Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch chiết rong sargassum mcclurei thu hoạch tại vùng biển khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE CỦA RONG SARGASSUM MCCLUREI THU HOẠCH TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thế Hân Sinh viên thực hiện: Trần Thúy Hiền Mã số sinh viên: 57132476 Khánh Hòa - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE CỦA RONG SARGASSUM MCCLUREI THU HOẠCH TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA GVHD: TS Nguyễn Thế Hân SVTH: Trần Thúy Hiền MSSV: 57132476 Khánh Hòa – 7/2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan là công trình nghiên cứu của riêng của Các số liệu, kết quả nêu luận văn là trung thực và chưa từng được công bố bất kì công trình nào khác Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc Sinh viên Trần Thúy Hiền i LỜI CẢM ƠN Trong gần bốn tháng nghiên cứu phịng thí nghiệm của khoa Cơng nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nha Trang, em đã hoàn thành được đề tài tớt nghiệp của Để đạt được kết quả hôm nay, bên cạnh sự nỗ lực của bản thân sự giúp đỡ tận tình từ gia đình, thầy cô bạn bè Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm, quý thầy cô khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình, hết lòng quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt nhất cho em thực hiện nghiên cứu hồn thành khóa ḷn tớt nghiệp Em xin cảm ơn Trung tâm thông tin – thư viện, Đại Học Nha Trang đã cung cấp cho em tài liệu rất cần thiết bổ ích q trình thực hiện khóa ḷn Đặc biệt, em xin gửi đến người thầy mà em vơ kính mến và ngưỡng mộ TS Nguyễn Thế Hân – người trực tiếp hướng dẫn em suốt thời gian thực hiện đề tài Thầy không là người hướng dẫn cho em thực hiện đề tài khóa ḷn, thầy cịn hình mẫu để em tin rằng sớng vẫn có người dù cơng việc rất bận rộn ln sẵn sàng giúp đỡ người khác khơng bất cứ lý Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình, người thân bạn bè, người đã bên cổ vũ, động viên tạo mọi điều kiện giúp đỡ em thời gian học tập thực hiện đề tài khóa luận Em đã cố gắng nỗ lực để hoàn thành đồ án, nhiên khơng thể tránh khỏi sai sót q trình thực hiện Em hi vọng nhận được góp ý của thầy cô, bạn bè để đồ án được hoàn chỉnh nhất Em xin chân thành cảm ơn Nha Trang, ngày tháng Sinh viên Trần Thúy Hiền ii năm 2019 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vi DANH MỤC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ix LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về bệnh Alzheimer và rong biển 1.1.1 Bệnh Alzheimer 1.1.2 Giới thiệu acetylcholin, emzyme acetylcholinesterase vai trị của hệ cholinergic đới với bệnh Alzheimer 1.1.2.1 Acetylcholin .8 1.1.2.2 Enzyme acetylcholinesterase 1.1.2.3 Giả thuyết cholinergic 10 1.1.3 Giới thiệu về nguyên liệu rong biển 11 1.1.3.1 Thành phần hóa học của rong nâu 11 1.1.3.2 Sử dụng rong nâu các lĩnh vực khác 12 1.1.3.3 Giới thiệu về rong Sargassum mcclurei 13 1.2 Cơ sở lý thuyết 15 1.2.1 Một số phương pháp thường dùng nghiên cứu ức chế enzyme acetylcholinesterase in vitro 15 1.2.1.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman 15 1.2.2.2 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B 17 1.2.2 Kiểu ức chế enzyme acetylcholinesterase của chất ức chế 18 iii 1.2.3 Giới thiệu về quá trình chiết .20 1.2.3.1 Cơ sở của quá trình chiết 20 1.2.3.2 Các ́u tớ ảnh hưởng đến q trình chiết 21 1.2.3.3 Một số phương pháp chiết truyền thống 24 1.2.3.4 Một số phương pháp tách chiết có hỗ trợ công nghệ .25 1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu và ngoài nước có liên quan đến lĩnh vực nghiên cứu của đề tài .26 1.3.1 Trong nước .26 1.3.2 Ngoài nước .27 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Đối tượng nghiên cứu .30 2.1.1 Nguyên liệu rong Sargassum mcclurei 30 2.1.2 Hóa chất và th́c thử .31 2.2 Thiết bị 31 2.3 Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm 31 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .31 2.3.2 Bớ trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase của rong Sargassum mcclurei 34 2.3.2.1 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nờng độ dung mơi chiết 35 2.3.2.2 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 36 2.3.2.3 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 37 2.3.2.4 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết 39 2.3.3 Bớ trí thí nghiệm tách và đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các phân đoạn dịch chiết 41 2.4 Phương pháp phân tích .42 2.4.1 Xác định thành phần hóa học bản của rong .42 iv 2.4.1.1 Xác định hàm ẩm 42 2.4.1.2 Xác định tro 43 2.4.1.3 Xác định hàm lượng lipid 43 2.4.2 Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase 43 2.4.3 Đánh giá kiểu ức chế enzyme acetylcholinesterase 46 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 47 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 Định tính và định lượng số thành phần của rong Sargassum mcclurei 48 3.1.1 Định lượng sớ thành phần hóa học 48 3.1.2 Định tính sớ hợp chất 49 3.2 Ảnh hưởng của điều kiện chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase của rong Sargassum mcclurei 50 3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết 50 3.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu .53 3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 56 3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết 58 3.2.5 Khả ức chế enzyme acetylcholinesterase của rong Sargassum mcclurei điều kiện chiết thích hợp 60 3.3 Hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của phân đoạn dịch chiết từ rong Sargassum mcclurei .61 3.4 Kiểu ức chế enzyme acetylcholinesterase của phân đoạn ethyl acetate 65 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 4.1 Kết luận 68 4.2 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC 82 v DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỜ THỊ Hình 1.1 Sơ đờ q trình sinh tổng hợp acetylcholin Hình 1.2 Quá trình phản ứng diễn phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman 16 Hình 1.3 Kiểu ức chế enzyme cạnh tranh 18 Hình 1.4 Kiểu ức chế enzyme khơng cạnh tranh 19 Hình 1.5 Kiểu ức chế enzyme hỗn hợp 20 Hình 2.1 Rong Sargassum mcclurei .30 Hình 2.2 Sơ đờ bớ trí thí nghiệm tổng qt 32 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát xác định điều kiện chiết thích hợp cho hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase .34 Hình 2.4 Sơ đờ bớ trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase của rong Sargassum mcclurei 35 Hình 2.5 Sơ đờ bớ trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase của rong Sargassum mcclurei 37 Hình 2.6 Sơ đờ bớ trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase của rong Sargassum mcclurei 38 Hình 2.7 Sơ đờ bớ trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase của rong Sargassum mcclurei 40 Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tách các phân đoạn qua loại dung môi có độ phân cực khác và đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của phân đoạn 42 Hình 2.9 Quy trình thực hiện các mẫu thử đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase .46 Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase của rong Sargassum mcclurei 53 vi Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (NL/DM) chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase của rong Sargassum mcclurei 55 Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase của rong Sargassum mcclurei 56 Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase của rong Sargassum mcclurei 58 Hình 3.5 Khả ức chế enzyme acetylcholinesterase của rong Sargassum mcclurei điều kiện chiết thích hợp 60 Hình 3.6 Khả ức chế enzyme acetylcholinesterase các nồng độ khác của các phân đoạn dung môi chiết từ rong Sargassum mcculrei 63 Hình 3.7 Kiểu ức chế enzyme acetylcholinesterase củas phân đoạn dịch chiết ethyl acetate từ rong Sargassum mcclurei 66 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hàm lượng số nhóm chất chính rong Sargassum mcclurei 48 Bảng 3.2 Định tính số nhóm chất rong Sargassum mcclurei .50 Bảng 3.3 Hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của số loài rong biển 61 Bảng 3.4 Hiệu suất chiết và hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các phân đoạn dung môi chiết từ rong Sargassum mcclurei 64 viii 115 Tang, Z M., Wang, Z Y., & Kang, J W (2007) Screening of acetylcholinesterase inhibitors in natural extracts by CE with electrophoretically mediated microanalysis technique Electrophoresis, 28 (3), 360-365 116 Topuz, O K., Gokoglu, N., Yerlikaya, P., Ucak, I., & Gumus, B (2016) Optimization of antioxidant activity and phenolic compound extraction conditions from red seaweed (Laurencia obtuse) Journal of Aquatic Food Product Technology, 25 (3), 414-422 117 Trigui, M., Gasmi, L., Zouari, I., & Tounsi, S (2013) Seasonal variation in phenolic composition, antibacterial and antioxidant activities of Ulva rigida (Chlorophyta) and assessment of antiacetylcholinesterase potential Journal of applied phycology, 25 (1), 319-328 118 Tyrrell, H J V (1964) The origin and present status of Fick's diffusion law Journal of chemical education, 41 (7), 397 119 Van Asperen, K (1962) A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method Journal of insect physiology, (4), 401-416 120 Wang, J., Sun, B., Cao, Y., Tian, Y., & Li, X (2008) Optimisation of ultrasoundassisted extraction of phenolic compounds from wheat bran Food Chemistry, 106 (2), 804-810 121 Watson, S B., & Cruz-Rivera, E (2003) Algal chemical ecology: an introduction to the special issue Phycologia, 42 (4), 319-323 122 Wells, M J (2003), “Principles of extraction and the extraction of semivolatile organics from liquids”, Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry, 37-138 123 Whitehouse, P J., Price, D L., Struble, R G., Clark, A W., Coyle, J T., & Delon, M R (1982) Alzheimer's disease and senile dementia: loss of neurons in the basal forebrain Science, 215 (4537), 1237-1239 124 Wong, B Y., Tan, C P., & Ho, C W (2013) Effect of solid-to-solvent ratio on phenolic content and antioxidant capacities of" Dukung Anak"(Phyllanthus niruri) International Food Research Journal, 20 (1) 125 Yadav, M., Chatterji, S., Gupta, S K., & Watal, G (2014) Preliminary phytochemical screening of six medicinal plants used in traditional medicine Int J Pharm Pharm Sci, (5), 539-542 80 126 Yang, Z., Zhang, X., Duan, D., Song, Z., Yang, M., & Li, S (2009) Modified TLC bioautographic method for screening acetylcholinesterase inhibitors from plant extracts Journal of separation science, 32 (18), 3257-3259 127 Yoon, N Y., Chung, H Y., Kim, H R., & Choi, J E (2008) Acetyl-and butyrylcholinesterase inhibitory activities of sterols and phlorotannins from Ecklonia stolonifera Fisheries Science, 74 (1), 200 128 Yoon, N Y., Lee, S H., & Kim, S K (2009) Phlorotannins from Ishige okamurae and their acetyl-and butyrylcholinesterase inhibitory effects Journal of Functional Foods, (4), 331-335 129 Zhang, S Q., Bi, H M., & Liu, C J (2007) Extraction of bio-active components from Rhodiola sachalinensis under ultrahigh hydrostatic pressure Separation and Purification Technology, 57 (2), 277-282 81 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Xác định hàm ẩm phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050C theo TCVN 3700 – 1990 Nguyên lý: Dùng nhiệt độ cao làm bay nước mẫu, sau đó dựa vào hiệu số khối lượng mẫu trước và sau sấy để tính hàm lượng nước thực phẩm Cách tiến hành:  Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Cốc được rửa sạch, úp khô, sấy nhiệt độ 1050C khoảng giờ, lấy làm nguội bình hút ẩm rời cân, sau đó sấy tiếp nhiệt độ trên, lấy làm nguội bình hút ẩm rời đem cân và sấy đến khối lượng hai lần liên tiếp sai khác không 5.10-4 g là được (khối lượng khơng đổi)  Cân xác khoảng g rong cho vào cốc đã sấy đến khối lượng không đổi Đánh tơi mẫu bằng đũa thủy tinh, dàn đều mẫu đáy cốc Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy nhiệt độ 600C Sau đó, nâng nhiệt độ lên 1050C, sấy liên tục Chú ý trình sấy cứ sau đảo mẫu lần Lấy mẫu để nguội bình hút ẩm rời cân cân phân tích, sau đó sấy tiếp đến khối lượng không đổi Độ ẩm được tính theo công thức sau: W=(G1-G2)/(G1-G)*100(%) Trong đó: G: Khới lượng cớc sau sấy đến khới lượng đổi (g) G1: Khối lượng cốc mẫu trước sấy (g) G2: Khối lượng cốc mẫu sau sấy đến khối lượng không đổi (g) W: Độ ẩm của nguyên liệu (%) Kết xác định độ ẩm nguyên liệu Số lần lặp Khối lượng cốc (G) Khối lượng cốc + mẫu trước sấy (G1) Khối lượng cốc + mẫu sau sấy (G2) Độ ẩm (W%) 36,4723 39,4784 38,9506 17,56% 35,2868 38,2936 37,7859 16,89% 82 Trung bình 17,22 ± 0,0047% Phụ lục 2: Xác định hàm lượng tro theo TCVN 5105 – 1990 Nguyên lý: Cách tiến hành:  Nung chén sứ đã rửa lò nung 550 – 6000C đến lượng khơng đổi Để nguội bình hút ẩm cân cân cân phân tích, khối lượng hai lần liên tiếp sai khác không 5.10-4 g là được (khối lượng không đổi)  Cho vào chén sứ khoảng 3g mẫu thử Cân tất cả phân tích với độ xác Cho tất cả vào lò nung nâng nhiệt độ từ 550 – 6000C  Nung cho đến tro trắng, nghĩa là đã loại hết chất hữu cơ, thường khoảng Trường hợp còn tro đen, lấy để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 HNO3 đậm đặc nung lại đến tro trắng  Để nguội bình hút ẩm và cân đến độ chính xác Tiếp tục nung thêm nhiệt độ 30 phút rời để nguội bình hút ẩm và cân cho đến lượng khơng đổi Tính tốn kết quả: Hàm lượng tro theo % được tính theo cơng thức X = (G2 - G)/(G1 - G)*100(%) Trong G: trọng lượng chén (g) G1: lượng chén mẫu trước nung (g) G2: lượng chén mẫu sau nung (g) Kết xác định tro nguyên liệu Số lần lặp Khối lượng cốc nung (G) Khối lượng cốc + mẫu trước sấy (G1) Khối lượng cốc + mẫu sau sấy (G2) Tro (X%) 36,4724 39,4784 38,7106 5,54 35,2913 38,2936 37,3959 9,90 83 Trung bình 27,72 ± 0.031% Phụ lục 3: Xác định hàm lượng lipid có rong nguyên liệu phương pháp Folch Mục đích: Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng chất béo của các sản phẩm rắn và lỏng Nguyên lý: Dùng hỗn hợp dung mơi Chloroform:methanol với tỉ lệ 2:1 để hịa tan tất cả chất béo mẫu, tách lớp chiết qua phểu lọc nhiều lần Sau làm bay hết dung mơi, cân chất béo cịn lại và tính hàm lượng lipid 100 gam mẫu Cách tiến hành:  Chuẩn bị mẫu Cân m gam rong đã được nghiền nhỏ cho vào cớc - Cho thêm 600 µl nước cất, 5ml methanol Ngâm mẫu dung môi khoảng 10 phút - Đờng hóa mẫu bằng máy phút - Lọc, lấy dịch lọc - Cho thêm 5ml methanol 10ml Chloroform vào cớc và đờng hóa 20 giây - Lọc, lấy dịch lọc cho vào phểu chiết - Cho thêm 7,5ml NaCl 0,9% vào dung dịch mẫu Đảo trộn ngược phểu nhiều lần giữ mẫu 50C khoảng 4h để dịch mẫu phân chia thành lớp  - Chiết rút dung dịch lipid Tách lớp (chứa hàm lượng lipid hòa tan dung môi) cho chảy vào phểu chiết 250ml Loại bỏ lớp phía (chứa phần hóa hợp gờm tạp chất được loại nước, muối, protein,…) - Xác định thể tích chiết (Vdm) - Cho thêm 5ml CH3OH 50% vào mẫu phểu chiết Đảo trộn ngược phểu chiết nhiều lần - Cho phân chia thành hai lớp lắng qua đêm 50C  Định lượng lipid - Lớp được chiết rút chảy x́ng nình cầu cô quay - Cô quay chân không làm bay dung môi bình cầu 370C đến cịn lại thể tích khoảng 1ml 84 - Hịa tan mẫu lại lập tức bằng lượng thể tích nhỏ Chloroform (chỉ cho phép tiếp xúc rất nhỏ lượng mẫu đã làm khơ với khơng khí) - Chuyển qua bình định mức 5ml, tráng rửa bình cầu nhiều lần và định mức bằng Chloroform vừa đủ 5ml - Sau xử lý xong, dung dịch được mang xác định hàm lượng lipid tổng  - Xác định hàm lượng lipid tởng Lấy xác 2ml (Vm) dung dịch mẫu đã xử lý, cho vào cốc đã được sấy cân đến khối lượng không đổi - Cho vào tủ sấy đén khối lượng không đổi Lipid tổng số (%) tính theo cơng thức: %X(g⁄g) = (m1 − m0 ) ∗ Vdm ∗ 100 m ∗ T ∗ Vm Trong đó: X: hàm lượng lipid tổng sớ tính theo trọng lượng khô của mẫu m1: trọng lượng cốc mẫu sau sấy đến khối lượng không đổi (g) m0: trọng lượng cốc sấy đến khối lượng không đổi (g) m: trọng lượng cân mẫu (g) Vdm: thể tích định mức sau xử lý (ml) Vm: thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (ml) T: thành phần khô của mẫu, T=(100-W)/100 Kết xác định lipid nguyên liệu Số lần lặp Khối lượng cốc sấy (m0) Khối lượng cốc và mẫu sau sấy (m1) Trọng lượng mẫu (m) Vdm (ml) 38,708 38,711 0,52 37,389 37,391 0,39 Trung bình 0,45 ± 0.09% Phụ lục 4: Định tính số hợp chất Cân 5g rong khô nguyên liệu đem chiết điều kiện chiết thích hợp Quá trình chiết được thực hiện bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany) Sau 85 kết thúc trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 Dịch chiết được cô quay chân không nhiệt độ ≤40°C để loại hết dung môi chiết tới 10ml Hút 0,1ml dịch chiết được hòa tan 10ml nước cất Tiến hành định tính sớ hợp chất thiên nhiên cao chiết methanol từ mẫu rong nghuyên liệu theo phương pháp của Yadav cộng sự (2014) [51] Phát hợp chất phenolic: Phản ứng với folin 10% Dung dịch có màu xanh Phát hợp chất flavonoid: Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% quan sát dung dịch có màu hờng Phát hợp chất terpenoid: Phản ứng với dung dịch H2SO4 10% ethanol Tủa nâu đỏ Phát hợp chất carotenoid: H2SO4đđ Xanh lục Chỉ tiêu đánh giá: Quan sát hiện tượng màu sắc trước sau phản ứng để ghi nhận có khơng có hợp chất tự nhiên dịch chiết Phụ lục 5: Ảnh hưởng của nồng độ của dung môi chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase Nồng độ methanol (%) 25 50 75 100 Độ hấp thụ quang ở bước sóng 412nm Lần Blank Control Rong 3 3 0,075 0,068 0,069 0,053 0,058 0,055 0,049 0,049 0,048 0,052 0,051 0,054 0,036 0,039 0,039 0,609 0,592 0,598 0,615 0,608 0,596 0,627 0,607 0,576 0,618 0,598 0,599 0,611 0,601 0,609 0,519 0,514 0,517 0,449 0,433 0,431 0,381 0,375 0,365 0,353 0,361 0,332 0,387 0,395 0,361 86 Khả ức chế enzyme Trung bình AChE (%) 27,09 24,66 25,61 ± 1,30 25,08 34,96 35,85 ± 0,95 36,84 35,74 47,53 46,62 46,72 ± 0,77 46,01 51,29 48,16 51,01 ± 2,73 53,59 42,55 40,77 43,48 ± 1,26 47,13 Phụ lục 6: Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml) 1/10 1/20 1/30 1/40 Lần Blank Control Rong Khả ức chế enzyme AChE (%) 3 3 0,031 0,029 0,029 0,052 0,051 0,049 0,046 0,048 0,041 0,031 0,038 0,034 0,599 0,618 0,597 0,618 0,604 0,599 0,612 0,607 0,596 0,612 0,615 0,608 0,397 0,403 0,405 0,339 0,336 0,351 0,358 0,323 0,321 0,334 0,337 0,362 38,90 39,48 37,02 53,56 52,81 49,58 49,02 54,70 53,02 50,49 51,38 46,05 Độ hấp thụ quang ở bước sóng 412nm Trung bình 38,47 ± 1,29 51,99 ± 2,11 52,24 ± 2,92 49,31 ± 2,85 Phụ lục 7: Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase Nhiệt độ chiết (ºC) 30 45 60 75 90 Độ hấp thụ quang ở bước sóng 412nm Lần Blank Control Rong 3 3 0,022 0,023 0,019 0,029 0,030 0,032 0,052 0,049 0,053 0,045 0,047 0,050 0,025 0,028 0,024 0,602 0,592 0,606 0,615 0,598 0,601 0,611 0,604 0,604 0,615 0,605 0,604 0,611 0,615 0,604 0,379 0,366 0,365 0,367 0,342 0,363 0,339 0,345 0,337 0,366 0,344 0,362 0,385 0,377 0,352 87 Khả ức chế enzyme AChE (%) 40,70 42,06 42,90 45,04 47,83 44,93 53,03 50,99 52,98 47,80 50,91 48,34 41,08 43,25 45,70 % ức chế trung bình 41,89 ± 1,11 45,93 ± 1,64 52,33 ± 1,16 49,02 ± 1,66 43,34 ± 1,54 Phụ lục 8: Ảnh hưởng của thời gian chiết chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase Thời gian chiết (phút) 30 60 90 120 Độ hấp thụ quang ở bước sóng 412nm Lần Blank Control Rong 3 3 0,047 0,051 0,049 0,056 0,053 0,055 0,061 0,067 0,064 0,055 0,058 0,054 0,604 0,604 0,611 0,615 0,605 0,604 0,611 0,615 0,604 0,604 0,604 0,611 0,397 0,403 0,405 0,345 0,351 0,362 0,335 0,345 0,347 0,347 0,325 0,311 Khả ức chế enzyme AChE (%) 42,05 41,72 41,73 53,01 50,74 49,17 55,16 54,80 53,15 51,66 55,79 57,94 Trung bình 41,81 ± 0,19 50,97 ± 1,93 54,37 ± 1,07 55,13 ± 3,19 Phụ lục 9: Khả ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch chiết rong Sargassum mcclurei ở điều kiện chiết thích hợp Nồng độ (mg/mL) 0,5 1,0 2,5 5,0 7,5 10 Lần Blank Control Rong Khả ức chế enzyme AChE (%) 3 3 3 0,009 0,008 0,010 0,015 0,018 0,017 0,031 0,029 0,029 0,050 0,048 0,056 0,070 0,068 0,068 0,090 0,088 0,087 0,597 0,603 0,604 0,602 0,605 0,604 0,599 0,604 0,611 0,605 0,614 0,604 0,602 0,614 0,614 0,612 0,607 0,612 0,553 0,549 0,557 0,522 0,515 0,515 0,459 0,453 0,447 0,412 0,389 0,399 0,347 0,324 0,334 0,278 0,247 0,291 8,88 10,28 9,44 15,78 17,85 17,55 28,55 29,80 31,59 40,17 44,46 43,21 53,99 58,31 56,68 69,28 73,81 66,67 Độ hấp thụ quang ở bước sóng 412nm 88 Trung bình 9,532 ± 0,71 17,061 ± 1,12 29,979 ± 1,53 42,613 ± 2,21 56,323 ± 2,18 69,918 ± 3,61 Phụ lục 10: Hiệu suất chiết của các phân đoạn dung môi chiết từ rong Sargassum mcclurei Cách tiến hành:  Cân 10g rong S mcclurei chiết điều kiện thích hợp (methanol 75%, tỷ lệ NL/DM 1/20, nhiệt độ 60 ºC, thời gian 90 phút) Sau lọc, đem cô quay để bay hết dung môi methanol tới 20ml Phần dịch chiết này được hút 5ml để đánh giá khối lượng chất khô có dịch chiết  Cân 100g rong S mcclurei chiết điều kiện thích hợp (methanol 75%, tỷ lệ NL/DM 1/20, nhiệt độ 60 ºC, thời gian 90 phút) Sau lọc, đem cô quay để bay hết dung môi methanol tới khoảng 10g cặn dịch chiết Sau đó được hòa lại với 200ml nước cất, tiến hành tách phân đoạn Các phân đoạn thu được đem cô quay để bay hết dung môi đến khô Xác định khối lượng chất khô của phân đoạn Kết hiệu xuất chiết phân đoạn Phân đoạn n-Hexan Ethyl acetate n-Butanol Nước Tổng Khối lượng chất khô (g) 0,852 0,771 1,211 4,021 6,855 Hiệu suất (%) 12,43 11,25 17,67 58,66 100 Phụ lục 12: Khả ức chế enzyme acetylcholinesterase của các phân đoạn dung môi chiết từ rong Sargassum mcclurei 89 Phân đoạn n-hexane Độ hấp thụ quang ở bước sóng 412nm Nồng độ (mg/mL) 0.5 1,0 Lần Blank Control Rong Khả ức chế enzyme AChE (%) 3 3 0,007 0,007 0,006 0,017 0,017 0,018 0,037 0,036 0,034 0,048 0,05 0,05 0,059 0,059 0,058 0,59 0,607 0,601 0,602 0,602 0,603 0,611 0,609 0,605 0,591 0,607 0,605 0,611 0,609 0,605 0,578 0,593 0,589 0,578 0,584 0,583 0,567 0,568 0,571 0,541 0,545 0,543 0,547 0,525 0,521 3,22 3,46 3,00 6,81 5,81 6,30 13,26 12,64 11,24 16,58 18,45 18,51 20,13 23,48 23,47 Trung bình 3,22 ± 0,23 6,31 ± 0,49 12,38 ± 1,03 17,85 ± 1,09 22,36 ± 1,93 Phân đoạn ethyl acetate Độ hấp thụ quang ở bước sóng 412nm Nồng độ (mg/mL) 0.5 1,0 Lần Blank Control Rong Khả ức chế enzyme AChE (%) 3 3 0,005 0,005 0,004 0,011 0,012 0,013 0,031 0,028 0,028 0,044 0,042 0,038 0,047 0,049 0,049 0,594 0,607 0,603 0,607 0,611 0,603 0,611 0,619 0,605 0,611 0,607 0,605 0,605 0,603 0,612 0,478 0,467 0,479 0,434 0,446 0,439 0,383 0,401 0,397 0,343 0,332 0,321 0,199 0,229 0,235 20,37 23,89 21,23 30,31 28,97 29,35 42,39 39,74 39,01 51,06 52,22 53,22 74,88 70,15 69,61 90 Trung bình 21,83 ± 1,83 29,55 ± 0,69 40,38 c 1,78 52,17 ± 1,08 71,54 ± 2,9 Phân đoạn n-butanol Độ hấp thụ quang ở bước sóng 412nm Nồng độ (mg/mL) 0.5 1,0 Lần Blank Control Rong Khả ức chế enzyme AChE (%) 3 3 0,011 0,009 0,011 0,018 0,016 0,018 0,027 0,028 0,028 0,036 0,035 0,036 0,045 0,044 0,047 0,609 0,588 0,591 0,607 0,587 0,593 0,603 0,598 0,599 0,596 0,604 0,607 0,611 0,609 0,616 0,542 0,525 0,535 0,518 0,497 0,503 0,455 0,431 0,452 0,395 0,396 0,388 0,317 0,321 0,336 12,81 12,24 11,34 17,63 18,06 18,21 29,02 32,61 29,22 39,77 40,23 42,01 55,48 54,52 53,08 Trung bình 12,13 ± 0,74 17,97 ± 0,3 30,28 ± 2,02 40,67 ± 1,18 54,36 ± 1,21 Phân đoạn nước Độ hấp thụ quang ở bước sóng 412nm Nồng độ (mg/mL) 0.5 1,0 Lần Blank Control Rong Khả ức chế enzyme AChE (%) 3 3 0,003 0,003 0,002 0,003 0,004 0,003 0,007 0,007 0,008 0,012 0,012 0,013 0,016 0,017 0,017 0,59 0,598 0,604 0,605 0,607 0,616 0,608 0,598 0,614 0,591 0,608 0,612 0,606 0,611 0,615 0,583 0,591 0,596 0,594 0,595 0,605 0,593 0,587 0,601 0,568 0,587 0,595 0,591 0,584 0,587 1,69 1,67 1,66 2,31 2,64 2,27 3,62 3,01 3,42 5,92 5,43 4,90 5,12 7,20 7,32 91 Trung bình 1,67 ± 0,02 2,41 ± 0,2 3,35 ± 0,31 5,42 ± 0,51 6,54 ± 1,24 Phụ lục 13: Kiểu ức chế enzyme AChE của phân đoạn ethyl acetate Mẫu khơng có chất ức chế Thời gian (phút) Nồng độ chất (mM) 1mM 2mM 3mM 4mM 5mM 10 13 14 15 v 1/v 1/[ACTI] 0,015 0,027 0,030 0,033 0,036 68,493 37,406 33,708 30,675 27,881 1,00 0,50 0,33 0,25 0,20 v 1/v 1/[ACTI] 0,006 0,010 0,011 0,015 0,016 161,290 103,450 91,460 67,870 61,980 1,00 0,50 0,33 0,25 0,20 Độ hấp thụ quang ở bước sóng 412nm 0,009 0,011 0,007 0,009 0,016 0,172 0,184 0,187 0,189 0,191 0,211 0,349 0,349 0,352 0,361 0,224 0,404 0,432 0,428 0,481 0,226 0,410 0,442 0,439 0,522 0,228 0,412 0,452 0,498 0,554 Mẫu có chất ức chế (Dịch chiết rong phân đoạn ethyl acetate 4mg/mL) Thời gian (phút) Nồng độ chất (mM) 1mM 2mM 3mM 4mM 5mM 10 13 14 15 Độ hấp thụ quang ở bước sóng 412nm 0,051 0,052 0,049 0,051 0,048 0,133 0,163 0,169 0,19 0,192 0,141 0,193 0,2 0,251 0,263 0,144 0,194 0,211 0,27 0,291 0,144 0,196 0,213 0,274 0,297 92 0,144 0,197 0,213 0,278 0,29 93 94 ... đoạn dịch chiết thích hợp để thu nhận dịch chiết có hoạt tính ức chế enzyme AChE từ loài rong nâu Đề tài ? ?Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase rong Sargassum mcclurei thu. .. vậy, hợp chất /dịch chiết ức chế enzyme theo số kiểu khác Việc nghiên cứu kiểu ức chế dịch chiết rong biển, để từ biết đặc điểm ức chế chất có dịch chiết cần thiết, làm sở điều chế hợp chất tương... cứu hoạt tính ức chế enzyme AChE dịch chiết rong Sargassum mcclurei, phương pháp đo quang sử dụng thu? ??c thử Ellman lựa chọn để áp dụng nghiên cứu đề tài khóa luận 1.2.2 Kiểu ức chế enzyme acetylcholinesterase