tự gen 33 2.2.8 Đạo đức nghiên cứu 34 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết lựa chọn thiết kế mồi đặc hiệu gen đích 35 3.2 Kết kiểm tra cặp mồi thực nghiệm 38 3.2.1 Kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ chủng vi khuẩn 38 3.2.2 Kết PCR kiểm tra cặp mồi đơn chủng vi khuẩn đích 39 3.2.3 Kết xác định trình tự sản phẩm PCR từ chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa 40 3.2.4 Kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi 43 3.2.5 Kết kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi gen đích phản ứng multiplex PCR 45 3.3 Kết tối ưu phản ứng multiplex PCR xác định đồng thời vi khuẩn đích 47 3.3.1 Kết tối ưu nồng độ mồi phản ứng multiplex PCR 47 3.3.2 Kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng multiplex PCR 48 3.3.3 Kết lựa chọn Master Mix phản ứng multiplex PCR .50 3.4 Kết thử nghiệm phương pháp multiplex PCR chủng nhiễm khuẩn 51 3.5 Kết thử nghiệm phương pháp multiplex PCR mẫu bệnh phẩm .53 3.5.1 Kết thử nghiệm phương pháp multiplex PCR mẫu bệnh phẩm cấy máu 53 3.5.2 Kết thử nghiệm phương pháp multiplex PCR mẫu lâm sàng 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tiêu chí đặt tên ACCP / SCCM [16] Bảng 2.1 Trình tự Nucleotide cặp mồi 27 Bảng 3.1 Trình tự mồi kích thước sản phẩm PCR theo tính tốn lý thuyết 37 Bảng 3.2 Kết thử nghiệm phản ứng multiplex PCR 52 Bảng 3.3 So sánh kết multiplex PCR mẫu bệnh phẩm cấy máu .55 với kết phương pháp cấy máu 55 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mối quan hệ phản ứng viêm toàn thân nhiễm trùng, vùng giao nhiễm khuẩn huyết [16, 56] Hình 1.2 Hình ảnh cấu trúc gen vi khuẩn Staphylococcus aureus .8 Hình 1.3 Hình ảnh chế xâm nhập vi khuẩn Acinetobacter baumannii 10 Hình 1.4 Hình ảnh tác động vi khuẩn Klebsiella pneumonia 11 Hình 1.5 Hình ảnh tác động vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 13 Hình 1.6 Hình ảnh phân loại vi khuẩn Escherichia coli 14 Hình 1.7 Mơ hình mơ tả phản ứng multiplex PCR 20 Hình 3.1 Điện di kiểm tra DNA tổng số chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa tách chiết từ chủng chuẩn 38 Hình 3.2 Kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi gen đích chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tương ứng 40 Hình 3.3 Kiểm tra khả nhân đặc hiệu cặp mồi femA, gltA, oprL, mdh, phoA với chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae Escherichia coli 43 Hình 3.4 Kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi gen đích phản ứng multiplex PCR 45 Hình 3.5 Tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng multiplex PCR 47 Hình 3.6 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR 49 Hình 3.7 Lựa chọn thành phần Mastermix phản ứng multiplex PCR 50 Hình 3.8 Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR mẫu bệnh phẩm cấy máu 53 Hình 3.9 Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR mẫu lâm sàng .59 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACCP AW1 AW2 BN DNA dNTP EDTA EtBt EtOH ICU MLST MRSA Mutiplex PCR NKH NVYT PAF RNA SCCM SDS SNP TAE Reviews Immunology, 13(12), pp 862–874 40 Jason P., Younsuck K., Bin D et al (2011), "Management of severe sepsis in patients admitted to Asian intensive care units: prospective cohort study", BMJ, 342, pp 32-45 41 Jbara I., Baysallar M., Kiliỗ A., Yetier S., Unay B., Aỗikel C., Yapar M., Doğanci L (2007), “Comparison of culture and polymerase chain reaction methods for the detection of Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae and Moraxella catarrhalis in cerebrospinal fluids and middle ear effusions”, Mikrobiyol Bul., 41(4), pp 495-502 42 Josefson P., Stralin K., Ohlin A., Ennefors T., Dragsten B (2011), “Evaluation of a commercial multiplex PCR test (Septi-Fast) in the etiological diagnosis of community-onset bloodstream infections”, European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: official publication of the European Society of Clinical Microbiology, 30(9), pp 1127–1134 43 Kirn T J, Weinstein M P (2013), “Update on blood cultures: how to obtain, process, report, and interpret”, Clinical Microbiology and Infection: the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 19(6), pp 513–520 44 Kong R.Y.C., So C.L., Law W.F., Wu R.S.S (1999), “A sensitive and versatile multiplex PCR system for the rapid detection of enterotoxigenic (ETEC), enterohaemorrhagic (EHEC) and enteropathogenic (EPEC) strains of Escherichia coli”, Marine Pollution Bulletin, 38(12), pp 1207-1215 45 Kumar A., Haery C., Paladugu B., Symeoneides S., Taiberg L (2006), “The duration of hypotension before the initiation of antibiotic treatment is a critical determinant of survival in a murine model of Escherichia coli septic shock: asso-ciation with serum lactate and inflammatory cytokine levels”, The Journal of Infectious Diseases, 193(2), pp 251–258 46 Kurutepe S., Ecemiş T., Ozgen A., Biỗmen C., Celik P., Aktou ệzkan S., Sỹrỹcỹolu S (2012), “Investigation of bacterial etiology with conventional 67 and multiplex PCR methods in adult patients with community-acquired pneumonia” Mikrobiyol Bul., 46(4), pp 523-531 47 Labelle A J., Micek S T., Roubinian N., Kollef M H (2008), “Treatment related risk factors for hospital mortality in Candida bloodstream infections”, Critical Care Medicine, 36(11), pp 2967–2972 48 Lambiase A., Piazza O., Rossano F et al (2012), “Pesistence of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii strains in an Italian intensive care unit during a forty-six month study periode”, New Microbiological, 35, pp 199-206 49 Leea N Y., Leea C C., Huang W H., Tsuic K C., Hsuehb P R., Koa W C (2012), “Carbapenem Therapy for Bacteremia Due to Extended-Spectrum-βLactamase-Producing Escherichia coli or Klebsiella pneumoniae: Implications of Ertapenem Susceptibility”, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 56(6), pp 2888-2893 50 LevyM.M.,FinkM.P.,MarshallJ.C.(2001), “SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS international sepsis definitions conference”, Critical Care Medicine, 31(4), pp 1250–1256 51 Levy M.M., Fink M.P., Marshall J.C., Abraham E., Angus D., Cook D., Cohen J., Opal S M., Vincent J L., Ramsay G (2003), “SCCM/ ESICM/ACCP/ATS/SIS international sepsis definitions conference”, Intensive Care Medicine, 29, pp 530–538 52 Liesenfeld O., Lehman L., Hunfeld K H., Kost G (2014), “Molecular diagnosis of sepsis: new aspects and recent developments”, European Journal of Microbiology and Immunology, (1), pp 1–25 53 Lomholt J A., Poulsen K., Kilian M (2001), “Epidemic populationstructure of Pseudomonas aeruginosa: evidence for a clone that is pathogenicto the eye and that has a distinct combination of virulence factors”, Infection Immunology, 69(10), pp 6284–6295 54 Maiden M C., Bygraves J A., Feil E., Morelli G., Russell J E., Urwin R., 68 Zhang Q., Zhou J., Zurth K., Caugant D A., Feavers I M., Achtman M., Spratt B G (1998), “Multilocus sequence typing: a portable approach to identification of clones within populations of pathogenic microorganisms”, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 95(6), pp 3140– 3145 55 Mancini N., Carletti S., Ghidoli N., Cichero P., Burioni R (2010), “The era of molecular and other nonculture based methods in diagnosis of sepsis”, Clinical Microbiology Reviews, 23(1), pp 235–251 56 Martin G S., Mannino D M., Eaton S, Moss M (2003), “The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000”, The New England Journal of Medicine, 348, pp 1546–1554 57 Martin, G S (2012), “Sepsis, severe sepsis and septic shock: changes in incidence, pathogens and outcomes”, Expert Review of Anti-infective Therapy, 10(6), pp 701–706 58 Mayr F B., Yende S., Linde-Zwirble W T., Peck-Palmer O M., Barnato A E (2010), “Infection rate and acute organ dysfunction risk as explanations for racial differences in severe sepsis”, JAMA: the journal of the American Medical Association, 303(24), pp 2495–2503 59 Mehrotra M., Wang G., Johnson W.M (2000), “Multiplex PCR for detection of genes for Staphylococcus aureus enterotoxins, exfoliative toxins, toxic shock syndrome toxin 1, and methicillin resistance”, Journal of Clinical Microbiolog, 38(3), pp 1032-1035 60 Nordmann P., Gniadkowski M., Giske C G., Poirel L., Wood-ford N (2012), “Identification and screening of carbapenemase producing Enterobacteriaceae”, Clinical Microbiology and Infection, 18(5), pp 432– 438 61 Oliveira K., Haase G., Kurtzman C., Hyldig-Nielsen J J., Stender H (2001), “Differentiation of Candida albicans and Candida dubliniensis by fluorescent in situ hybridization with peptide nucleic acid probes”, Journal of Clinical 69 Microbiology, 39(11), pp 4138–4141 62 Opal S M., Garber G E., LaRosa S P., Maki D G., Freebairn R C (2003), “Systemic host responses in severe sepsis analyzed by causative microorganism and treatment effects of drotrecogin alfa (activated)”, Clinical Infectious Diseases, 37(1), pp 50–58 63 Osek J (2001), “Multiplex polymerase Chain reaction assay for identification of Escherichia coli strains”, Journal of Veterinary Diagnostic investigation, 13(4), pp 308-311 64 Paolucci M., Landini M P., Sambri V (2010), “Conventional and molecular techniques for the early diagnosis of bacteraemia”, International Journal of Antimicrobial Agents, 36(2), pp 6–16 65 Perez-roth E., Claverie F., Villar J., Mendez S (2001), “Multiplex PCR for simultaneous identification of Staphylococcus aureus and detection of methicilin and mupirocin resistance”, Journal of Clinical Microbiology, 39(11), pp 4037-4041 66 Pirnay J P., De Vos D., Cochez C., Bilocq F., Vanderkelen A., Zizi M., Ghysels B., Cornelis P (2002), “Pseudomonas aeruginosa displays an epidemic population structure”, Environment Microbiology, 4(12), pp 898– 911 67 Prathiba K., Chow C., Gamini K., Chit L P (2004), “Rapid detection of Klebsiella pneumoniae from blood culture bottles by real-time PCR”, Clinical Microbiology, 42(3), pp 1337–1340 68 Qian Q., Tang Y W., Kolbert C P., Torgerson C A., Hughes J G (2001), “Direct identification of bacteria from positive blood cultures by amplification and sequencing of the 16S rRNA gene: evaluation of BACTEC 9240 instrument true-positive and false-positive results”, Journal of Clinical Microbiology, 39(10), pp 3578–3582 69 Ramsamy Y., Hardcastle T C., Muckart D J (2016), “Surviving Sepsis in the Intensive Care Unit: The Challenge of Antimicrobial Resistance and the 70 Trauma Patient”, World journar of surgery, DOI: 10.1007/s00268-016-35310 70 Rangel Frausto M S., Pittet D., Costigan M., Hwang T., Davis C S (1995), “The natural history of the systemic inflammatory response syndrome (SIRS) A prospective study”, JAMA: the journal of the American Medical Association, 273(2), pp 117–123 71 Russmann H., Kempf V A., Koletzko S., Heesemann J., Auten-rieth I B (2001), “Comparison of fluorescent in situ hybridization and conventional culturing for detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy specimens” Journal of Clinical Microbiology, 39(1), pp 304–308 72 Sautter R L., Bills A R., Lang D L., Ruschell G., Heiter B J (2006), “Effects of delayed-entry conditions on the recovery and detection of microorganisms from BacT/ALERT and BAC-TEC blood culture bottles”, Journal of Clinical Microbiology, 44(4), pp 1245–1249 73 Savitha, N., Prasanthi, N., Dasarathy, R., Gayathri A (2006), “Genotyping ofmethicillin- resistant Staphylococcus aureus isolates from Indian hospitals” , Current Science, 91(10), pp 1364-1369 74 Shepard J R., Addison R M., Alexander B D., Della Latta P., Gherna M (2008), “Multicenter evaluation of the Candida albicans/Candida glabrata peptide nucleic acid fluorescent insitu hybridization method for simultaneous dualcolor identification of C Albicans and C glabrata directly from blood culture bottles”, Journal of Clinical Microbiology, 48(1), pp 50–55 75 Tang Y W., Kilic A., Yang Q., McAllister S K., Li H (2007), “StaphPlex system for rapid and simultaneous identification of antibiotic resistance determinants and Panton-Valentine leukocidin detection of staphylococci from positive blood cultures”, Journal of Clinical Microbiology, 45(6), pp 1867–1873 76 Thong, K L., Lai, M Y., Teh C S J., Chua K H (2011), “Simultaneous detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Acinetobacter 71 baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa by multiplex PCR”, Tropical Biomedicine, 28(1), pp 21–31 77 Tsalik E L., Jones D., Nicholson B., Waring L., Liesenfeld O (2010), “Multiplex PCR to diagnose bloodstream infections in patients admitted from the emergency department with sepsis”, Journal of Clinical Microbiology, 48(1), pp 26–33 78 Turenne C Y., Witwicki E., Hoban D J., Karlowsky J A., Kabani A M (2000), “Rapid identification of bacteria from positive blood cultures by fluorescence-based PCR-single-strand conformation polymorphism analysis of the 16S rRNA gene”, Journal of Clinical Microbiology, 38(2), pp 513– 520 79 Vincent J L (2000), “Procalcitonin: the marker of Sepsis”, Critical Care Medicine, 28(4), pp 1226–1228 72 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình ảnh Chromas trình tự gen mdh Klebsiella pneumoniae Phụ lục 2: Hình ảnh Chromas trình tự gen femA Staphylococcus aureus Phụ lục 3: Hình ảnh Chromas trình tự gen oprL Pseudomonas aeruginosa i Phụ lục 4: Hình ảnh Chromas trình tự gen phoA Escherichia coli Phụ lục 5: Hình ảnh Chromas trình tự gen gltA Acinetobacter baumannii ii Phụ lục 6: Kết phân tích Blast gen oprL Pseudomonas aeruginosa iii Phụ lục 7: Kết phân tích Blast gen gltA Acinetobacter baumannii iv Phụ lục 8: Kết phân tích Blast gen phoA Escherichia coli v Phụ lục 9: Kết phân tích Blast gen mdh Klebsiella pneumoniae vi Phụ lục 10: Kết phân tích Blast gen femA Staphylococcus aureus vii STT Họ tên 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 ĐỗBáL Nguyễn Đức L Cao Thị V Đào Văn H Hà Phương A Nguyễn Thị Q Nguyễn Văn T Nguyễn Đức M Nguyễn Văn Q Lê Văn P Bùi Thanh T Nguyễn Xuân T Tạ Thị L Nguyễn Đình K Phạm Văn T Phạm Văn K Vũ Thị H Phạm văn T Nguyễn Thế Ng Tạ Thị L Lương Thị G Đỗ Văn H Cao Dụ T 24 25 26 27 Lưu Thị B Nguyễn Đức M Đỗ Văn H Nguyễn Viết C 28 29 30 Phạm Trí D Lê Hữu P Nguyễn Viết C 31 32 33 Lê Văn P Trần Trung H Nguyễn Xuân L viii 34 35 36 37 38 Nguyễn Thị B Nguyễn Thị Q Trần Thị S Đào Văn H Nguyễn Viết C 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 Phạm Văn T Phạm Thanh K Doãn Thị K Lê Văn L Trần Thế P Đào Văn H Lương Thị G Lê Văn P Nguyễn Văn L Nguyễn.T.M.T Nguyễn văn V Lê Thị Ng Nguyễn Viết V Trần Văn Ng Vũ Xuân Nguyễn Văn V Dương văn T Bùi Thanh T Lê Tiến T Nguyễn Xuân T Nguyễn Thị D Hoàng Sinh L Nguyễn Văn L Lê Tiến T Nguyễn Viết T Vũ Văn Q Lê Tiến T Vũ Thị V Bùi Thanh T Lê Thị C Phụ lục 11: Danh sách 68 bệnh nhân ix ... hành đề tài: ? ?Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp multiplex PCR xác định số tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết” nhằm góp phần vào việc chẩn đoán điều trị cho bệnh nhân nghi ngờ mắc nhiễm khuẩn huyết Việt... NHIÊN  - - Phạm Thị Thùy NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ... so với kết xác định phương pháp nuôi cấy Ở Việt Nam, có số nghiên cứu nhà khoa học sử dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết 25 nhiễm khuẩn bệnh viện: Nhóm nghiên cứu PGS.TS