Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong lá và nụ vối

Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid nụ vối Nguyễn Quốc Tuấn Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Hoá phân tích; Mã số: 60 44 29 Người hướng dẫn: PGS.TS Phương Thiện Thương Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tách β’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-γ’,5’-dimethylchalcone (CO -1) từ nụ vối Xây dựng phương pháp định tính flavonoid phản ng hóa học Tìm hệ dung mơi định tính flavonoid sắc ký mỏng (TLC) Tìm điều kiện chạy HPLC định tính chất CO-1 từ nụ vối Xác định flavonoid toàn phần nụ vối c a số mẫu dược liệu vối thu hái tỉnh phía Bắc Xây dựng phương pháp định lượng CO-1 HPLC ng dụng phương pháp xây việc định lượng mẫu nụ vối thu hái tỉnh phía Bắc Keywords: Hóa học; Hóa phân tích; Cây Vối Content M Đ U Cây Vối, loại quen thuộc c a làng quê tỉnh Đồng Bằng bắc bộ, có tên khoa học Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae) Từ lâu nhân dân ta biết dùng nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nước uống hàng ngày vừa có tác dụng nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực Thành phần hóa học nụ vối flavonoid, với khoảng β0 flavonoid khác Các flavonoid có nhiều tác dụng sinh học quý chống ung thư, chống dị ng, chống co giật, giảm đau, nghẽn mạch, nghẽn phế quản, lợi mật, diệt nấm Trong dự thảo Dược Điển Việt Nam V (dự kiến xuất năm β01γ-2014) có chuyên luận nụ vối Tuy nhiên, chun luận chưa có tiêu chí định tính định lượng flavonoid nụ vối, flavonoid thành phần có nhiều tác dụng quan sinh học trọng Với thực trạng trên, đề xuất thực đề tài “Xơy dựng ph ng pháp định tính, định l ng flavonoid nụ vƠ v i” Kết c a đề tài sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng dược liệu nụ vối phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu thị trường Các mục tiêu c a đề tƠi g m có: • Phân lập flavonoid nụ vối dùng làm chất đối chiếu việc định tính, định lượng flavonoid • Xây dựng quy trình định tính định lượng flavonoid dược liệu nụ vối CH NG 1: T NG QUAN 1.1 T ng quan cơy v i 1.1.1 Tên gọi - Tên tiếng Việt: Cây vối, vối nhà - Tên Latin: Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry - Tên đồng nghĩa: Eugenia operculata Roxb - Họ Sim (Myrtaceae) 1.1.2 Đặc điểm thực v t Cây vối loại gỗ nhỡ, cao 5-10 m, có hơn, vỏ thân n t nẻ, màu nâu đen Cành nhánh có nhiều vảy, cành non trịn hay hình cạnh, nhẵn Lá đơn mọc đối, có cuống dài 11,5 cm, dai, c ng, phiến hình trái xoan hay hình tr ng, dài 8-β0 cm, rộng 5-8 cm giảm nhọn gốc, có mũi ngắn Quả hình cầu hay hình tr ng, đường kính 7-12 mm, xù xì, chín có màu tím, thể chất nạc, vị a) Cây vối b) Nụ vối tươi b) Nụ vối khô Hình 1.1: Hình ảnh Cây Nụ vối 1.1.3 ThƠnh ph n hóa học Lá Vối ch a tanin, vết alcaloid (nhóm indolic) tinh dầu, tinh dầu gồm nhiều thành phần thành phần (Z)- -ocimen, myrcen, (E)- -ocimen Trong vối có ch a flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường tự sterol Vỏ ch a triterpen nhóm ursan acid usolic Nụ vối ch a nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần xác định cấu trúc hóa học 1.1.4 Tác dụng sinh học c a flavonoid vƠ nụ v i Các flavonoid cịn có khả tạo ph c với ion kim loại nên có tác dụng chất xúc tác ngăn cản phản ng oxy hóa Do đó, chất flavonoid có tác dụng bảo vệ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, thối hóa gan, tổn thương b c xạ Flavonoid cịn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy tử vong bệnh lý tim mạch thiếu máu tim, đau thắt ngực, nhồi máu tim, xơ vữa động mạch,…nhờ khả chống oxy hóa khơng hồn tồn cholesterol - Tác dụng ức chế phát triển TB ung thư: 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'dimethylchalcone phơn l p từ nụ v i có tác dụng c ch phát triển c a TB ung th với dòng TB ung th khác - Tác dụng làm giảm đường huyết: tác dụng c chế maltase đường ruột làm giảm đường huyết chuột gây bệnh tiểu đường - Tác dụng chống oxy hóa: c chế enzym α-glucosidase - Tác dụng chống Alzheimer: flavonoid quercetin, kaempferol, tamarixetin phân lập từ nụ vối có tác dụng chống Alzheimer thông qua c chế acetylcholinesterase butyrylcholinesterase 1.2 Các ph ng pháp định tính, định l ng flavonoid 1.2.1 Ph ng pháp định tính a) Phương pháp ống nghiệm Phản ứng với amoniac Nhiều flavonoid thay đổi màu gặp NH3 Có thể quan sát biến đổi màu mắt thường ánh sáng tử ngoại Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda) Phản ng có mặt nhân -penzopyron đa số flavonoid Thuốc thử HCl đặc bột Magie kim loại Phản ứng thuốc thử Sibata dung dịch H2SO4 đậm đặc Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài mililit H2SO4 đậm đặc, sau cho thêm 0,1 gam Mg, thêm từ từ rượu isoamylic theo thành ống nghiệm Đun nóng, có màu hồng từ từ xuất chuyển sang đỏ cam đỏ tím [6] Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5% Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc xuất màu xanh đen b) phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) SKLM kỹ thuật tách chất tiến hành cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, ta đặt hỗn hợp chất cần tách 1.2.2 Ph ng pháp định l a) Phương pháp cân: chất tạp chất ng flavonoid ng dụng nguyên liệu giàu có flavone flavonol dịch b) Ph ng pháp trắc quang Nguyên tắc: Phương pháp xác định dựa việc đo độ hấp thụ ánh sáng c a dung dịch ph c tạo thành chất cần xác định với thuốc thử vô hay hữu mơi trường thích hợp chiếu chùm sáng Phương trình định lượng c a phép đo dựa định luật Lamber-Beer: A = K.C Trong đó: A: Độ hấp thụ quang K: Hằng số thực nghiệm C: Nồng độ chất phân tích Phương pháp cho phép xác định nồng độ chất khoảng 10 -5 – 10-7M phương pháp sử dụng phổ biến Đối với flavonoid cho tạo màu phản ng cyanidin, phản ng kết hợp với muối diazoni, tạo ph c màu với AlCl3, muối titan… Phương pháp trắc quang có độ nhạy, độ ổn định độ xác cao phương pháp sử dụng phổ biến phân tích c) Ph ng pháp sắc ký l ng hiệu cao (HPLC) Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp hóa lý dựa vào lực khác c a chất khác với hai pha tiếp xúc không đồng tan với nhau, pha động pha tĩnh Quá trình sắc ký xảy chế: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion rây phân tử Thời gian lưu c a chất thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến chất khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic sắc ký đồ CH NG 2: Đ I T NG, N I DUNG NGHIÊN C U 2.1 Đ i t ng nghiên c u Nụ vối nhà, Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr.et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae) thu hái địa phương khác nhau, tỉnh phía Bắc Sau phơi sấy 500C khô Các mẫu nụ vối lưu Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu 2.2 N i dung nghiên c u - Phân lập flavonoid từ nụ vối Tinh chế hoạt chất đạt độ tinh khiết cần thiết cho việc định tính, định lượng - Xây dựng phương pháp định tính flavonoid từ nụ vối - Xây dựng phương pháp định lượng flavonoid từ nụ vối 2.3 Thi t bị, dụng cụ vƠ hóa ch t, dung mơi 2.3.1 Thi t bị, dụng cụ - Cân kỹ thuật Precisa XT 6β0M - Cân phân tích Precisa XT 220A - Máy cất quay Buchi B481 - T sấy Binder – FD 115 - Đèn tử ngoại - Hệ thống HPLC _ LC10A, hãng Shimadzu (Nhật Bản) - Máy TLC chấm mẫu bán tự động CAMAG LINOMAT5, CAMAG REPROSTARγ - Máy UV-VIS 1800, dải đo 190 nm-900 nm, hãng Shimadzu (Nhật Bản) 2.3.2 Hóa ch t, dung môi - Dung môi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen… dùng cho sắc ký đạt tiêu chuẩn phân tích, dung mơi dùng chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp chưng cất lại trước dùng - Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silica gel GFβ54 (Merck) - Silica gel sắc ký cột pha thường, cỡ hạt 40-63µm (Merck) - Hóa chất: hóa chất để làm phản ng định tính phương pháp hóa học, định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) định lượng phương pháp đo quang, HPLC CH NG 3: K T QU VÀ TH O LU N 3.1 Chi t xu t vƠ phơn l p m t flavonoid từ nụ v i 3.1.1 Chi t xu t d c liệu vƠ phơn đo n Cân kg dược liệu (nụ vối) làm khô, chiết ethanol 96% phương pháp ngâm lạnh, cho ethanol ngập hết dược liệu, thời gian ngâm tuần/lần rút dung dịch chiết, ngâm γ lần (dịch nhạt màu) Dung dịch chiết thu được, đem cất thu hồi dung môi ethanol cô cách th y, thu cao tồn phần (119β g) Lấy 1000 g cao đem hịa tan lượng vừa đ 0,5 lít ethanol 96%, tiếp tục bổ xung thêm 1,5 lít nước cất để hịa tan Quy trình chiết tóm tắt sơ đồ γ.1: 3.1.2 Phân l p flavonoid cao phơn đo n ethyl acetat Cân khoảng γ00g cao phân đoạn EtOAc Tiến hành chạy cột với hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat với độ phân cực tăng dần (tỉ lệ dung mơi từ 49:1 đến 1:1) Dùng bình nón tích β50 ml để h ng dung dịch khỏi cột, thu γβ bình (β00 ml) Tất bình h ng kiểm tra sắc ký lớp mỏng Bằng cách này, ta thấy từ bình 04 đến bình 09 cho sắc đồ giống có vết màu vàng (hình γ.1), gộp bình lại, cất thu hồi dung môi cô cách th y đến khơ thu chất rắn có màu da cam, gọi chất rắn CO-1 (4,329 g) a) Hình ảnh SKLM b) Hình ảnh chất CO-1 Hình 3.1: Hình ảnh SKLM chất CO-1 phân lập từ nụ vối 3.1.3 Xác định c u trúc ch t phân l p Chất rắn CO-1 tinh thể có màu vàng da cam, có điểm nóng chảy 1β5-1270C Kiểm tra độ tinh khiết máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) cho biết chất CO-1 phân lập có độ tinh khiết 98,β1% tính theo diện tích pic, sắc ký đồ thể hình γ.β 9: 341 nm, nm nuvoistd nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat Area 200 0 10 12 14 16 18 20 83 251 206 966 581 381 144 252 545 258 165 179 113 259 142 300 197 358 314 146 102 116 160 506 66 6412 2036 1009 2351 1201 15949 4250687 2476 5242 1199 1875 691 1457 34016 100 22 24 Minutes Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC chất CO-1 Kết hợp số liệu phổ UV, IR, 1H-NMR 13C-NMR cho thấy chất CO-1 2',4'dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon, có CTPT C18H18O4 KLPT 298 amu Phổ khối MS cho pic ion phân tử [M+H] +, có m/z = 299; [M-H]+ có m/z = β97, tương ng với khối lượng phân tử c a chất rắn CO-1 M = 298 amu Công th c cấu tạo c a chất CO-1 trình bày hình γ.γ Hình 3.3: Cơng thức cấu tạo chất CO-1 Kiểm tra độ tinh khiết HPLC, đo nhiệt độ nóng chảy c a CO-1 nhiều lần cho kết ổn định 1β5-127oC Như vậy, sử dụng mẫu chất CO-1 phân lập làm chất đối chiếu phép xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid chất mẫu nụ vối 3.2 Xơy dựng ph ng pháp định tính flavonoid vƠ nụ v i 3.2.1 Định tính ph n ng hóa học B ng 3.1: K t qu định tính flavonoid nụ vƠ v i 3.2.2 Định tính TLC 3.2.2.1 Định tính flavonoid dược liệu nụ vối a) Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký Dung dịch thử: Lấy gam bột dược liệu (nụ, vối) cho vào bình nón, thêm 50 ml methanol (MeOH) đem siêu âm γ0 phút, lọc qua giấy lọc, dịch lọc để làm phép định tính Dung dịch đối chiếu: Dung dịch flavonoid (tách nụ vối) MeOH (hàm lượng khoảng mg/ml) b) Hệ dung môi sắc ký: Tiến hành khảo sát triển khai sắc ký cho hệ dung môi sau: Hệ 1: Toluen:EtOAc:Aceton:Acid formic =5:β:2:1 (v:v:v ) Hệ β: EtOAc:Acid acetic:Acid formic:Nước =10:1:1:β (v:v:v:v ) Hệ γ: n-Hexan : EtOAc : Acid formic =6:3:0,1 (v:v:v ) Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nước = 7:γ:1,5:1 (v:v:v) Hình 3.4: Sắc ký đồ định tính flavonoid nụ vối C: Chất chuẩn CO-1 N: Nụ vối L: Lá vối Các sắc ký đồ hình (A,B,C) cho thấy flavonoid nụ, vối cho vết màu đen xám soi UV-254 nm UV-366 nm Sau phun thuốc thử H2SO4 10% /ethanol sấy 1050C, miền ánh sáng trắng cho vết có màu vàng (R f =0,47) đặc trưng c a flavonoid Như sử dụng hệ γ làm hệ dung môi cho việc triển khai sắc ký để định tính flavonoid việc xây dựng tiêu chuẩn sở cho dược liệu nụ, vối 3.2.3 Định tính HPLC * Chuẩn bị dung dịch vối: Cân xác khoảng 1g bột dược liệu, thêm xác khoảng β5,00 ml methanol, đem siêu âm γ0 phút, làm lặp β lần, để nguội, bổ sung lượng methanol cho đ 50,00ml Lọc, đem xác định hàm lượng * Chuẩn bị dung dịch nụ vối: Cân xác khoảng 1g bột dược liệu, thêm xác khoảng β5,00 ml methanol, đem siêu âm γ0 phút, làm lặp β lần, để nguội, bổ sung lượng methanol cho đ 50,00 ml Lọc, hút xác 1ml đem hịa tan định m c thành 10,00ml methanol, sau đem tiêm sắc ký * Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn: Cân xác 1,10 mg chất CO-1, thêm xác 1,00 ml methanol, sau đem siêu âm 10 phút Hút xác 0,50 ml đem pha lỗng methanol tới 5,00 ml để nổng độ c a CO-1 0,11 mg/ml, sau đem tiêm sắc ký 9: 341 nm, nm nuvoistd nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat 9: 341 nm, nm nuvoihungyen nuvoihungyenm2(4mg.ml)- 25042012 - 10uL -001.dat 80 Area 200 9: 341 nm, nm lavoi lavoibacgiang(20mg.ml)- 29052012 - 10uL -003.dat 400 Area Area 300 60 200 10 12 14 16 18 20 22 61169 429 452 254 140 93 171 155 3252 2988 5471 1672 1178 1307 425 227 77788 54358 5215 4829 5537 3529 52777 68840 63088 35304 1885 83 251 206 966 581 252 545 258 165 179 113 259 142 300 197 358 314 146 102 116 160 100 1652910 506 2476 66 6412 2036 1009 2351 1201 15949 4250687 5242 1199 1875 691 1457 34016 20 37467 107289 40768 31034 145292 597620 40 100 10 12 14 16 18 20 22 24 Minutes Minutes 12 14 16 18 20 Minutes Sắc ký đồ c a vối (L) Sắc ký đồ c a nụ vối (N) Sắc ký đồ chất đối chiếu (C) 10 Hình 3.5 : Sắc ký đồ mẫu đối chiếu CO-1 nụ, vối Qua tiến hành thí nghiệm tìm điều kiện định tính CO-1 nụ vối sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) thông qua thời gian lưu tR 3.3 Xơy dựng ph ng pháp định l ng flavonoid vƠ nụ v i 3.3.1 Xơy dựng ph ng pháp trắc quang 3.3.1.2 Đ lặp l i c a ph ng pháp Để xác định độ lặp lại c a phương pháp tiến hành với thí nghiệm riêng biệt cho mẫu nụ vối Hưng yên Bảng 3.2: Kết độ lặp lại phương pháp trắc quang mm u(g) 1,0041 1,0064 1,0110 1,0365 1,0189 1,0831 Abs 0,174 0,181 0,184 0,191 0,196 0,193 STT S liệu th ng kê -2 SD = 0,83.10 ; RSD = 4,45% Kết bảng γ.β cho thấy phương pháp có độ lặp lại chấp nhận thông qua RSD = 4,45% (< 5%) 3.3.1.3 Xơy dựng đ ng chuẩn Xây dựng đường chuẩn chất đối chiếu CO-1: Tiến hành pha dãy dung dịch đối chiếu CO-1 (chất tách từ nụ vối) với nồng độ xác 12, 24, 36, 48 , 72 100 mg/l Kết trình bày bảng γ.γ Dựa phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn (hình 3.6) Bảng 3.3: Kết xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu CO-1 N ng đ (mg/l) 12 24 36 48 72 100 A510 (Abs) 0,042 0,082 0,120 0,160 0,231 0,332 Đ h p thụ quang y = 0.0033x + 0.0026 R2 = 0.999 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 20 40 60 80 100 120 N ng đ CO-1 (mg/l) Hình 3.6: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo CO-1 Từ kết bảng γ.5 hình γ.7 kết khảo sát cho thấy với nồng độ c a chất đối chiếu CO-1 từ 1β-100 mg/l có tương quan tuyến tính nồng độ độ hấp thụ quang Ta y = 0.00γγx + 0.00β6 với hệ số tương quan R2 = 0.9990 Dựa phần mềm Originpro 7.5 tính độ lệch chuẩn c a phương trình hồi quy S y= 0,00366 SA= 5,04.10-5 ; SB = 0,00β8 Tra bảng ta t(0,95; 5) = 2,571 ph ng trình h i quy đ y đ : y = (0,0033 ± 1,30.10 -4)x + (0,0026± 0,0072) Xây dựng đường chuẩn chất chuẩn catechin: Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn catechin (Sigma) với nồng độ xác 45, 90, 180, γ60 450 mg/l Kết trình bày bảng γ.6 Dựa phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn (hình γ.7) Bảng 3.4: Kết xây dựng đường chuẩn theo chất chuẩn catechin 45 90 180 360 450 Đ h p thụ quang A510(Abs) 0,107 0,214 0,457 0,890 1,091 Đ h p thụ quang N ng đ (mg/l) 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 y = 0.0024x + 0.0022 R2 = 0.9993 100 200 300 400 500 N ng đ Catechin (mg/l) Hình 3.7: Đường chuẩn xác định flavonoid tồn phần theo catechin Kết bảng γ.6 hình γ.8 kết khảo sát với nồng độ c a chất chuẩn catechin từ 45-450 mg/l có tương quan tuyến tính nồng độ độ hấp thụ quang Ta y = 0,00β4x + 0,00β với hệ số tương quan R2 = 0.999γ Tra bảng t(0,95; 4) = β,776 Dựa phần mềm Originpro 7.5 ta tính độ lệch chuẩn c a phương trình hồi quy sau: Sy = 0,01289 Sa= 3,70.10-5 ; Sb = 0,01013 Ph ng trình h i quy đ y đ lƠ: y = (0,0024 ± 1,07.10 -4)x + (0,002 ± 0,0028) 3.3.1.4 Giới h n ph ng pháp a) Giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ: Để tiến hành xác định LOD LOQ tiến hành chuẩn bị dung dịch mẫu trắng cách lấy vào 10 bình định m c cỡ 10 ml: Cho vào bình có ch a sẵn khoảng ml nước cất + 0,3 ml NaNO2 5% + 0,3 ml AlCl3 10% + ml NaOH 1M sau định m c nước cất hai lần, sau khoảng 10 phút đem đo độ hấp thụ quang c a dãy dung dịch bước sóng 510 nm (với dung dịch so sánh nước cất) ta thu kết bảng γ.7 Bảng 3.5: Kết xác định độ lệch chuẩn mẫu trắng STT 10 A510 0,002 0,002 0,003 0,002 0,004 0,002 0,003 0,002 0,002 0,004 Kết ta tính giá trị trung bình: AO = 0,0026 Giá trị độ lệch chuẩn: SD = 0,84γ.10-3 Giới hạn phát LOD LOQ c a phương pháp dùng chất CO-1 làm chất đối chiếu: 0,843.103 SY LOD = = = 0,77 mg/l 0, 0033 b 0,843.103 SY LOQ = 10 = 10 = 2,55 mg/l 0, 0033 b Giới hạn phát LOD LOQ c a phương pháp dùng chất chuẩn catechin làm chuẩn: LOD = 0,843.103 SY = = 1,05 mg/l 0, 0024 b 0,843.103 SY = 10 = 3,51 mg/l LOQ = 10 0, 0024 b b) Giới hạn LOL: Xác định cách nới rộng nồng độ điểm c a đường chuẩn tương quan nồng độ độ hấp thụ quang không cịn tuyến tính Đối với chất đối chiếu CO-1: Bảng 3.6: Kết xác định nồng độ giới hạn LOL chất đối chiếu CO-1 N ng đ CO-1 (mg/l) 48 72 100 110 120 130 A510 0,160 0,231 0,332 0,351 0,376 0,381 10 Độ hấp thụ quang Giới hạn LOL 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 50 100 150 Nồng độ CO-1 (m g/l) Hình 3.8: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL CO-1 Kết bảng 3.6 hình 3.8 cho thấy nồng độ giới hạn LOL 1β0 mg/l, nồng độ trở đồ thị c a độ hấp thụ quang theo nồng độ khơng cịn tuyến tính Như kho ng n tính c a phương pháp xác định theo chất đối chiếu CO-1 khoảng từ 2,55 ậ 120 mg/l Đối với chất chuẩn catechin: Bảng 3.7: Kết xác định nồng độ giới hạn LOL catechin N ng đ catechin (mg/l) 500 900 1000 1100 1200 1300 A510 1,217 2,246 2,534 2,712 2,798 2,834 Độ hấp thụ quang Giới hạn LOL 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Nồng độ catechin (m g/l) Hình 3.9: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL catechin Kết bảng γ.7 hình γ.9 cho thấy nồng độ giới hạn LOL 1000 mg/l, nồng độ trở đồ thị c a độ hấp thụ quang theo nồng độ khơng cịn tuyến tính Như kho ng n tính c a phương pháp xác định theo chất chuẩn catechin khoảng từ 3,51 ậ 1000 mg/l 3.3.1.5 Đ c a ph ng pháp Để xác định độ thực với dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ xác 1β mg/l Sau tiến hành phân tích mẫu chuẩn lặp lại lần, kết ghi bảng γ.7 Bảng 3.8: Kết xác định độ phương pháp STT 11 0,043 0,042 0,044 0,041 0,041 0,042 12,367 12,000 12,700 11,700 11,700 12,000 A510 HƠm l ng S liệu th ng kê Ta có ttn = 12  12, 78 0,86 m = 12,78; SD = 0,86 = 2,22 Tra bảng t(0,95;5) = β,57 > t tn = 2,22 Như : tc > ttn : Khơng có khác kết c a giá trị trung bình so với giá trị tham chiếu m c ý nghĩa α = 0,95, t c phương pháp có độ đạt yêu cầu → Ph ng pháp không mắc sai s hệ th ng 3.3.1.6 Đ n định c a ph ng pháp Tiến hành đo độ hấp thụ quang c a chất CO-1 có nồng độ 1β mg/l c a catechin có nồng độ 100 mg/l Sau dùng hàm chuẩn studen (t) để đánh giá Kết thể bảng γ.9 Bảng 3.9 : Kết đánh giá độ ổn định phương pháp theo cách 1 CO-1 0,043 0,042 0,044 0,041 0,041 0,042 Catechin 0,242 0,242 0,243 0,242 0,241 0,243 STT A510 Ta có : Đối với chất CO-1: A510 = 0,0422 ; S1 = 11,70.10-4 Đối với chất catechin : A510 = 0,2422 ; S2 = 7,54.10-4 Ta có: Ftn = S12 (11, 70.104 )2 = = 1,55 > Ta So sánh Ftn với Fc(0,05 ;5 ;5) (7,54.104 )2 S22 Tra bảng ta có Fc(0,05 ;5 ;5) = 5,0503 > Ftn = 1,55 : Như hai phương sai khác có ý nghĩa, hai phương pháp có độ lặp lại tương đồng K t qu định l ng flavonoid toƠn ph n nụ vƠ v i Hàm lượng flavonoid toàn phần nụ vối tính theo khối lượng chất chuẩn catechin (g) chất đối chiếu CO-1 (g) Được tính g khối lượng mẫu dược liệu khô tuyệt đối Giá trị kết c a hàm lượng flavonoid toàn phần làm lặp lại γ lần kết bảng γ.1β biểu diễn : m ± SD Bảng 3.10 : Kết xác định flavonoid toàn phần STT Tên m u (n i thu hái) mm u (g) HƠm l ng HƠm l ng flavonoid toƠn ph n flavonoid toƠn ph n tính theo Catechin tính theo (mg/g) CO-1 (mg/g) Các m u 12 Bắc Giang 1,0028 30,33 ± 1,060 22,42 ± 1,060 Bắc Ninh 1,0017 20,73 ± 1,040 15,44 ± 1,040 Hà Đông (HN) 1,0028 21,81 ± 1,230 16,23 ± 1,230 Hịa Bình 1,0180 29,70 ± 1,320 21,99 ± 1,320 Phú Thọ 1,0066 23,74 ± 1,160 17,62 ± 1,160 Quảng Ninh 1,0221 22,61 ± 0,840 16,81 ± 0,840 Thái Bình 1,0380 22,69 ± 0,840 16,87 ± 0,840 1,0020 39,23 ± 1,630 28,91 ± 1,630 Các m u nụ Chợ Đồng Xuân(HN) Hưng Yên 1,0014 42,11 ± 1,630 30,99 ± 1,630 10 Nam Định 1,0032 40,93 ± 2,230 30,13 ± 2,230 11 Hải Dương 1,0045 39,23 ± 2,200 28,88 ± 2,200 12 Hà Đông (HN) 1,0052 34,98 ± 1,620 25,79 ± 1,620 13 Hà Nam 1,0066 38,51 ± 1,160 28,36 ± 1,160 14 Thái Nguyên 1,0013 37,43 ± 1,620 27,57 ± 1,650 Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn CO-1: Trong mẫu vối khoảng 15,44γ – ββ,418 mg/g Trong nụ vối khoảng từ β5,791 – 30,995 mg/g Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn catechin: Trong mẫu vối khoảng β0,7β8 – γ0,γγ1 mg/g Trong nụ vối khoảng từ γ4,978 – 42,114 mg/g Qua bảng 3.10 nhận thấy hàm lượng flavonoid toàn phần nụ vối cao so với hàm lượng flavonoid toàn phần vối 3.3.2 Xơy dựng ph ng pháp định l ng flavonoid HPLC 3.3.2.1 Kh o sát tính thích h p c a hệ th ng Để đánh giá tính thích hợp c a hệ thống sắc ký, tiến hành pha mẫu đối chiếu có nồng độ 0,05γ mg/ml, tiến hành sắc ký lần với điều kiện sắc ký lựa chọn Kết khảo sát tính thích hợp c a hệ thống ghi bảng γ.11 Bảng 3.11 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống L n tiêm Th i gian l u Diện tích pic 9,12766 2190950 13 Các thông s th ng kê 9,07053 2186244 SD = 21052 9,18479 2205546 RSD = 0,95 (%) 9,47704 2245278 9,53417 2214240 9,41771 2213154 Kết cho thấy điều kiện sắc ký lựa chọn hệ thống HPLC phù hợp đảm bảo ổn định c a phép phân tích định lượng CO-1 3.3.2.2 Kho ng n tính c a ph ng pháp Chuẩn bị dãy gồm dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ xác khoảng 0,0055 mg/ml đến 0,11 mg/ml tiến hành chạy sắc ký điều kiện mô tả Kết khảo sát trình bày bảng γ.15 đường chuẩn lập được, thể hình 3.12 Bảng 3.12: Kết khảo sát khoảng tuyến tính Dung dịch N ng đ (mg/ml) Diện tích pic (AU.s) 0,11 4575033 0,055 2483455 0,0275 1138335 0,011 529218 0,0055 269653 27465 Sử dụng phần mềm origin 7.5 vẽ đường chuẩn tính tốn DiƯn tÝch PÝc 5000000 Ph- ơng trình: Y = A + B * X 4000000 Thông số Giá trị Sai số -A 54599.803 46041.88268 B 4.16056E7 890693.07305 3000000 2000000 R SD N P -0.99908 83327.81606