Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định một số ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa nhân sâm ( panax ginseng)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM (PANAX GINSENG) Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: HD1: TS NGUYỄN THỊ ÁNH HƢỜNG HD2: PGS.TS PHẠM THỊ THANH HÀ HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Lời cho gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS NGUYỄN THỊ ÁNH HƢỜNG, PGS.TS PHẠM THỊ THANH HÀ ThS CAO CÔNG KHÁNH tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài viết luận văn Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS LÊ HỒNG HẢO, ban lãnh đạo Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia anh chị, bạn công tác Viện Kiểm định Vệ sinh An toàn Thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi cho đƣợc học tập nghiên cứu môi trƣờng đại Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô giáo giảng dạy khoa Hoá, đặc biệt thầy cô môn Hoá Phân tích, cho kiến thức quý giá trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học Hoá K24, đặc biệt ngƣời bạn nhóm Hoá phân tích K24 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt trình học tập thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè động viên, chia sẻ khó khăn Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2016 Học viên Nguyễn Thị Hạnh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Abs Tiếng Anh Absorbance ACN Tiếng Việt Độ hấp thụ quang Acetonitril Association of Official Hiệp hội cộng đồng phân tích AOAC Analytical Community thức AS Asymmetry factor Hệ số đối xứng pic GC Gas Chromatography Sắc ký khí High performance liquid HPLC chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao High performance thin layer HPTLC chromatography Sắc ký lớp mỏng hiệu cao IR Infrared Hồng ngoại Liquid chromatography tandem LC-MS/MS mass spectrometry Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lƣợng MS Mass spectrometry Khối phổ PDA Photodiode Array Mảng diod quang R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi RP-HPLC Reverse phase-HPLC Sắc ký lỏng pha đảo RS Resolution Độ phân giải RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn TLC Thin layer chromatography Lớp mỏng cao Thực phẩm chức TPCN tR Retention time Thời gian lƣu USP United States Pharmacopeia Dƣợc điển Hoa Kỳ UV-VIS Ultraviolet-Visible Tử ngoại khả kiến DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tác dụng đặc trƣng loại ginsenosid Bảng 1.2 Các Saponin có aglycon protopanaxadiol Bảng 1.3 Các Saponin có aglycon protopanaxatriol 10 Bảng 1.4 Saponin với aglycon acid oleanolic Bảng 3.1 Chƣơng trình gradient 1, 26 Bảng 3.2 Chƣơng trình gradient 3, 27 11 Bảng 3.3 Danh mục pha động HPTLC khảo sát 29 Bảng 3.4 Kết định lƣợng ginsenosid mẫu TPCN dạng dung dịch với số lần chiết nbutanol khác 34 Bảng 3.5 Độ lặp lại thời gian lƣu diện tích pic chất 37 Bảng 3.6 Độ lặp lại hệ số lƣu giữ Rf 38 Bảng 3.7 Kết đánh giá độ tuyến tính chất chuẩn Rg1, Rg1 41 Bảng 3.8 Độ lệch điểm chuẩn dùng xây dựng đƣờng chuẩn Rg1, Rb1 43 Bảng 3.9 Kết đánh giá độ tuyến tính Rg1, Rb1 HPTLC 43 Bảng 3.10 Độ lệch chuẩn điểm chuẩn dùng xây dựng đƣờng chuẩn Rg1 44 Bảng 3.11 Độ lệch chuẩn điểm chuẩn dùng xây dựng đƣờng chuẩn Rg1 46 Bảng 3.12 Độ lặp lại ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang cứng 47 Bảng 3.13 Độ lặp lại ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang mềm 48 Bảng 3.14 Độ lặp lại ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu nƣớc sâm 49 Bảng 3.15 Kết phân tích độ lặp lại ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu dạng bột 50 Bảng 3.16 Kết phân tích độ lặp lại ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu viên nang mềm HPTLC 51 Bảng 3.17 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang cứng 52 Bảng 3.18 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang mềm 53 Bảng 3.19 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu dung dịch 54 Bảng 3.20 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang cứng HPTLC 55 Bảng 3.21 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang mềm HPTLC 56 Bảng 3.32 Kết phân tích ginsenosid Rb1, Rb1 TPCN 57 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mức di động ginsenosid 'Rx' sắc ký lớp mỏng Hình 1.2 Cấu trúc Saponin có aglycon protopanaxadiol Hình 1.3 Cấu trúc Saponin có aglycon protopanaxatriol 10 Hình 1.4 Cấu trúc Saponin với aglycon acid oleanolic 10 Hình 1.5 Công thức cấu tạo ginsenosid Rb1 11 Hình 1.6 Công thức cấu tạo ginsenosid Rg1 11 Hình 3.1 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 27 Hình 3.2 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 27 Hình 3.3 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 28 Hình 3.4 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosde Rg1, Rb1 với gradient 28 Hình 3.5 Hình ảnh HPTLC với hệ pha động 29 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hiệu chiết mẫu sử dụng MeOH nồng độ khác 31 Hình 3.7 Sắc đồ sử dụng với dung môi chiết MeOH 70% 31 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn hiệu chiết mẫu sử dụng EtOH nồng độ khác 32 Hình 3.9 Đồ thị biểu thị hiệu chiết mẫu với dung môi hữu loại lipid 33 Hình 3.10 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 37 Hình 3.11 Sắc đồ mẫu trắng 39 Hình 3.12 Sắc đồ dung dịch mẫu trắng TPCN có thêm ginsenosid Rg1, Rb1 Hình 3.13 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1,Rb1 39 Hình 3.14 Phổ hấp thụ UV ginsenosid Rg1 40 Hình 3.15 Phổ hấp thụ UV ginsenosid Rb1 40 Hình 3.16 Sắc đồ dung dịch thử thêm chuẩn ginsenosid 41 Hình 3.17 Đồ thị đƣờng chuẩn Rg1, Rb1 phân tích HPLC 42 Hình 3.18 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 500pm 42 Hình 3.19 Đồ thị đƣờng chuẩn Rg1, Rb1 HPTLC 44 Hình 3.20 Sắc đồ ginsenosid Rg1 Rb1 phân tích HPTLC 45 Hình 3.21 Sắc đồ ginsenosid 3,0 ppm pha dung dịch mẫu trắng 45 Hình 3.22 Sắc đồ phân tích độ lặp lại lần viên nang cứng 47 Hình 3.23 Sắc đồ phân tích độ lặp lại viên nang mềm lần 48 Hình 3.24 Sắc đồ phân tích độ lặp lại mẫu nƣớc sâm lần 49 Hình 3.25 So sánh độ lặp lại sắc đồ 10 mẫu thực phẩm chức chứa nhân sâm dạng bột 50 Hình 3.26 Sắc đồ phân tích độ lặp lại ginsenosid Rg1, RB1 mẫu viên nang mềm HPTLC 51 Hình 3.27 Sắc đồ phân tích độ thu hồi ginsenosid viên nang cứng lần 52 Hình 3.28 Sắc đồ phân tích độ thu hồi ginsenosid viên nang mềm lần 53 Hình 3.29 Sắc đồ phân tích độ thu hồi ginsenosid dung dịch lần 54 Hình 3.30 Sắc đồ phân tích mẫu nang cứng mã NC3 57 Hình 3.31 Sắc đồ phân tích mẫu nang mềm mã NM4 57 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC, CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN DANH MỤC HÌNH VẼ TRONG KHÓA LUẬN CHƢƠNG – TỔNG QUAN 13 1.1 Tổng quan nhân sâm hoạt chất nhân sâm 13 1.1.1 Giới thiệu chung nhân sâm 1.1.2 Tác dụng đặc trƣng nhân sâm 14 1.1.3 Vài nét nhóm hoạt chất ginsenosid 1.1.4 Công thức cấu tạo tính chất vật lý ginsenosid Rg1 Rb1 13 15 1.2 Tổng quan phƣơng pháp phân tích ginsenosid 19 20 1.3 Các phƣơng pháp xử lý mẫu Error! Bookmark not defined 1.4 Tổng quan kỹ thuật HPTLC Error! Bookmark not defined 1.4.1 Sắc ký lớp mỏng Error! Bookmark not defined 1.4.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu cao Error! Bookmark not defined 2.1 Mục tiêu nghiên cứuError! Bookmark not defined 2.2 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3 Đối tƣợng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.4.1 Khảo sát điều kiện HPLC 2.4.2 Khảo sát điều kiện phân tích ginsenosid HPTLC Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 2.4.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu Error! Bookmark not defined 2.4.4 Thẩm định quy trình Error! Bookmark not defined 2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu Error! Bookmark not defined 2.6 Nguyên vật liệu, thiết bị Error! Bookmark not defined 2.6.1 Thiết bị dụng cụ Error! Bookmark not defined 2.6.2 Hóa chất, thuốc thử Error! Bookmark not defined 2.6.3 Dung dịch chuẩn Error! Bookmark not defined CHƢƠNG – THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ Error! Bookmark not defined 3.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid HPLC Error! Bookmark not defined 3.2 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid HPTLC Error! Bookmark not defined 3.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 3.4 Thẩm định phƣơng pháp Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 3.4.1 Tính thích hợp hệ thống Error! Bookmark not defined 3.4.2 Tính chọn lọc, tính đặc hiệu 3.4.3 Khoảng tuyến tính Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 3.4.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng Error! Bookmark not defined 3.4.5 Độ lặp lại phƣơng pháp Error! Bookmark not defined 3.4.6 Độ thu hồi phƣơng pháp Error! Bookmark not defined 3.4.7 Kết áp dụng phƣơng pháp xác định ginsenosid Rg1, Rb1 số sản phẩm Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined Phụ lục 1: Sắc đồ đƣờng chuẩn Error! Bookmark not defined Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát độ lặp lại Error! Bookmark not defined Phụ lục 3: Sắc đồ khảo sát độ thu hồi Error! Bookmark not defined 10 ginsenosid thực phẩm chức chứa nhân sâm (Panax Ginseng)” Mục tiêu nghiên cứu:  Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời hai ginsenosid (Rg1 Rb1) kỹ thuật HPTLC HPLC  Thẩm định phƣơng pháp đã xây dựng theo tiêu chí giới  Áp dụng triển khai phân tích số mẫu thực phẩm chức chứa nhân sâm thị trƣờng Hà Nội 12 CHƢƠNG – TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nhân sâm hoạt chất nhân sâm 1.1.1 Giới thiệu chung nhân sâm Bộ phận thƣờng sử dụng rễ củ đƣợc phơi hay sấy khô Nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Họ Nhân sâm (Araliaceae Juss.) có tên gọi khác họ Ngũ gia bì Hầu nhƣ tất loài họ nhân sâm (Araliaceae) đƣợc sử dụng làm thuốc Y học cổ truyền nhiều nƣớc Á-Âu; đặc biệt nƣớc Đông-Bắc Á Sâm trồng gọi viên sâm, sâm mọc hoang gọi sơn sâm Viên sâm: Sâm trồng, phơi sấy khô, rễ có hình thoi hình trụ tròn, dài khoảng - 15 cm, đƣờng kính - cm, mặt màu vàng xám, phần toàn rễ có nếp nhăn dọc rõ, có khía vân ngang, thô, không liên tục, rải rác nông phần dƣới có - rễ nhánh nhiều rễ nhỏ, dài, thƣờng có mấu dạng củ nhỏ không rõ Thân rễ (Lô đầu) sát đầu rễ, dài - cm, đƣờng kính 0,3 - 1,5 cm, thƣờng cong co lại, có rễ phụ (gọi Đinh) có vết sẹo thân, tròn, lõm, thƣa (gọi Lô uyển) Chất tƣơng đối cứng, mặt bẻ màu trắng vàng, có tinh bột rõ, tầng phát sinh vòng tròn, màu vàng nâu, vỏ có ống tiết nhựa, dạng điểm, màu vàng nâu kẽ nứt dạng xuyên tâm Mùi thơm đặc trƣng, vị đắng Hồng sâm: Hấp, sấy phơi khô rễ viên sâm thu đƣợc Hồng sâm; Hồng sâm có dạng rễ hình thon hình trụ, dài khoảng - 15 cm, đƣờng kính - cm, mặt mờ, màu nâu đỏ, có vài vết đốm màu nâu vàng thẫm, có rãnh dọc, vân nhăn vết sẹo rễ con; phần đầu rễ có vòng tròn gián đoạn, không rõ nét, phần đuôi rễ mang 2-3 rễ nhánh vặn xoắn, chéo nhiều rễ cong queo, mang vết sẹo thân, tròn, lõm (Lô uyển); số thân rễ mang - rễ phụ, nguyên dạng gẫy (gọi đinh) Chất cứng giòn, mặt bẻ gẫy nhẵn, tựa nhƣ sừng Mùi thơm đặc trƣng, vị đắng Sơn sâm: Nhân sâm mọc hoang, phơi hay sấy khô Dƣợc liệu rễ cái, dài 13 ngắn thân rễ, có hình chữ V, hình thoi hình trụ, dài - 10 cm, mặt màu vàng xám, có vân nhăn dọc, đầu có vòng vân ngang, trũng sâu, dày đặc, thƣờng có rễ nhánh, rễ trông rõ ràng, mảnh dẻ, nhỏ xếp có thứ tự; có mấu lên rõ gọi “mấu hạt trân châu” Thân rễ mảnh dẻ, nhỏ, dài, phận có vết sẹo thân, dày đặc, rễ phụ tƣơng đối dày đặc, trông tựa nhƣ hình hạt táo Nhân sâm mọc hoang đƣợc trồng đông bắc Trung quốc, Triều Tiên, Liên xô cũ Việc trồng trọt nhân sâm công phu, sau 5-6 năm thu hoạch Đất phải tốt Cây ƣa bóng râm Thu hoạch vào mùa xuân mùa thu, rễ củ đƣợc rửa sạch, phơi nắng nhẹ, sấy nhẹ đến khô Ngƣời ta cho loại mọc hoang có giá trị loại trồng Hiện nƣớc ta chƣa trồng đƣợc, phải nhập nhân sâm nƣớc Hiện nhà khoa học tìm nhân sâm có chứa nhiều thành phần khác nhau, nhiên ginsenosid, thành phần định tác dụng nhân sâm Đây chất có khả tạo ảnh hƣởng tích cực sức khỏe 1.1.2 Tác dụng đặc trƣng nhân sâm Theo y học cổ truyền nhân sâm có công dụng: Đại bổ nguyên khí, ích huyết, kiện tỳ ích phế, sinh tân, an thần ích trí Chủ trị: Khí hƣ muốn thoát, chân tay lạnh, mạch vi, tỳ hƣ, ăn, phế hƣ ho suyễn; tân dịch thƣơng tổn, miệng khát nƣớc, nội nhiệt tiêu khát, đái tháo, bệnh lâu ngày gầy yếu, tâm hồi hộp, suy tim kiệt sức, hay choáng ngất Thành phần hoạt chất ginsenosid nhân sâm có tác dụng đặc trƣng khác đƣợc tóm tắt bảng 1.1 Bảng 1.1 Tác dụng đặc trưng loại ginsenosid Ginsenosid Tác dụng đặc trƣng Ro Phân giải rƣợu, chống viêm gan phục hồi hƣ tổn gan Rb1 Là Saponin kiểm chế hệ thống thần kinh trung ƣơng làm 14 dịu đau, bảo vệ tế bào gan Rb2 Ngăn ngừa, hạn chế bệnh tiểu đƣờng, phòng chống xơ cứng gan, đẩy nhanh khả hấp thụ tế bào gan Rc Làm dịu đau, tăng tốc độ tổng hợp protein Ức chế tăng trƣởng tế bào ung thƣ, ngăn cản hạn chế phát triển ung thƣ vú Rd Đẩy nhanh hoạt động vỏ tuyến thƣợng thận Re Bảo vệ gan, làm tăng tốc độ tổng hợp tế bào tủy Rf Làm dịu đau tế bào não Rg1 Khả gây hƣng phấn thần kinh trung ƣơng, chống phục hồi mỏi mệt, cải thiện trí nhớ, tạo DNA, RNA, kích hoạt protease Rg2 Hạn chế gắn kết tiểu cầu máu, phục hồi trí nhớ, tăng khả lƣu thông máu lên não, kéo dài thời gian sống tế bào Rh1 Bảo vệ gan, hạn chế khối u, ngăn chặn gắn kết tiểu cầu máu Rh2 Ức chế tế bào ƣng thƣ, hạn chế khối u phát triển 1.1.3 Vài nét nhóm hoạt chất ginsenosid Thành phần chủ yếu rễ sâm saponin triterpen Khi thuỷ phân saponin thu đƣợc loại sapogenin là: acid oleanolic, 20 (s) protopanaxadiol 20 (s) protopanaxatriol, hai loại sau có cấu trúc damaran Các Saponin Nhân sâm gọi ginsenosid đƣợc phân loại dựa vào cấu trúc ba sapogenin Saponin gọi saponosid nhóm glycosid gặp rộng rãi thực vật, động vật (Hải sâm, cá sao) Tuy nhiên Saponin Nhân sâm có cấu tạo hoá học khác so với giới thực vật khác, để phân biệt khác biệt ngƣời ta gọi Ginsenosid từ ghép Nhân sâm (ginseng) + glicozit (glycosid) Hầu hết ginsenosid có cấu trúc dammarane triterpenoid với khung gồm bốn vòng steroid cố định Nhiều gốc đƣờng khác (ví dụ nhƣ glucose, rhamnose, xylose 15 arabinose) gắn vị trí C-3, C-6 C-20 Ginsenosid đƣợc đặt tên 'Rx', với 'R' viết tắt gốc 'x' mô tả mức di động chúng sắc ký lớp mỏng, tính phân cực giảm từ số "một" đến "h".Ví dụ, Ra hợp chất phân cực Rb phân cực so với Ra Độ phân cực ginsenosid dẫn đến khả phân tách của ginsenosid khác đƣợc minh họa hình 1.1 Hình 1.1 Mức di động ginsenosid 'Rx' sắc ký lớp mỏng Chất lƣợng thành phần ginsenosid nhân sâm bị ảnh hƣởng yếu tố nhƣ: loài, tuổi, phận cây, phƣơng pháp canh tác, mùa thu hoạch phƣơng pháp bảo quản Tổng hàm lƣợng Saponin nhân sâm tỷ lệ thuận với độ tuổi nó, đạt tới mức đỉnh điểm vào khoảng sáu tuổi Hợp chất Saponin thƣờng đƣợc cấu tạo từ hai phần:  Phần đƣờng : glycol, phổ biến D-glucose, D-galactose, L-arabinose, acid galactunoic, acid D-glucuronic  Phần phi đƣờng : aglycol ( gọi Sapogenin), phần định hoạt tính hợp chất Saponin Phần aglycol Saponin có nhân sâm đƣợc chia thành ba loại: protopanaxadiol, protopanaxatriol oleanane Trong đó, protopanaxadiol protopanaxatriol Saponin triterpenoid tetracyclic có cấu trúc dammarane, oleanane Saponin 16 triterpenoide pentacylic Những hoạt tính sinh học đặc biệt nhân sâm Saponin có cấu trúc dammarane mang lại Cấu trúc Saponin có aglycon protopanaxadiol đƣợc minh họa hình 1.2, 1.3, 1.4 bảng 1.2, 1.3, 1.4 21 R2O OH 20S 12 19 10 15 27 17 11 18 13 14 30 A R1O 29 28 Hình 1.2 Cấu trúc Saponin có aglycon protopanaxadiol Bảng 1.2 Các Saponin có aglycon protopanaxadiol R1=R2=H: 20(S)-protopanaxadiol Tên Ginsenosid-Rb1 R1 G1c2-G1c R2 G1c6-G1c Ginsenosid-Rb2 Ginsenosid-Rb3 G1c2-G1c G1c2-G1c Glc6-Ara(p) Glc6-Xyl Ginsenosid-Rc Ginsenosid-Rd G1c2-G1c G1c2-G1c Glc6-Ara(f) Glc Ginsenosid Rh1 Glc2-Rha glc = glucose; ara(p) = arabinose dạng pyranose; ara(f)= arabinose dạng furanose; 17 Glc 21 R2O OH 20S 12 19 15 14 10 27 17 11 18 13 30 B HO 29 28 OR1 Hình 1.3 Cấu trúc Saponin có aglycon protopanaxatriol Bảng 1.3 Các Saponin có aglycon protopanaxatriol R1=R2=H: 20(S)-protopanaxatriol Tên R1 R2 Ginsenosid-Re Glc2-Rha G1c Ginsenosid-Rf G1c -G1c H Ginsenosid Rgl Ginsenosid-Rh1 Glc G1c Glc H Ginsenosid-Rg1 G1c2-G1c Glc6-Xyl rha = rhamnose; Hình 1.4 Saponin với aglycon acid oleanolic Bảng 1.4 Saponin với aglycon acid oleanolic Tên R1 18 R2 Ginsenosid R0 Glc A2- Glc G1c glc = glucose; 1.1.4 Công thức cấu tạo tính chất vật lý ginsenosid Rg1 Rb1 a Công thức cấu tạo ginsenosid Rb1 Chất có tên theo IUPAC: (3β,12β)-20-{[6-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D- glucopyranosyl]oxy}-12-hydroxydammar-24-en-3-yl 2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D- glucopyranoside Cấu tạo chi tiết đƣợc biểu diễn hình 1.5 Hình 1.5 Công thức cấu tạo ginsenosid Rb1 - Công thức phân tử: C54H92O23 - Khối lƣợng phân tử: 1109,295g/mol - Nhiệt độ nóng cháy 197 ~ 1980C - Độ tan: Dễ tan nƣớc (H2O), MeOH (MeOH), alcohol, pyridine, dimethyl sulfoxide (DMSO), không tan diethyl ether benzen b Công thức cấu tạo ginsenosid Rg1 Chất có tên theo IUPAC: (3β,6α,12β)-20-(β-D-Glucopyranosyloxy)-3,12dihydroxydammar-24-en-6-yl β-D-glucopyranoside Công thức cấu tạo đƣợc biểu diễn chi tiết hình 1.6 19 Hình 1.6 Công thức cấu tạo ginsenosid Rg1 - Công thức: C42H72O14 - M: 801,013 g/mol - Nhiệt độ nóng chảy 194 ~ 1960C - Độ tan: Dễ tan nƣớc (H2O), methanol (MeOH), pyridime Ít tan ethyl acetat, cloroform Không tan diethyl benzen 1.2 Tổng quan phƣơng pháp phân tích ginsenosid Ginsenosid đối tƣợng phân tích có thành phần phức tạp Thông thƣờng, ginsenosid chất, hỗn hợp chất có tính chất khác nhau, mà thƣờng chứa nhóm chất có tính chất tƣơng đối giống Các chất nhóm chất giống khung bản, khác vài nhóm thành phần khác, tức khác không nhiều tính chất vật lý, tính chất hoá học Chính vậy, việc sử dụng phƣơng pháp quang phổ (UV-VIS, IR, huỳnh quang,…) để phân tích định lƣợng thành phần dƣợc liệu gặp nhiều khó khăn hầu nhƣ thực đƣợc Sắc ký phƣơng pháp xác định hàm lƣợng chất thông dụng phân tích đại Khác với phép định lƣợng hoá học, phƣơng pháp sắc ký cho phép định lƣợng riêng chất cụ thể hỗn hợp, phù hợp với trình phân tích mẫu dƣợc liệu Ngƣời ta định lƣợng chất hay định lƣợng đồng thời nhiều chất lần định lƣợng chọn đƣợc điều kiện thích hợp Các phƣơng pháp sắc ký thƣờng dùng là: sắc ký khí (GC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký điện di mao quản, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), sắc kí mỏng hiệu cao 20 (HPTLC) Trong đó, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sắc ký mỏng hiệu cao (HPTLC) phƣơng pháp có nhiều ứng dụng nghiên cứu hợp chất tự nhiên nói chung nghiên cứu dƣợc liệu nói riêng Ƣu điểm lớn phƣơng pháp phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, nên khả phân tích rộng nhiều so với sắc ký khí (thƣờng dùng với đối tƣợng dễ bay hơi) Với pha tĩnh ngày đƣợc hoàn thiện đổi để nâng cao hiệu tách, detector ngày nhạy, ngày dễ dàng phân tích chất hỗn hợp mức ppm tới ppb, chí ppt để phân tích chất từ phân cực tới không phân cực, từ chất bay tới chất không bay hơi, từ chất trung tính tới chất điện ly,…Trong lĩnh vực dƣợc liệu, HPLC thƣờng đƣợc sử dụng định lƣợng riêng lẻ chất hỗn hợp phức tạp dịch chiết dƣợc liệu việc so sánh diện tích pic với chất chuẩn điều kiện phân tích Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao có nhiều tác giả sử dụng phƣơng pháp HPLC để phân tích ginsenosid Rg1 Rb1 dịch sinh học [17][30][34] Năm 1996, Trong nghiên cứu William A.Court cộng [17] nghiên cứu xác định đồng thời (Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Ro, Rg1) ginsenosids Panax quinquefolium phƣơng pháp sắc ký lỏng pha đảo RP-HPLC Thể tích bơm mẫu µl, cột Waters Symmetry C18 (150mm×3,9 mm, 5µm), tiền cột C18 tƣơng ứng Tốc độ dòng 1,15 ml/phút bƣớc sóng hấp thụ 203 nm Pha động dung dịch đệm phốt phát (A), dung dịch acetonitrile (dung dịch B) H2O (dung dịch C), Chƣơng trình gradient pha động nhƣ sau: 0-15 phút: 81%-79% A, 19% - 21% B; 15-24,5 phút: 79% - 73,7% A, 21% - 26,3% B; 24,5-29 phút: 73,7% - 73% A, 26,3% - 27% B; 29-43phút: 73% - 66% A, 27% - 34% B; 43-47 phút, 66 -64%A, 34-36%B; 47-54 phút : 54-57 %A, 36-43% B; 54-55 phút: 57-0%A, 43-85%B, 0-15%C; 55-59 phút 85%B, 15%; 81%A, 19%B Cách 2: Nhóm tác giả sử dụng vòi phun tự động 1040A, detecter diode array, cột tách carbohydrate cartridge(250 x 4,6mm) cột bảo vệ loại Với bƣớc sóng thể tích bơm cột nhƣ Tốc độ dòng 1,5ml/phút Pha động dung dịch H2O (A) acetonitril (B) TÀI LIỆU THAM KHẢO A - Tiếng Việt 21 Trần Tử An (2010), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất Y học, Hà Nội Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y tế Việt Nam: Thông thƣ số 08/TT-BYT ngày 23/8/2004 “Hƣớng dẫn việc quản lý sản phẩm thực phẩm chức năng” Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Minh Cang, Nguyễn Ngọc Khôi Phạm Vinh Quang (2002), “Định tính định lƣợng Ginsenosid chế phẩm viên nang mềm chứa nhân sâm thị trƣờng thuốc việt nam”, Y học thành phố Hồ Chí Minh, 1(6) Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuân Trung, Nguyễn Văn Ri (2003), Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Hà Nội Võ Thị Bạch Huệ (2007), Hóa Phân Tích, Nhà xuất giáo dục Nguyễn Chu Huy, Trịnh Nam Trung, Vũ Bình Dƣơng, Nguyễn Văn Bạch, Đào Văn Đôn (2014), “Nghiên cứu định lƣợng đồng thời ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd viên nang ukata sắc ký lỏng hiệu cao”, Tạp chí y - dược học quân sự, (1) Phạm Luận (2000), Giáo trình Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQGHN Phạm Luận (2010), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao, khoa Hóa học, Trƣờng ĐHKHTN Hà Nội 10 Dƣơng Tấn Nhựt, Lâm Thị Mỹ Hằng, Bùi Thế Vinh, Phan Quốc Tâm, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Hoàng Xuân Chiến, Lê Nữ Minh Thùy, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Văn Bình, Vũ Quốc Luận, Trần Công Luận,và Đoàn Trọng Đức (2010), “Xác định hàm lƣợng saponin dƣ lƣợng số chất điều hòa sinh trƣởng callus, chồi rễ sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(2), tr,189-202 11 Lã Đình Mỡi, Châu Văn Minh, Trần Văn Sung, Phạm Quốc Long, Phan Văn Kiệm, Trần Huy Thái, Trần Minh Hợi, Ninh Khắc Bản, Lê Mai Hƣơng "Họ nhân sâm (Araliaceae juss) nguồn hoạt chất sinh học đa dạng đầy triển vọng Việt Nam", Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 22 12 Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học & vi sinh vật, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật 13 Trần Quang Trung, Phan Thị Thu Hằng, Nguyễn Văn Bạch (2013), “Xác định hàm lƣợng Ginsenosid Rb1, Re, Rg1 sâm ngọc linh tự nhiên sinh khối tế bào sâm ngọc linh phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao HPTLC”, Tạp chí Y dược học quân sự, (9) 14 Trần Quang Trung, Trịnh Văn Lầu, Nguyễn Văn Bạch (2013), “ Định lƣợng Ginsenosid Rb1, Re, Rg1 phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao”, Tạp chí Y dược học quân sự, (1) B - Tài liệu tiếng nƣớc 15 Bonfill M, Casals I, Palazón J, Mallol A and Morales C (2002), "Improved high performance liquid chromatographic determination of Ginsenosid in Panax ginseng based pharmaceuticals using a diol column", Biomedical Chromatography, 16, pp 68-72 16 Chen W, Dang Y, Zhu C (2010), “Simultaneous determination of three major bioactive saponins of Panax notoginseng using liquid chromatography-tandem mass spectrometry and a pharmacokinetic study”, Chinese Medicine 17 Court WA, Hendel HG, and Elmi J (1996), “Reversed-phase high-performance liquid chromatographic determination of Ginsenosid of Panax quinquefolium”, Journal of Chromatography A, 755, pp 11-17 18 Fuzzati N (2004), “Analysis methods of Ginsenosid”, Journal of Chromatography B, 812, pp.119-133 19 Guan J, Lai CM and Li SP (2007), “A rapid method for the simultaneous determination of 11 saponins in Panax notoginseng using ultra performance liquid chromatography”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 44, pp 996-1000 20 Jing B (2013), “Simultaneous determination of four active components in Shengmai injection and its application to the quality control in productive process”, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 5(12), pp 971-974 23 21 Kim IW, Hong HD, Choi SY, Hwang DH, Her Y, and Kim SK (2011), “Characterizing a Full Spectrum of Physico-Chemical Properties of Ginsenosid Rb1 and Rg1 to Be Proposed as Standard Reference Materials”, Journal of ginseng research, 35(4), pp 487-496 22 Kim SN, Ha YM, Shin H, Son SH, Wu SJ, Kim YS (2007), “Simultaneous quantification of 14 Ginsenosid in Panax ginseng C.A.Meyer (Korean red ginseng) by HPLC-ELSD and its application to quality control”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45, pp 164-170 23 Lai CM, Li SP ,Yu H,Wan JB, Kan KW and Wang YT (2006), “A rapid HPLC–ESIMS/MS for qualitative and quantitative analysis of saponins in “XUESETONG” injection”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 40, pp 669-678 24 Laua AJ, Woob SO, Koha HL (2003), “Analysis of saponins in raw and steamed Panax notoginseng using high-performance liquid chromatography with diode array detection”, Journal of Chromatography A, 1011, pp.77-87 25 Leung KW and Alice Wong AST(2010), "Pharmacology of Ginsenosid: a literature review", Chinese Medicine, pp 5-20 26 Li L, Zhang JL, Sheng YX, Ye G, Guo HZ, Guo DA (2004), “Liquid chromatographic method for determination of four active saponins from Panax notoginseng in rat urine using solid-phase extraction”, Journal of Choromatongraphy B, 808, pp 177-183 27 Liu S, Cui M, Liu Z, and Song F (2004), “Structural Analysis of Saponins from Medicinal Herbs Using Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry”, Journal of the American Society for Mass Spectrometry,15(2), pp 133- 141 28 Park SJ, Lim KH, Noh JH, Jeong EJ, Kim YS , Han BC, Lee SH, Moon KS (2013), “Subacute Oral Toxicity Study of Korean Red Ginseng Extract in Sprague-Dawley Rats”, Toxicological Research, 29(4), pp 285- 292 29 Shi W, Wang Y, Li J, Zhang H, Ding L (2006), “Investigation of ginsenosides in different parts and ages of Panax ginseng”, Food Chemistry, 102 (2007), pp 664668 24 30 Shin Y, Sun C, Zheng Bo, Li Y, Wang Y (2010), “Simultaneous determination of nine Ginsenosid in functional foods by high performance liquid chromatography with array detector detection”, Food Chemistry, 123, pp 1322-1327 31 Steinmann D, Ganzera M (2011), “Recent advances on HPLC/MS in medicinal plant analysis”Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 55, pp 744-757 32 Vanhaelen-Fastré RJ, Faes ML and Vanhaelen MH (2000), “High-performance thinlayer chromatographic determination of six major Ginsenosid in Panax ginseng”, Journal of Chromatography A, 868, pp 269-276 33 Wan JB, Lai CM, Li SP, Lee YM , Kong LY , Wang YT (2005), “Simultaneous determination of nine saponins from Panax notoginseng using HPLC and pressurized liquid extraction”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41, pp 274–279 34 Wang J, Qiao L, Li S and Yang G (2013), “Protective Effect of Ginsenosid Rb1 Against Lung Injury Induced by Intestinal Ischemia-Reperfusion in Rats”, Molecules 2013, 18, pp 1214-1226, 35 Yi JH, Kim MY, Kim YC, Jeong WS, Bae DW, Hur JM and Jun M (2010), “Change of Ginsenosid Composition in Red Ginseng Processed with Citric Acid”, Food Sci, Biotechnol, 19(3), pp 647-654 25 26 ... Nghiên cứu phƣơng pháp xác định số 11 ginsenosid thực phẩm chức chứa nhân sâm (Panax Ginseng) Mục tiêu nghiên cứu:  Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời hai ginsenosid (Rg1 Rb1) kỹ thuật... Thẩm định phƣơng pháp đã xây dựng theo tiêu chí giới  Áp dụng triển khai phân tích số mẫu thực phẩm chức chứa nhân sâm thị trƣờng Hà Nội 12 CHƢƠNG – TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nhân sâm hoạt chất nhân. .. hoạt chất nhân sâm 1.1.1 Giới thiệu chung nhân sâm Bộ phận thƣờng sử dụng rễ củ đƣợc phơi hay sấy khô Nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Họ Nhân sâm (Araliaceae Juss.)