NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ESCHERICHIA COLI O157 TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR Võ Văn Giàu, Lại Trịnh Anh Khoa, Phạm Vũ Việt Dũng, Nguyễn Tiến Dũng Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng TÓM TẮT: Mục tiêu nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình PCR sử dụng hai cặp mồi chuyên biệt để phát E.coli O157 thực phẩm Kết nghiên cứu cho thấy cặp mồi stx1F/stx1R đặc hiệu cho gen stx1 cặp mồi stx2F/stx2R đặc hiệu cho gen stx2 vi khuẩn E coli O157 Kỹ thuật multiplex PCR với hai cặp mồi để khuếch đại gen mục tiêu stx1, stx2 xây dựng thành công Kết nghiên cứu cho thấy phương pháp xây dựng có độ nhạy đạt 98%, độ xác đạt 98%, độ đặc hiệu 100%, tỷ lệ dương tính giả 0% tỷ lệ âm tính giả 4% Hiệu phân tích E coli O157 phương pháp xây dựng tương đương với phương pháp ni cấy theo tiêu chuẩn ISO 16654:2001 có thời gian cho kết phân tích ngắn hơn, sau ngày SUMMARY: The objective of this study was developing the multiplex PCR method using two pairs of specific primers to detect E coli O157 in food The study results show that stx1F/stx1R primers are specific for stx1 and primers stx2F/stx2R are specific for stx2 genes in E coli O157 The multiplex PCR method with two pairs of primers for amplifying the stx1, stx2 target genes to detect E coli O157 in food has been set up successfully The results of evaluating of method show that the multiplex PCR method have sensitivity is 98%, accuracy is 98%, specificity is 100%, the false positive rate is 0% and false negative rate is 4% The above results indicate the multiplex PCR has been set up and the standard method according to ISO 16654:2001 are equivalent for detection of E coli O157 in food, but the time for analysis of multiplex PCR is shorter, only days I ĐẶT VẤN ĐỀ: E coli O157 dòng E coli gây ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng người Vi khuẩn gây nên vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng nhiều quốc gia giới với hội chứng tiêu chảy, viêm ruột xuất huyết, hội chứng tán huyết tăng urê (HUS) Yếu tố gây bệnh vi khuẩn E coli O157 độc tố Shiga toxin (Stx) hay Shiga-like toxin (Slt) Họ độc tố Stx gồm hai nhóm khơng phản ứng chéo với Stx1 Stx2 Một dòng E coli O157 sản sinh hai độc tố Stx1, Stx2 hai Stx1 Stx2 Độc tố Stx tác động lên loại tế bào nội mô thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào Hela hay tế bào có receptor Gb3, Gb4 Hậu làm tổn hại tế bào thành mạch máu, gây nên triệu chứng phù thủng Những tổn thương tế bào nội mô thận gây nên hội chứng tán huyết tăng urê (HUS) người Hiện nay, phòng kiểm nghiệm Việt Nam phân tích E coli O157 thực phẩm chủ yếu sử dụng phương pháp ni cấy Về mặt hình thái học, khuẩn lạc E coli O157 khó phân biệt với E coli non-O157 môi trường phân lập, điều làm giảm tính đặc hiệu phương pháp gây nên tỉ lệ âm tính giả cao Ngồi phương pháp ni cấy tồn hạn chế thời gian phân tích từ – ngày, khơng phù hợp với u cầu phân tích nhanh mẫu thực phẩm nghi ngờ nhiễm E coli O157 phục vụ cho mục đích giám sát khẩn cấp Mục tiêu nghiên cứu xây dựng phương pháp phát nhanh vi khuẩn E coli O157 thực phẩm kỹ thuật multiplex PCR với độ xác, độ nhạy, độ đặc hiệu tương đương cao phương pháp nuôi cấy II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi sinh vật: Các chủng dùng nghiên cứu liệt kê Bảng Bảng Chủng vi khuẩn sử dụngtrong nghiên cứu TT Tên chủng Số lượng Nguồn gốc E coli O157:H7 ĐHĐHNL TP.HCM E coli O157:H7 ĐHKHTN TP.HCM E coli O157:H7 Viện VSDTTW E coli ATCC E coli ATCC Salmonella enterica ATCC Shigella sonnei ATCC Vibrio cholerae ATCC E coli 10 Phân lập Ký hiệu NL TN TW ATCC 11775 ATCC 25922 ATCC 14028 ATCC 9290 ATCC 17802 E1 –> E10 Mồi phản ứng khuếch đại PCR cho E coli O157: Hai cặp mồi stx1F/stx1R stx2F/stx2R nhóm nghiên cứu thiết lập dựa vào trình tự bảo tồn gen tương ứng công bố Gen Bank Trình tự mồi thiết kế mềm Oligo Explorer 1.1.0 tổng hợp cơng ty Sigma Trình tự mồi Bảng Bảng 2: Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu Tên gen Trình tự oligonucleotide Kích thước khuếch đại (bp) stx1F: 5'- gag cga aat aat tta tat gtg -3’ stx1 520 stx1R: 5'- ttg atg atg gca att cag tat -3’ stx2F: 5'- cca tga caa cgg aca gca gtt -3’ stx2 780 stx2R: 5'- cct gtc aac tga gca ctt tgc -3’ Mẫu sử dụng nghiên cứu: Bao gồm thịt heo, thịt bò, thịt gà, mẫu thủy sản rau thu nhận chợ, siêu thị thành phố Hồ Chí Minh 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tăng sinh: Cân 25g mẫu cho vào túi nilon vô trùng, thêm vào túi 225ml môi trường Modified Tryptone Soya Broth with Novobiocine (mTSB), đồng 30 giây, ủ 41,5oC 10–24 Chuyển 1ml dịch canh khuẩn vào ống eppendoft 1,5ml để ly trích DNA dùng cho phân tích kỹ thuật multiplex PCR 2.2.2 Xử lý dịch vi khuẩn ly trích DNA: Dịch vi khuẩn eppendorf ly tâm 12000 vòng/phút phút; loại bỏ phần nước; rửa lại 0,5ml đệm TE; ly tâm với tốc độ để loại bỏ phần nước, phần kết tủa huyền phù lại với 0,5ml TE, đun cách thủy 10 phút 100oC, ly tâm 3000 vòng/phút, dịch sử dụng làm khuôn DNA phản ứng PCR 2.2.3 Thành phần phản ứng PCR: Tất thí nghiệm khuếch đại phản ứng PCR thực với dung tích phản ứng 50l ống eppendorf 0,2ml, thành phần sau: 25l dung dịch Fast start PCR Master Mix, 2,5l mồi với nồng độ 0,5M, 5l khuôn DNA, thêm nước cất để đủ 50,0l 2.2.4 Chương trình phản ứng PCR: Được tiến hành theo bước sau: (i) 94oC phút; (ii) 30 chu kỳ, chu kỳ gồm: biến tính 94oC phút, bắt cặp 54oC phút, kéo dài 72oC phút; (iii) giữ nhiệt độ 72oC 10 phút đoạn DNA chưa tổng hợp hoàn chỉnh tiếp tục tổng hợp, sau giữ ổn định 4oC 2.2.5 Phân tích sản phẩm: 5µl sản phẩm khuếch đại trộn với 2,5l đệm tải mẫu nạp vào giếng gel agarose 2% có chất nhuộm SYBR® Safe DNA 10,000X Điện di 130V, 250mA 25 phút Quang sát ghi nhận kết thiết bị Universal Hood II (Biorad) Video graphic Printer (Sony) Xác định kích thước sản phẩm thang DNA chuẩn hãng Invitrogen 2.2.6 Xác định E coli O157 phương pháp nuôi cấy: theo ISO 16654:2001 2.2.7 Xác định giới hạn phát LOD50: thực theo phương pháp Spearman-Karber 50% Endpoint Chuẩn bị dãy pha loãng nhị phân dịch vi khuẩn E coli O157 từ mật độ ban đầu khoảng 25 CFU/ml Hút 1ml dịch pha loãng để gây nhiễm vào 25g mẫu Thực 10 lần lặp lại cho mật độ gây nhiễm Phân tích mẫu gây nhiễm bằng phương pháp định Giới hạn phát LOD50 phương pháp xác định theo công thức sau: log(LOD50) = L - d(Pi – 0,5) = m; hay LOD50=10m Trong đó: L logarit số 10 số vi khuẩn gây nhiễm thấp mà 100% số lần lặp lại cho kết dương tính; d: Hệ số pha lỗng dịch vi khuẩn (d=2); Pi : tỉ lệ mẫu cho kết phát dương tính khoảng 50% Pi 100% tương ứng với với nồng độ pha loãng thứ i, n số lần lặp lại nồng độ pha loãng thứ i (n=10) 2.2.5 Xác thông số kỹ thuật phương pháp: Các thông số phương pháp multiplex PCR cần xác định bao gồm: độ chọn lọc, độ xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, tỉ lệ âm tính giả, tỉ lệ dương tính giả Các thơng số xác định dựa phương pháp nuôi cấy theo ISO 16654:2001 thực theo hướng dẫn xác nhận hiệu lực phương pháp định tính vi sinh vật ISO 16140:2003 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tính chuyên biệt cặp mồi phát gen stx1 stx2: Để đánh giá tính chuyên biệt cặp mồi stx1F/stx1R stx2F/stx2R việc phát gen mã hóa cho độc tố Stx1 Stx2, dòng vi khuẩn Bảng sử dụng, chủng E coli O157:H7, 12 chủng E coli non-O157 vi sinh vật gây bệnh khác Kết khảo sát cho thấy, cặp mồi stx1F/stx1R, tất dòng E coli O157:H7 cho sản phẩm khuếch đại với kích thước 520bp, dòng E coli non-O157 vi sinh vật gây bệnh khác Salmonella, Shigella sonnei Vibrio cholerae khơng cho tín hiệu khuếch đại (Hình 1) 600bp 500bp 520bp Hình Kết khảo sát tính chuyên biệt cặp mồi stx1F/stx1R MR: Thang chuẩn; 1-2: E coli ATCC 25922 11775; 3-8 10-13: chủng E coli E1 đến E10; 9: E coli O157:H7(TN); 14: Salmonella; 15: Shigella; 16: V cholerae; 17: Nước cất Đối với cặp mồi stx2F/stx2R, số chủng khảo sát có có chủng E coli O157:H7 (NL) cho kết dương tính với kích thước sản phẩm khuếch đại 78bbp Chủng E coli O157:H7 (TW); chủng E coli O157:H7 (TN); 10 chủng E coli non-O157 chủng vi sinh vật khác không cho sản phẩm khuếch đại với cặp mồi (Hình 2) 800bp 700bp 780bp Hình Kết khảo sát tính chuyên biệt cặp mồi stx2F/stx2R MR: Thang chuẩn; 1-2: E coli ATCC 25922 11775; 3-8 10-13: Các chủng E coli E E10; 9: E coli O157:H7 (NL); 14: Salmonella; 15: Shigella; 16: V cholerae; 17: Nước cất Kết chứng tỏ cặp mồi stx1F/stx1R cho sản phẩm khuếch chuyên biệt với E coli O157, khơng cho tín hiệu khuếch đại với E coli non-O157 vi sinh vật khác Cặp mồi stx2F/stx2R cho tín hiệu khuếch đại với dòng E coli O157 có mang gen mã hóa cho Stx2 Họ độc tố Stx E coli O157 gồm hai nhóm Stx1 Stx2, dòng sản sinh độc tố Stx1, Stx2 Stx1 Stx2, chí nhiều dạng Stx2 Stx2c, Stx2hb, Stx2e Stx2g Có đến 60% chủng E coli thuộc nhóm huyết mang stx1 Các chủng mang stx2 có độc lực mạnh so với chủng mang gen stx1 mang đồng thời hai gen 3.2 Xây dựng phương pháp phát E coli O157 dựa phản ứng mutiplex PCR với hai cặp mồi khuếch đại đoạn gen stx1 stx2 Độc tố Shiga vi khuẩn E coli O157có thể tạo từ chủng mang stx1 stx2 hay hai gen Do để phát tất E coli mang độc tố shiga, phối hợp hai cặp mồi phát đồng thời stx1 stx2 phản ứng khuếch đại PCR Kết cho thấy phản ứng multiplex PCR thiết lập khuếch đại đồng thời hai đoạn gen có kích thước 520bp 780bp (Hình 3) Kết nghiên cứu cho thấy, với phản ứng multiplex PCR thiết lập, có E coli O157 cho hai đồng thời hai sản phẩm khuếch đại có kích thước 780bp 520bp Hình Kết khảo sát chuyên biệt cặp mồi khuếch đại gen stx1, stx2 chủng vi sinh vật khác phản ứng multiplex-PCR MR: Thang chuẩn; 1-2: E coli ATCC 25922 11775; 3-8 10-13: chủng E coli E1 - E10; 9: E coli O157:H7 (NL); 14: Salmonella; 15: Shigella; 16: V cholerae; 17: Nước cất Trên sở khả khuếch đại chuyên biệt đoạn gen stx1, stx2 phản ứng multiplex PCR thiết lập, quy trình phát phát E coli O157 thực thực phẩm thiết lập gồm bước sau: 25g mẫu thực phẩm tăng sinh phân tích 2.2.1 đến 2.2.5 Kết phân tích xác định dương tính với E coli O157 có hai hai sản phẩm khuếch đại có kích thước tương ứng 520bp 780bp Kết phân tích mẫu xác định âm tính với E coli O157 không xuất sản phẩm khuếch đại, sản phẩm khuếch đại có kích thước khác với sản phẩm Để đảm bảo độ tin cậy quy trình phát hiện, lần phân tích phải có mẫu đối chứng âm tính dương tính với E coli O157 kèm Mẫu đối chứng dương tính mẫu có chứa E coli O157 mang gen stx1 stx2 3.3 Xác định thơng số kỹ thuật quy trình multiplex PCR thiết lập: Các thông số đánh giá là: Giới hạn phát LOD50, độ chọn lọc, độ đặc hiệu, tỉ lệ dương tính giả, tỉ lệ âm tính giả Các thông số xác định dựa phương pháp tham chiếu ISO 16654:2001 3.3.1 Xác định giới hạn phát LOD50 phương pháp: Các thí nghiệm để xác định LOD50 thực với 80 mẫu, bao gồm: 40 mẫu cá tra fillet, 40 mẫu thịt heo tươi, mẫu xác định âm tính với E coli O157 Chủng E coli O157:H7 (NL) sử dụng để gây nhiễm vào mẫu chuẩn bị với mật độ khác Kết phát E coli O157 mẫu gây nhiễm trình bày Bảng Bảng Kết xác định LOD50 phương pháp Mật độ vi khuẩn 25g (CFU) 10 Hệ số pha loãng Số lần lặp lại Số lần cho kết dương tính Tỉ lệ dương tính 10 10 10 10 10 10 0.9 0.7 0.5 0.3 Áp dụng cơng thức tính tốn LOD50 theo mục 2.2.6, kết xác định sau: LOD50 trung bình 2,3 CFU/25g, với độ tin cậy 95%, giá trị LOD50 phương pháp giao động khoảng - CFU/25g mẫu 3.3.2 Xác định thông số kỹ thuật phương pháp: Các thông số xác định cho nhóm mẫu là: hải sản, thịt heo, thịt gà rau xà lách Mỗi nhóm mẫu thực 30 mẫu gây nhiễm E coli O157và 30 mẫu không gây nhiễm vi sinh vật Mật độ gây nhiễm khoảng – 10 CFU/25g Kết đánh giá trung bình cho nhóm mẫu trình bày Bảng Bảng Các thông số kỹ thuật phương pháp multiplex-PCR phân tích E coli O157 so với phương pháp nuôi cấy theo ISO 16654:2001 Thông số Độ nhạy Độ đặc Độ Dương tính Âm tính Kết luận đánh giá (%) hiệu (%) xác (%) giả (%) giả (%) Phương 98 100 98 Đạt pháp PCR Yêu cầu ≥ 98,0 ≥ 90,4 ≥ 94,0 ≤ 9,6 ≤ 2,0 Tham chiếu(*) (*Tham chiếu theo MMC-Microbiology Methods Committee, Canada) Các thông số kỹ thuật phương pháp multiplex PCR Bảng cho thấy chúng hoàn toàn đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích tiêu chuẩn Quá trình nghiên cứu cho thấy hệ vi sinh vật thành phần hóa học loại thực phẩm đánh giá không ảnh hưởng đến việc phát E coli O157 phương pháp multiplex PCR Thời gian cho kết phân tích phương pháp vòng 24 Điều giúp phòng kiểm nghiệm có định hướng sớm chẩn đốn trường hợp ngộ độc thực phẩm IV KẾT LUẬN Đã xây dựng thành cơng quy trình phát E coli O157 thực phẩm phản ứng multiplex PCR khuếch đại 02 đoạn gen mục tiêu stx1 stx2 Qui trình thiết lập có thơng số sau: Thời gian tăng sinh môi trường mTSB 10-18 giờ, dịch tăng sinh xử lý khuếch đại với cặp mồi stx1F/stx1R stx2F/stx2R, nồng độ mồi 5µM Nồng độ MgCl2 hỗn hợp phản ứng 2,5µM Nhiệt độ bước bắt cặp mồi khn chương trình khuếch đại 54oC Kết đánh giá hiệu lực quy trình multiplex-PCR so với phương pháp nuôi cấy theo ISO 16654:2001 cho thấy: độ đặc hiệu tương đối (SP) đạt 100%; độ xác tương đối (AC) đạt 98%; độ nhạy tương đối (SE) đạt 98%; tỷ lệ âm tính giả 4% tỷ lệ dương tính giả 0%, LOD50 2CFU/25g Kết cho thấy phương pháp multiplex PCR cho kết phát E coli O157 thực phẩm tương đương với phương pháp ISO 16654:2001 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Thanh Phong cộng (2007) Phát số gen độc lực E coli thịt bò, heo phân bò, heo kỹ thuật Multiplex PCR Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 3/2007 Calderwood S B., Acheson D W K., Keusch G T., Barrett T J., Griffin P M., Strockbine N A et al (1996) Proposed new nomenclature for SLT (VT) family ASM News 62:118-119 ISO 16140:2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Protocol for the validation of alternative methods International Organization for Standardization ISO 16654:2001: Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of Escherichia coli O157 Son Radu Shahilah Abdul Mutalib, Gulam Rusul, Zainori Ahmad, Tadaaki Morigaki, Norio Asai,Yung Bu Kim, Jun Okuda, and Mitsuaki Nishibuchi (1998) Detection of E coli O157:H7 in the Beef Marketed in Malaysia Appr Envirol Microbiol, March 64(3), 1153-1156 Terrance M Arthur, Joseph M Bosilevac, Xiangwu nou, and Mmohammad koohmaraie (2005) Evaluation of Culture- and PCR-Based Detection Methods for Escherichia coli O157:H7 in Inoculated Ground Beef Journal of Food Protection, Vol 68, No 8, 2005, Pages 1566–1574 ... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi sinh vật: Các chủng dùng nghiên cứu liệt kê Bảng Bảng Chủng vi khuẩn sử dụngtrong nghiên cứu TT Tên chủng Số lượng Nguồn gốc E coli O157: H7... trình phát phát E coli O157 thực thực phẩm thiết lập gồm bước sau: 25g mẫu thực phẩm tăng sinh phân tích 2.2.1 đến 2.2.5 Kết phân tích xác định dương tính với E coli O157 có hai hai sản phẩm khuếch... cho thấy phương pháp multiplex PCR cho kết phát E coli O157 thực phẩm tương đương với phương pháp ISO 16654:2001 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Thanh Phong cộng (2007) Phát số gen độc lực E coli thịt