Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase từ loài rong đông( hypnea pannosa) ở khánh hòa và ứng dụng chống biến đen trên tôm thẻ chân trắng

3.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng ức chế enzym tyrosinase49 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng ức chế enzym tyrosinase51 3.4 Đánh giá khả năng ức chế enzyme tyros

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

_

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE TỪ LOÀI RONG

ĐÔNG (Hypnea pannosa) Ở KHÁNH HÒA VÀ ỨNG DỤNG CHỐNG BIẾN

ĐEN TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG

Giảng viên hướng dẫn: TS Khổng Trung Thắng

TS Nguyễn Thế Hân Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Tuyết Như

Mã số sinh viên: 57131391

Khánh Hòa-năm 2019

2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của chính bản thân Các số liệu, kết quả nghiên cứu trình bày trong đồ án hoàn toàn trung thực và chưa có một ai công bố trong bất kỳ nghiên cứu khoa học nào

Khánh Hòa , Ngày tháng năm 2019

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Tuyết Như

Tuy có nhiều nỗ lực và sự cố gắng nhưng với kiến thức còn hạn chế bài viết không tránh khỏi những sai sót Rất mong nhận được những lời góp ý của Quý Thầy

Cô để đồ án tốt nghiệp của em được hoàn thiện tốt nhất

Xin kính chúc Quý Thầy Cô trường Đại học Nha Trang lời chúc sức khỏe, thành công và thịnh vượng trong cuộc sống

Khánh Hòa, Ngày tháng năm 2019

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Tuyết Như

4

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN……… 2

LỜI CẢM ƠN……… 3

MỤC LỤC……… 4

DANH MỤC BẢNG……… 7

DANH MỤC HÌNH……… 8

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT………10

LỜI MỞ ĐẦU……… 11

Chương 1: TỔNG QUAN……… 14

1.1 Tổng quan về rong 14

1.1.1 Tổng quan về rong đỏ Hypnea pannosa 14

1.1.2 Phương pháp tách chiết 16

1.1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết 17

1.2 TỔNG QUAN VỀ TÔM 18

1.2.1 Tình hình nuôi trồng và xuất khẩu tôm 18

1.2.2 Tổng quan về tôm thẻ chân trắng 19

1.2.3 Biến đổi của tôm sau khi chết 20

1.3 Tổng quan về enzyme tyrosinase và hiện tượng biến đen ở tôm 22

1.3.1 Tyrosinase 22

1.3.2 Các chất ức chế tyrosinase có nguồn gốc từ thiên nhiên 23

1.3.3 Các chất ức chế có nguồn gốc tổng hợp 25

1.3.4 Hiện tượng biến đen ở tôm 25

1.3.5 Tình hình nghiên cứu về tyrosinase và sự biến đen của tôm 26

5

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU……… 32

2.1 Nguyên vật liệu 32

2.1.1 Nguyên liệu rong 32

2.1.2 Tôm thẻ chân trắng 32

2.1.3 Hóa chất thuốc thử 32

2.2 Bố trí thí nghiệm 32

2.2.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát 32

2.2.2 Thí nghiệm xác định thời gian chiết 34

2.2.3 Thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết 35

2.2.4 Tách phân đoạn qua các loại dung môi có độ phân cực khác nhau và đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase qua các phân đoạn 37

2.2.5 Thí nghiệm bảo quản tôm bằng dịch chiết từ rong đông (Hypnea pannosa) 38

2.2.6 Phương pháp phân tích 41

2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 42

2.2.8 Phương pháp đánh giá cảm quan 42

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN……… 44

3.1 Khảo sát khả năng ức chế enzyme tyrosinase của rong đông (Hypnea pannosa) Error! Bookmark not defined. 3.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng ức chế enzym tyrosinase49 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng ức chế enzym tyrosinase51 3.4 Đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase của dịch chiết rong đông của các phân đoạn 52

3.5 Thí nghiệm bảo quản tôm bằng dịch chiết rong đông kết hợp bảo quản lạnh… 55

6

3.6 Thí nghiệm bảo quản tôm bằng dịch chiết rong đông kết hợp bảo quản

lạnh………… 61

3.7 Xác định thành phần hóa học của rong đông hypnea pannosa 44

3.7.1 Định lượng thành phần hóa học của rong đông (hypnea pannosa) 44 3.7.2 Định tính nhóm chất hữu cơ trong rong đông (Hypnea Pannosa) 44

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 4.1 KẾT LUẬN: 65

4.2 KIẾN NGHỊ: 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 66

PHỤ LỤC……… 75

7

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase của mẫu rong đông (Hypnea pannosa)

ở các nồng độ khác nhau Các chữ cái khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống

kê (p<0,05) ……… ………55

Bảng 3.2: Bảng định lượng thành phần hóa học của của rong đông (Hypnea pannosa)……….……… 63 Bảng 3.3: Bảng định tính thành phần hóa học có trong rong đông (Hypnea pannosa)……… 64

8

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình ảnh rong đông (Hypnea pannosa) ……….16

Hình 1.2: Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)……… 19

Hình 1.3: Cơ chế của sự biến đen ở tôm ……… 27

Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ……… 34

Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các thời gian chiết khác nhau của rong đông đến khả năng ức chế enzyme tyrosinase ……….……… 36

Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các nhiệt độ chiết khác nhau của rong đông đến khả năng ức chế enzyme tyrosinase………37

Hình 2.4: Sơ đồ tách phân đoạn qua các dịch chiết khác……… ….39

Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm bảo quản tôm từ dịch chiết rong đông (Hypnea pannosa)………42

Hình 3.1: Khả năng ức chế của mẫu rong đông (Hypnea pannosa) đối với enzyme tyrosinase tại nồng độ 3,50 mg/ml ở các thời gian chiết khác nhau Các chữ cái khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05).……….47

Hình 3.2: Khả năng ức chế của mẫu rong đông (Hypnea pannosa) đối với enzyme tyrosinase tại nồng độ 3,50 mg/ml ở các nhiệt độ chiết khác nhau Các chữ cái khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05).……… 49

Hình 3.3: Phần trăm ức chế enzym tyrosinase ở các phân đoạn chiết của rong (Hypnea pannosa) Các chữ cái khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05) ……….… 51

Hình 3.4: Đồ thị biểu hiện điểm cảm quan biến đen theo thời gian bảo quản lạnh………54

Hình 3.5: Đồ thị biểu hiện điểm cảm quan chất lượng theo thời gian bảo quản lạnh……….……… 56

Hình 3.7: Hình ảnh tôm biến đổi qua các ngày bảo quản ở nhiệt độ lạnh……… ……….58

9

Hình 3.8: Đồ thị biểu hiện điểm cảm quan biến đen theo thời gian bảo quản nhiệt độ thường………… ……… 59 Hình 3.8: Đồ thị biểu hiện điểm cảm quan chất lượng theo thời gian bảo quản nhiệt

độ thường……… 60 Hình 3.9: Hình ảnh tôm biến đổi qua các ngày bảo quản nhiệt độ thường……… ……… 62 Hình 3.10: Hình ảnh kết quả định tính thành phần hóa học rong đông flavonoid, phenolic,carotenoid,terpenoid……….… 65

10

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT PPO : Polyphenol oxidase

CNTP: Công nghệ thực phẩm

NL/DM: Nguyên liệu/ dung môi

EtOAc: Ethyl acetate

PA: Poly Amid

DMSO: Dimethyl sunlfoxide

DM/DC: Dung môi/dịch chiết

NL/DC: Nguyên liệu/dịch chiết

BVM: Bauhinia Vahlii

11

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Rong biển là nhóm thực vật bậc thấp sống ở biển và vùng ven biển, chúng có vai trò rất quan trọng đối với sinh thái biển và đời sống của con người Ngoài giá trị về môi trường, sinh thái, rong biển còn có giá trị rất lớn đối với các hoạt động sống của con người như cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp chế biến (chiết xuất keo agar, alginat, carrageenan …), làm thực phẩm, thuốc chữa bệnh Mặt khác, do có sinh lượng lớn nên rong biển đã tạo ra nguồn vật chất hữu cơ khá lớn cho hệ sinh thái biển

Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Tú và cộng sự, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam đã nghiên cứu khảo sát sự phân bố và đa dạng thành

phần loài của chi rong Hypnea là một loài rong đỏ ở vùng nghiên cứu gồm các tỉnh

Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận và Bà Rịa - Vũng Tàu Kết quả nghiên cứu ghi

nhận được 9 loài thuộc chi Hypnea ở vùng nghiên cứu gồm loài: Hypnea cervicornis J.Agardh, Hypnea charoides J.V.Lamouroux, Hypnea cornuta (Ktzing) J.Agardh, Hypnea cenomyce J.Agardh, Hypnea esperi Bory de Saint-Vincent, Hypnea nidulans Setchell, Hypnea pannosa J.Agardh, Hypnea spinella (C.Agardh) Ktzing và Hypnea valentiae (Turner) Montagne So với các địa phương trong vùng nghiên cứu, tỉnh

Khánh Hòa có số lượng loài ghi nhận được cao nhất với 8/9 loài [74]

Tuy nhiên, ngoài một số loại rong đỏ được nghiên cứu và ứng dụng nhiều ra thì còn rất nhiều loài rong đỏ vẫn chưa được chú trọng nhiều trong việc nghiên cứu và

ứng dụng trong thực tiễn Trong đó, rong đỏ (Hypnea pannosa) là một loại rong đỏ đã

ghi nhận có ở vùng biển Khánh Hòa nhưng chưa được quan tâm nhiều Từ nhiều nghiên cứu cho thấy trong thành phần rong đỏ cung cấp một nguồn tuyệt vời các hợp chất hoạt tính sinh học chẳng hạn như carotenoid, chất xơ, protein, chất béo thiết yếu axit, vitamin và khoáng chất (Mabeau và cộng sự, 1993) [33]

Một số nghiên cứu trong và ngoài nước đã tập trung nghiên cứu vào các hoạt tính chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn, ức chế enzyme của một số chất có hoạt tính chống oxy hóa từ các loài rong đỏ Trong khi đó, nghiên cứu về khả năng ức chế

enzyme tyrosinase của rong đông (Hypnea pannosa) và ứng dụng dịch chiết rong đông

12

để hạn chế biến đen tôm vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào công bố Do đó,

đề tài này sẽ nghiên cứu hoạt tính chống biến đen tôm từ dịch chiết rong đông

Hiện nay, thủy sản là mặt hàng chiếm tỷ trọng lớn trong cơ cấu xuất khẩu của Việt Nam trong đó tôm là sản phẩm quan trọng mũi nhọn của ngành thủy sản Việt Nam và luôn chiếm phần lớn trong kim ngạch xuất khẩu thủy sản Trong chế biến, bảo quản tôm nguyên liệu là công đoạn rất quan trọng nhằm duy trì chất lượng ban đầu để đảm bảo chất lượng sản phẩm đầu ra Một trong những biến đổi thường gặp nhất ở tôm nguyên liệu sau khi thu hoạch là hiện tượng biến đen do sự hoạt động của enzyme tyrosinase

Tyrosinase (hay còn gọi là PPO) là enzyme đóng vai trò chính trong quá trình tổng hợp melanin Tác động của PPO là xúc tác quá trình oxy hóa phenol thành quinon tạo màu nâu trong mô tế bào bị tổn thương PPO cũng là nguyên nhân chính gây ra hiện tượng hóa nâu ở nhiều loại trái cây, rau củ và biến đen trên một số loại hải sản (chủ yếu là tôm) trong quá trình thu hoạch, bảo quản và chế biến Sự biến đen ảnh hưởng đến chất lượng và giảm giá trị cảm quan thực phẩm, làm giảm giá trị kinh tế của các mặt hàng trái cây, rau quả và hải sản Các hợp chất ức chế tyrosinase đã được sử dụng phổ biến để ngăn chặn sự biến đen của rau, quả và thủy sản nguyên liệu như: acid fumaric (Gou và cộng sự, 2017) [22], acid isophthalic (Si và cộng sự, 2011) [48], morin (Wang và cộng sự, 2014) [58] Tuy nhiên, việc tồn dư hóa chất sau quá trình bảo quản gây lo ngại cho người tiêu dùng Chính vì thế việc tìm kiếm các hợp chất ức chế có nguồn gốc tự nhiên để đảm bảo an toàn chất lượng cho sản phẩm hiện nay vẫn

là mối quan tâm của các ngành chế biến và bảo quản thực phẩm

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Đánh giá hoạt tính ức chế enzymes tyrosinase

từ loài Rong đông (Hypnea pannosa) ở Khánh Hòa và ứng dụng chống biến đen trên

tôm thẻ chân trắng” với mục tiêu là tìm ra khả năng ức chế enzyme tyrosinase của dịch

chiết rong đông có khả năng ức chế enzyme tyrosinase gây hiện tượng biến đen ở tôm

2 Mục tiêu của đề tài

- Định tính và định lượng một số thành phần hóa học trong rong đông (Hypnea pannosa)

- Thử nghiệm khả năng chống biến đen trên tôm thẻ chân trắng

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định thành phần hóa học của rong đông (Hypnea pannosa)

- Khảo sát khả năng ức chế enzyme tyrosinase của rong đông

- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết (thời gian, nhiệt độ) đến hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase

- Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các phân đoạn dung môi chiết

- Thử nghiệm khả năng chống biến đen của rong đông (Hypnea pannosa) trên tôm thẻ chân trắng

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Đề tài cung cấp dữ liệu khoa học để xác định khả năng ức chế enzyme tyrosinase

của rong đông (Hypnea pannosa) và nghiên cứu được điều kiện chiết thích hợp để thu

được dịch chiết có hoạt tính ức chế enzym tyrosinase cao nhất

Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để ứng dụng dịch chiết từ rong đông trong bảo quản tôm sau thu hoạch nhằm hạn chế sự biến đen trên tôm

14

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về rong

Rong biển là các thực vật dạng tản (Thallus), cơ thể gồm một hay nhiều tế bào

tập hợp Rong biển phân bố ở vùng cửa sông, các đầm nước lợ, vùng triều hay các vùng biển sâu Rong biển là các sinh vật tự dưỡng, có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng từ trong môi trường thuỷ vực tạo thành chất hữu cơ nuôi dưỡng cơ thể, chúng

có khả năng hô hấp hay quang hợp trên toàn bộ bề mặt cơ thể Quá trình phát sinh cũng không trải qua giai đoạn phôi mà chỉ dừng ở hợp tử, hợp tử tách ra khỏi cơ thể

mẹ và phát triển thành cơ thể mới

Rong biển được biết đến là nguồn nguyên liệu giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng Việt Nam có một hệ rong biển phong phú với khoảng 1.000 loài, trong

đó gần 700 loài rong biển đã được định danh, (Dang và Hoang, 2004) [64]

Đỗ Anh Duy và Đỗ Văn Khương (2013) dùng phương pháp hình thái so sánh và phân tích cấu trúc tế bào, đã xác định được 376 loài rong biển, thuộc 62 họ, 31 bộ

thuộc 4 ngành rong biển Trong đó, ngành rong Đỏ (Rhodophyta) có 178 loài, ngành rong Lục (Chlorophyta) có 94 loài, ngành rong nâu (Ochrophyta) có 80 loài và ngành rong Lam (Cyanobacteria) có 24 loài Trong những năm gần đây, rong biển thu hoạch

tại các vùng biển ở Việt Nam đã bước đầu được nghiên được nghiên cứu một số hoạt tính sinh học như hoạt tính chống oxy hóa, kháng tế bào tế bào ung thư và kháng khuẩn [89] Ví dụ, Cương và cộng sự (2016) đã đánh giá khả năng chống oxy hóa của một số loài rong biển thu hoạch tại vùng biển Khánh Hòa [62]

Riêng ở vùng biển Khánh Hòa có cả ba ngành rong: rong Đỏ (Rhodophyta), rong Lục (Chlorophyta), rong nâu (Ochrophyta) Trong đó, rong đỏ và rong nâu là hai đối

tượng được nghiên cứu và được ứng dụng nhiều trong đời sống Các đối tượng quan

trọng là rong cau (Gracilaria), rong mơ (Sargassum), rong đỏ (Hypnea),…

1.1.1 Tổng quan về rong đỏ Hypnea pannosa

Lớp : Florideophceae

Phân lớp : Rhodymeniophycidae

Họ : Cystocloniaceae

Chi : Hypnea

15

Hình 1.1: Hình ảnh rong đông Hypnea pannosa

Hypnea pannosa J Agardh là một loài tảo biển màu đỏ, thuộc họ Hypneaceae

(Valeem và Shameel, 2012) Là loài rong đỏ mọc thành đám lớn, màu lục vàng, cài rối vào nhau, kích thước 4 - 8 cm; thân hình trụ tròn 1 - 3mm, chia nhánh nhiều, nhánh ngắn, không đều, các thường mọc thành một góc rộng với trục, đỉnh nhánh hình nón Lát cắt ngang thân cho thấy ở giữa là tế bào hình trụ tròn không lớn, chung quanh là 1 đến 2 lớp tế bào bao quanh kích thước bề rộng 200 - 250 µm, lớp ngoài cùng là lớp tế bào nhỏ rộng 20 µm có chứa sắc tố; Tứ bào tử phòng ở một bên của nhánh nhỏ, thường có hình bầu dục (Phạm, 1969) [79]

H pannosa phân bố ở Quần đảo Đại Tây Dương: (Quần đảo Cape Verde), Bắc

Mỹ: (Vịnh California và Mexico), Trung Mỹ: (Costa Rica, El Salvador, México- Thái Bình Dương), Nicaragua, Panama; Nam Mỹ: Brazil, Quần đảo Galápagos; Châu Phi: Eritrea, Madagascar, Mauritius, Sénégal, Tanzania; Quần đảo Ấn Độ Dương: Quần đảo Aldabra, Quần đảo Chagos, Đảo Giáng sinh, Đảo san hô Diego Garcia, Quần đảo Laccadive, Maldives, Réunion, Seychelles; Tây Nam Á: Bangladesh, Ấn Độ, Iran, Oman, Pakistan, Sri Lanka, Yemen; Châu Á: Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan; Đông Nam Á: Indonesia, Philippines, Singapore, Thái Lan, Việt Nam; Úc và New Zealand: Queensland, Tây Úc; Quần đảo Thái Bình Dương: Liên bang

16

Micronesia, Fiji, Polynesia thuộc Pháp, Quần đảo Hawaii, Quần đảo Mariana, Samoa, Quần đảo Samoa, Quần đảo Solomon (Guiry và Guiry, 2013) [23]

Ở Việt Nam, Nguyễn Văn Tú và cộng sự (2018) đã khảo sát sự phân bố và đa

dạng thành phần loài của chi rong Hypnea ở vùng nghiên cứu gồm các tỉnh Khánh

Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận và Bà Rịa - Vũng Tàu theo cách tiếp cận sinh học phân

tử trong phân loại Kết quả nghiên cứu ghi nhận được 9 loài thuộc chi Hypnea ở vùng nghiên cứu gồm loài: Hypnea cervicornis J.Agardh, Hypnea charoides J.V.Lamouroux, Hypnea cornuta (Ktzing) J.Agardh, Hypnea cenomyce J.Agardh, Hypnea esperi Bory de Saint-Vincent, Hypnea nidulans Setchell, Hypnea pannosa J.Agardh, Hypnea spinella (C.Agardh) Ktzing và Hypnea valentiae (Turner) Montagne So với các địa phương trong vùng nghiên cứu, tỉnh Khánh Hòa có số lượng

loài ghi nhận cao nhất với 8/9 loài Các axit amin như alanine, arginine, axit aspartic, axit glutamic, glycine, isoleucine, leucine, lysine, valine (Siddique và cộng sự, 2013) [1] và Sesquiterpenes là 10-bromo-7, 12-dihydro-3 , filiformin và filiforminol là thành phần hóa học được báo cáo Afaq-Hussain và cộng sự (1991) [1], Siddique và cộng sự (2013) [49] H pannosa sở hữu kháng khuẩn (Shanmughapriya và cộng sự, 2008) [47], giảm đau, chống nôn (Mazhar và cộng sự, 2011) [37] và hoạt động haemagglutinic (Alam và Usmanghani, 1994) [2] Mặc dù hoạt động kháng nấm của H pannosa chống

lại Candida albicans đã được báo cáo trước đó (Shanmughapriya và cộng sự, 2008)

[74]

Sinh thái và phân bố: Phân bố ở vùng trung triều, thường bám trên đá; được tìm thấy khu vực Nha Trang (Khánh Hòa), Núi Chúa (Ninh Thuận), Phú Quý (Bình Thuận), Vũng Tàu (Bà Rịa - Vũng Tàu)

1.1.2 Phương pháp tách chiết

1.1.2.1 Cơ sở của quá trình tách chiết

Chiết là phương pháp thu lấy một hay nhiều chất từ hỗn hợp đã tách biệt, cô lập

và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng

- Quá trình chiết gồm hai giai đoạn, như sau:

17

Giai đoạn 1: Dung môi thấm ướt lên bề mặt nguyên liệu, sau đó thấm sâu vào bên trong do quá trình thẩm thấu tạo ra dung dịch chứa các hoạt chất Sau đó dung môi tiếp tục hòa tan các chất trên bề mặt bằng cách đẩy các bọt khí chiếm đầy trong các khe vách trống của tế bào

Giai đoạn 2: giai đoạn tiếp tục hòa tan các hợp chất trong các ống mao dẫn của nguyên liệu nhờ vào dung môi đã thấm sâu vào các lớp bên trong

- Phương pháp tách chiết bằng dung môi

Tách chiết bằng dung môi là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất tan trong một pha lỏng vào trong một pha lỏng khác không hòa tan với nó, nhằm chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác, nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu Bên cạnh đó việc chiết thành cao dịch thô là vô cùng quan trọng vì khi đó giữ lại được hoạt chất tốt hơn và dễ dàng cho những công đoạn sau

1.1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết

1.1.3.1 Dung môi chiết

Qua nhiều nghiên cứu cho rằng với mỗi dung môi khác nhau thì khả năng tách chiết không giống nhau Một số yếu tố của dung môi có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất là độ phân cực, độ nhớt và sức căng bề mặt (Lưu Duẩn, 1996)

Độ phân cực của dung môi: dung môi kém phân cực thì dễ hòa tan những chất không phân cực, dung môi càng phân cực mạnh càng dễ hòa tan các chất phân cực

Độ nhớt và sức căng bề mặt: độ nhớt càng thấp hoặc sức căng bề mặt càng nhỏ thì dung môi càng dễ thấm vào nguyên liệu, không cản trở quá trình khuếch tán chất cần thiết Độ nhớt cao sẽ cản trở quá trình khuếch tán của chất chiết làm giảm hiệu quả chiết Dung môi được sử dụng trong nghiên cứu này là dung môi methanol Methanol

là dung môi có tính phân cực mạnh nên ngoài khả năng hòa tan polyphenol thì nó còn

có khả năng hòa tan nhiều thành phần hóa học khác Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng methanol là một dung môi phù hợp nhất để tách polyphenol (Galvez và cộng sự, 2005) [21]

18

1.1.3.2 Nhiệt độ chiết

Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Stokes – Einstein, khi nhiệt độ tăng thì

hệ số khuếch tán tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi cho quá trình chiết xuất trong các trường hợp sau:

Đối với hợp chất kém bền nhiệt độ cao: nhiệt độ tăng cao sẽ gây phá hủy một số hoạt chất như vitamine, glycoside, alkaloid.…

Đối với tạp: khi nhiệt dộ tăng, không chỉ độ tan của chất tăng, mà độ tăng của tạp cũng tăng theo, khi đó dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp Nhất là đối với một số tạp như gôm, chất nhầy, khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương nở, tinh bột bị hồ hóa, độ nhớt của dịch chiết

sẽ tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế

Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: khi tăng nhiệt độ thì dung môi

dễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và phải có bộ phận hồi lưu dung môi

Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt: khi nhiệt độ tăng, độ tan của chúng lại giảm Do đó để tăng độ tan thì cần phải làm giảm nhiệt độ

Từ những phân tích trên thấy tùy từng trường hợp cụ thể mà lựa chọn nhiệt độ chiết sao cho phù hợp (tùy thuộc vào các yếu tố như nguyên liệu chiết, dung môi, phương pháp chiết)

1.1.3.3 Thời gian chiết xuất

Khi bắt đầu chiết, các chất có khối lượng phân tử nhỏ thường là hoạt chất sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn (thường là tạp, nhựa, keo…) Do đó nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết hết hoạt chất trong dược liệu; nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Tóm lại, cần lựa chọn thời gian chiết, thành phần dược liệu dung môi, phương pháp chiết phù hợp

1.2 TỔNG QUAN VỀ TÔM

1.2.1 Tình hình nuôi trồng và xuất khẩu tôm

Theo báo cáo thống kê của hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam, trong những năm gần đây, diện tích và sản lượng tôm nuôi không ngừng tăng, đến năm

19

2018, diện tích nuôi tôm các loại của cả nước ước đạt 720 nghìn ha, tăng 5,4% so với năm 2017 Tổng sản lượng tôm nước lợ ước đạt 745 nghìn tấn, tăng 9% so với 2017 Trong đó, sản lượng tôm sú ước đạt 275 nghìn tấn, tăng 5,3%, sản lượng tôm chân trắng ước đạt 475 nghìn tấn, tăng 11,2% so với năm 2017

Cả nước có khoảng 160 doanh nghiệp tham gia chế biến, xuất khẩu tôm, tập trung chủ yếu ở Miền Trung, Nam Trung Bộ (Khánh Hòa, Phú Yên, Ninh Thuận, Bà Rịa – Vũng Tàu…), Đồng Bằng Sông Cửu Long (Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà Mau, Kiên Giang), với tổng công suất chế biến đạt gần 1 triệu tấn sản phẩm/năm

Năm 2018, Việt Nam xuất khẩu tôm sang 97 thị trường, với tổng giá trị đạt 3,6 tỷ USD, một số thị trường chủ lực của tôm Việt Nam là: EU, Nhật Bản, Mỹ, Trung Quốc, Hàn Quốc, Canada, Australia, ASEAN, Đài Loan, Thụy Sỹ, chiếm 95,9% tổng giá trị

XK tôm của Việt Nam

Đối với tôm nước lợ: Từ cuối quý II/2018, giá tôm nguyên liệu đã tăng lên, người nuôi tiếp tục thả giống nuôi tôm, góp phần đưa sản lượng tôm các loại đạt khoảng 800 nghìn tấn trong năm 2018, tăng 10,5% so với năm 2017

1.2.2 Tổng quan về tôm thẻ chân trắng

Tên khoa học: Litopenaeus vannamei

Tên tiếng anh: White Leg Shrimp

Tên gọi khác: Penaeus vannamei

Tôm thẻ chân trắng thuộc:

Ngành: Arthropoda Lớp: Malacostraca Bộ: Decapoda Họ: Penaeidae Chi: Litopenaeus

Loài: L.vannamei

20

Hình 1.2: Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

1.2.3 Biến đổi của tôm sau khi chết

Tôm nguyên liệu sau khi chết dưới tác dụng của các enzyme nội tại và hoạt động của các vi sinh vật trong cơ thịt tôm xảy ra hàng loạt những biến đổi phức tạp đặc biệt

là những biến đổi sâu sắc về mặt hóa học đó là các quá trình tự phân giải, phân hủy tự nhiên làm cho nguyên liệu bị biến chtaas hoàn toàn không sử dụng được nữa Sự biến đổi của cơ thịt tôm nguyên liệu sau khi chết gồm các quá trình cơ bản sau:

- Sự tiết nhớt ra ngoài cơ thể

- Sự phân giải glycogen (glycolysis)

- Sự tê cứng của cơ thịt (rigor mortis)

- Sự mềm hóa trở lại

- Tác dụng tự phân giải (autolysis)

- Sự thối rữa (putrefaction)

1.2.3.1 Các biến đổi về cảm quan

Biến đổi cảm quan là những biến đổi được nhận biết nhờ các giác quan như bề ngoài, mùi, vị, cấu trúc Khi thủy sản vừa chết thì cơ thịt mềm mại đàn hồi tốt, sau một thời gian chuyển sang trạng thái tê cứng Khi ở giai đoạn tê cứng, các sợi cơ co rút cực

độ Khi hết giai đoạn này, cơ hết cứng, cơ sẽ duỗi ra và trở lên mềm mại nhưng không còn đàn hồi như trước khi tê cứng, cơ thịt chuyển sang giai đoạn mềm hóa, lúc này chúng dễ bị biến dạng, thân mềm nhão, hư hỏng Thời điểm xuất hiện và thời gian tê cứng phụ thuộc tùy vào giống loài và chịu ảnh hưởng của các yếu tố như nhiệt độ bảo

21

quản, quá trình xử lý thu hoạch, đánh bắt, kích cỡ, tình trạng cơ thể trước khi chết (Nguyễn Thị Dung,2011) [72]

1.2.3.2 Biến đổi do vi sinh vật

Thủy sản sau khi chết quá trình sinh tổng hợp trong cơ thể sẽ dừng lại, enzyme trong cơ thịt sẽ tiến hành quá trình tự phân giải, đồng thời lúc đó vi sinh vật sẽ phân hủy sản phẩm của quá trình tự phân giải thành sản phẩm cấp thấp, làm cho nguyên liệu biến chất hư hỏng đó chính là hiện tượng thối rữa.Vi sinh vật chính là nguyên nhân chính gây thối rữa nguyên liệu và cơ chất của quá trình thối rữa là protein Muốn phân giải được protein, trước tiên vi sinh vật phải tiết ra các enzyme phân giải protein ngoại bào và thủy phân protein thành các hợp chất có phân tử nhỏ hơn (các polypeptit và oligopeptit) Các chất này hoặc tiếp tục được phân hủy thành aminoacid nhờ các peptidase ngoại bào hoặc xâm nhập ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển thành aminoacid Một phần các aminoacid này được vi sinh vật sử dụng trong quá trình tổng hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp tục phân giải theo những con đường khác để sinh NH3, CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác Sau khi tôm chết, gặp điều kiện thuận lợi thì các vi sinh vật phát triển rất nhanh Vi sinh vật gây thối rữa có hai nhóm, một nhóm là những vi sinh vật tồn tại trong nguyên liệu trong quá trình sống, còn một nhóm là do ô nhiễm trong quá trình bảo quản và chế biến Đối với quá trình gây thối rữa của nguyên liệu không phải các loài vi sinh vật đều tác dụng

như nhau mà trong đó họ Pseudomonas hoạt dộng nhiều nhất còn các loài khác thì

phát triển ít và một số thì giảm đi Tôm sau khi chết nếu không kịp thời bảo quản thì số lượng vi sinh vật tăng lên rất nhanh đặc biệt là ở phạm vi nhiệt độ thích hợp

1.2.3.3 Biến đổi enzyme

Tôm sau khi tê cứng dần dần trở lại mềm, ta gọi đó là sự tự phân giải Quá trình này do các loại enzyme nội tại trong tôm hoạt động phân giải Khi tôm còn sống do sự tồn tại của kháng thể, cho nên các loại enzyme thủy phân không hoạt động tự phân giải, nhưng khi tôm đã chết kháng thế này mất đi nên hoạt động của enzyme sẽ trở nên

dễ dàng Trong quá trình này có nhiều loại enzyme tham gia nhưng chủ yếu là enzyme cathepsin phân giải protein thành peptone, enzyme tripsin và enterokinaza tiếp tục phân giải các sản phẩm trung gian thành acid amin Sự tự phân giải là do enzyme nội

22

tại gây ra, còn sự thối rữa là do vi sinh vật ở bên ngoài xâm nhập vào hoạt động, sản phẩm cuối cùng của quá trình tự phân giải là acid amin, các đạm hòa tan, còn quá trình thối rữa là sản phẩm cấp thấp thối nát Nếu không có quá trình thối rữa thì quá trình tự phân giải sẽ không tăng lên một cách vô hạn mà sẽ đạt tới trạng thái cân bằng ở mức

độ sản phẩm nào đó

Trong quá trình tự phân giải chủ yếu là sự tự phân giải protein nhưng chất béo cũng có sự biến đổi Phân giải chất béo chủ yếu là do enzyme lipase và xảy ra song song với quá trình phân giải protein Quá trình tự phân giải tuy làm tôm chuyển từ cứng sang mềm nhưng vẫn còn tươi tốt

Quá trình tự phân giải phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, như giống loài, môi trường

pH, các loại muối, ảnh hưởng của nhiệt độ Sự khác nhau về giống loài dẫn đến sự hoạt động của enzyme là khác nhau Tác động tự phân giải ở động vật máu lạnh nhanh hơn loài máu nóng, vì enzyme trong động vật máu lạnh mạnh hơn của loài máu nóng Còn nếu tăng độ acid của môi trường tức là giảm pH thì tác dụng tự phân giải tăng lên nhưng pH giảm đến một mức độ nhất định làm enzyme không hoạt động được nữa thì tác dụng tự phân giải lại giảm, ngược lại pH càng tăng thì tác dụng tự phân giải càng giảm Muối ăn cũng làm cản trở tác dụng tự phân giải, nồng độ muối ăn càng cao cản trở càng lớn, nhưng không làm ngừng được quá trình tự phân giải Ở dung dịch nước muối bão hòa, quá trình tự phân giải vẫn xảy ra nhưng rất chậm nhiệt độ cũng ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình tê cứng, phân giải cũng như thối rữa sau này Trong phạm vi nhiệt độ thích hợp thì cứ tăng 10⁰C thì tốc độ phân giải tăng 2-3 lần Khi nhiệt

độ giảm thì tốc độ tự phân giải sẽ giảm, nhưng khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ thích hợp thì tốc độ phân giải cũng giảm, do nhiệt độ quá cao hay quá thấp đều làm giảm sự hoạt động của enyme Nhiệt độ thích hợp của enzyme ở từng loài khác nhau là khác nhau

1.3 Tổng quan về enzyme tyrosinase và hiện tượng biến đen ở tôm

1.3.1 Tyrosinase

Tyrosinase (EC 1.14.18.1) là một loại enzyme có chứa đồng có trong các mô thực vật và động vật xúc tác quá trình sản xuất melanin và các sắc tố khác từ tyrosine

Enzyme này được phân phối rộng rãi trong tự nhiên, bao gồm vi khuẩn, nấm, thực vật bậc cao (với số lượng đặc biệt cao trong nấm, chuối, táo, lê, khoai tây, bơ và đào) và động vật (Mayer, 2006) [36] Enzyme tyrosinase tồn tại ở 3 dạng: oxy, deoxy, met-tyrosine Cả dạng met- tyrosinase và dạng oxy- tyrosinase đều có hoạt tính diphenolase Trong khi chỉ có ở dạng oxy- tyrosinase là có hoạt tính monophenolase (Matoba và cộng sự, 2006) [35] Dạng deoxy-tyrosinase là dạng yếu, không ổn định; phản ứng với oxy để tạo thành dạng oxy-tyrosinase

Trung tâm hoạt động: gồm có túi enzym và 2 nguyên tử đồng nằm ở đáy túi, đóng vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác của enzym Mỗi nguyên tử đồng tạo liên kết phối trí với 3 phân tử histamin Như vậy, để một cấu tử thể hiện được vai trò ức chế enzym tyrosinase, nó cần phải chui được vào túi enzym của trung tâm hoạt động

và khóa được ion Cu2+ ở đáy túi enzym

Tyrosinase là nguyên nhân của biến đen không mong muốn của trái cây và rau quả vì nó xúc tác quá trình oxy hóa các hợp chất phenolic thành các quinone dẫn đến hình thành các sắc tố màu nâu đen Các quinone này có thể phản ứng với các nhóm protein hoặc sulfhydryl của protein, phá hủy các axit amin thiết yếu và làm giảm khả năng tiêu hóa protein và giá trị dinh dưỡng của chúng Để ngăn chặn biến đen và bảo tồn giá trị dinh dưỡng của thực phẩm, việc phát triển các chất ức chế tyrosinase tốt có tầm quan trọng lớn đối với lĩnh vực nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm (Wang và cộng sự, 2011) [57]

1.3.2 Các chất ức chế tyrosinase có nguồn gốc từ thiên nhiên

Hầu hết các chất ức chế cho đến nay là các hợp chất tổng hợp hoặc có nguồn gốc

từ thực vật bậc cao như polyphenol, flavonoid, aldehyd và các dẫn xuất của chúng

24

(Loizzo và cộng sự, 2012) [32] Vì thực vật là một nguồn chất hoạt tính sinh học phong phú mà hầu như không có tác dụng phụ có hại, nên việc tìm kiếm các chất ức chế tyrosinase từ các nguồn tự nhiên ngày càng tăng (Chan và cộng sự, 2011) [9] Polyphenol đại diện cho một nhóm các hợp chất đa dạng có chứa nhiều chức năng phenolic và được phân phối rộng rãi trong tự nhiên Polyphenol cũng là nhóm lớn nhất trong các chất ức chế tyrosinase cho đến nay Vì một số polyphenol được chấp nhận làm cơ chất bởi tyrosinase, nên nó phụ thuộc vào sự hiện diện và vị trí của chất phụ trợ bổ sung cho dù một polyphenol có thể hoạt động như một chất ức chế Flavonoid là một trong số các polyphenol được nghiên cứu nhiều nhất và tốt nhất, đó

là các dẫn xuất benzo pyrone bao gồm các vòng phenolic và pyrene Phân bố rộng rãi trong lá, hạt, vỏ cây và hoa của cây, hơn 4.000 flavonoid đã được xác định cho đến nay (Chang và cộng sự, 2009) [90] Nhiều aldehyd và các hợp chất khác cũng được phân lập và xác định là có tác dụng ức chế enzym tyrosinase như cinnamaldehyd, (2E) -alkenal, 2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyd, anisaldehyd, cuminaldehyd và acid cumic ( Kubo và cộng sự, 1999) [28] Hoạt động ức chế tyrosinase của anisaldehyd và cuminaldehyd mạnh hơn khoảng 2,5 và 16 lần so với benzaldehyd Một số alkanal có tác dụng ức chế tyrosinase có thể là do sự tương tác kỵ nước của chúng với các enzym, làm ảnh hưởng đến cấu trúc bậc 3 của enzym (2E) - alkenal ức chế quá trình oxy hóa L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) của tyrosinase là chất ức chế không cạnh tranh, và phần alkyl kỵ nước có liên quan đến hoạt động ức chế của chúng (Conrad và cộng sự, 1994) [14] Bên cạnh những thực vật bậc cao thì trong nấm cũng có một số hợp chất có tác dụng ức chế enzym tyrosinase Acid dicacboxylic bão hòa được tạo thành bởi quá trình peroxy hóa lipid và este hóa acid béo bằng nấm men, vi nấm Pityrosporum ovale Acid dicacboxylic này có tác dụng gây độc nhất định trên các tế bào biểu bì tạo sắc tố của khối u ác tính ở da, mặc dù bình thường tế bào biểu bì tạo sắc tố không bị ảnh hưởng (Schallreuter và cộng sự, 1990) [46] Acid kojic, 5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-γ-pyron, một chất chuyển hóa của nấm được sản xuất bởi nhiều loài thuộc chi Aspergillus và Penicillium Acid kojic ức chế sự hình thành sắc tố

từ phản ứng oxy hóa L-DOPA, norepinephrin và dopamin dưới sự xúc tác của

1.3.4 Hiện tượng biến đen ở tôm

Tôm sau khi đánh bắt lên khoảng vài giờ sẽ xuất hiện những chấm đen Chấm đen này không có nghĩa là giảm giá trị dinh dưỡng mà chứng tỏ rằng tôm đã mất chất lượng bề ngoài (Nguyễn và Nguyễn, 2006) [76]

Hiện tượng biến đen là quá trình sinh học tự nhiên xảy ra trong tôm Ngay khi tôm bị chết, đã bắt đầu xuất hiện những tế bào riêng biệt bị phá hủy và bị phân chia thành những chất đơn giản bởi enzyme tyrosinase Trong đó acid amin đóng vai trò cơ bản trong việc hình thành đốm đen là tyrosine (Hình 1.3) Enzyme tyrosine chứa trong một lớp màng trong suốt dưới vỏ, ban đầu không có sự xuất hiện của enzyme gây sự biến đen, dưới tác động của các enzyme thủy phân protein, tyrosine được phát tán vào các mô tế bào Dưới tác dụng xúc tác của enzyme tyrosinase, tyrosine chuyển thành dihydroxyphenylalanine (DOPA) có màu vàng nhạt Tyrosinase tiếp tục xúc tác chuyển hóa DOPA thành DOPA-quinon có màu vàng Các DOPA- quinon này đa tụ lại tạo thành những đốm đen ở tôm

Tốc độ hóa nâu của enzyme phụ thuộc vào nồng độ enzyme tyrosinase và chất nền phenolic, lượng oxy, pH, nhiệt độ,… (Zheng và cộng sự 2008) [61]

26

Hình 1.3: Cơ chế của sự biến đen ở tôm

Có ba tác nhân chính tạo nên đốm đen ở tôm bao gồm:

- Enzyme polyphenoloxydase

- Oxy không khí

- Các hợp chất chứa gốc phenol (tyrosin, phenylalanin)

Kiểm soát sự biến đen ở tôm bằng cách ngăn cản các phản ứng trong cơ chế biến đen diễn ra Để ngăn chặn không cho các phản ứng biến đen xảy ra thì cần ức chế một trong ba tác nhân chính ở trên

1.3.5 Tình hình nghiên cứu về tyrosinase và sự biến đen của tôm

1.3.5.1 Nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu đã dùng rong biển để ức chế enzyme tyrosinase, kết quả cho thấy trong rong biển có chứa các hợp chất có khả năng

ức chế loại enzyme này

Chakraborty và cộng sự (2015) đã nghiên cứu đánh giá hoạt động chống oxy hóa

và hàm lượng phenolic của ba loại rong đỏ (Division: Rhodophyta) được thu hoạch từ

Vịnh Mannar của Bán đảo Ấn Độ Kết quả cho thấy, hoạt động chống oxy hóa của dịch chiết chiết xuất methanol và các phân đoạn (n-hexane, dichloromethane và ethyl

acetate) của ba loại rong biển đỏ (Hypnea musciformis, H valentiae và Jania rubens)

được thu thập từ Vịnh Mannar của Đông Nam Ấn Độ Phân đoạn ethyl acetate

(EtOAc) của H musciformis thể hiện tổng hàm lượng phenolic cao hơn đáng kể (205,5

mg GAE/g), hoạt động khử góc tự do DPPH (IC50 = 0,6 mg/mL) Chiết xuất MeOH

của H valentiae và J rubens cho thấy hoạt tính khử gốc tự do hydroxyl cao hơn đáng

Chang và Teo (2016) đã nghiên cứu đánh giá các hoạt động của kim loại nặng,

chống oxy hoá và chống lại enzyme tyrosinase có ở rong đỏ (Eucheuma cottonii) Kết

quả cho thấy, các hàm lượng phenolic có khả năng ức chế enzym tyrosinase tốt, đạt được trung bình 234,33 μg/ml với nồng độ ức chế 50% tyrosinase (IC50) E cottonii

có thể là nguồn tiềm năng của tự nhiên chống enzyme tyrosinase [11]

Quispe YN và cộng sự (2017) đã nghiên cứu sàng lọc các chất ức chế enzyme

tyrosinase trong cây thuốc Hypericum laricifolium Juss ở Peru Kết quả nghiên cứu

cho thấy, trong số các chất chiết xuất từ thực vật, những chất có tỷ lệ ức chế lớn hơn

50% là Hypericum laricifolium Juss., Taraxacum docinaleF.H.Wigg., Và Muehlenbeckia VulcanicaMeisn Với H laricifolium Juss, cho thấy hoạt động chống enzyme tyrosinase lớn nhất Mặc dù H laricifolium Juss đã được sử dụng rộng rãi như

một cây thuốc của người Peru, ít được biết đến về các thành phần hoạt tính sinh học và

có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase Tám hợp chất được phát hiện: axit protocatechuic, axit p-hydroxybenzoic, axit chlorogen, axit vanilic, axit caffeic, kaempferol 3-O-glucuronide, quercetin, kaempferol Trong đó, quercetin thể hiện sự

ức chế enzyme tyrosinase mạnh nhất (IC50 =14,29 ± 0,3 M) Do đó, cây Peru H laricifolium Juss có thể là một nguồn mới cho hoạt động chống tyrosinase[44]

Islam và cộng sự (2017), đã nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase và

hoạt động chống oxy hóa bởi bromophenols từ tảo đỏ Odonthalia corymbifera Kết

quả nghiên cứu cho thấy, hợp chất (6) cho thấy chất ức chế mạnh nhất (IC50 = 1.0 µM) trong số các bromophenol và axit kojic được khảo sát Hai chất ức chế mạnh khác là các hợp chất (1) và (2) với giá trị IC50 lần lượt là 5,2 µM và 11,0 µM Các hợp chất này có hai gốc 2,3-dibromo-4,5-dihydroxylbenzyl trong cấu trúc của chúng [24]

Panda và cộng sự (2018) đã nghiên cứu các chất chống oxy hóa và hoạt động ức

chế enzyme tyrosinase của lá cây leo chân lạc đà (Bauhinia vahlii) Kết quả nghiên cứu cho thấy, chiết xuất metanol của Bauhinia vahlii (BVM) sở hữu các hợp chất

28

polyphenolic cao BVM chứa các axit béo bão hòa như axit hexadecanoic (10,15%), axit octadecanoic (1,97%), axit oleic (0,61%) và axit cis-vaccenic (2,43%) cùng với vitamin E (12,71%), α-amyrin (9,84%), methyl salicylate (2,39%) và sitosterol (17,35%), chủ yếu chịu trách nhiệm chống oxy hóa cũng như hoạt động ức chế enzyme tyrosinase Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của chiết xuất này tương

đương với hoạt chất của axit Kojic Những phát hiện này cho thấy rằng lá B vahlii có

thể được khai thác như là nguồn tiềm năng của chất chống oxy hóa tự nhiên và chất ức chế enzyme tyrosinase [42]

Şöhretoğlu và cộng sự (2018) đã nghiên cứu khả năng ức chế enzyme tyrosinase bởi một số flavonoid: Hoạt động ức chế, cơ chế của in vitro và trong các nghiên cứu silico Flavonoid là nhóm polyphenolic chính được phân phối rộng rãi cho trái cây, rau

và đồ uống chúng ta tiêu thụ hàng ngày Chúng thể hiện nhiều tác dụng sinh học Chúng tôi đã thử nghiệm khả năng ức chế enzyme tyrosinase của flavonoid liên quan đến cấu trúc (1, 9) và thấy rằng tất cả các vật liệu được thử nghiệm đều có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase so với kiểm soát dương tính, axit kojic (2) thể hiện tác dụng ức chế enzyme tyrosinase mạnh nhất với giá trị IC50 là 40,94 ± 0,78 Theo phân tích động học (1),(4) và (7) được tìm thấy là chất ức chế cạnh tranh, (3), (5) và (6) chất ức chế không cạnh tranh của enzyme tyrosinase [51]

Fan và cộng sự (2018) đã nghiên cứu mối quan hệ của cấu trúc flavonoid với hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase và ái lực của nó Kết quả nghiên cứu cho thấy, các nhóm hydroxy của 5C−OH, 4′COH và 5′C−OH của flavonoid đã hình thành liên kết hydro với các axit amin của enzyme tyrosinase, đóng vai trò quyết định trong liên kết

và tương tác giữa flavonoid và enzyme tyrosinase Các nhóm flavonoid khác nhau thể hiện những ảnh hưởng khác nhau đến hoạt động ức chế enzyme tyrosinase và ái lực gắn kết Glycosyl hóa chủ yếu gây ra sự suy giảm trong cả hoạt động ức chế và ái lực của flavonoid [19]

Ullah và cộng sự (2019) đã nghiên cứu khả năng ức chế enzyme tyrosinase và tác dụng chống melanin của các chất cinnamamide Kết quả nghiên cứu cho thấy, bốn trong số các cinnmamides với nhóm 2,4-dihydroxyphenyl, biểu hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao hơn (ức chế 67,33 - 79,67%) ở mức 25μM so với axit kojic (ức

29

chế 38,11%), với thứ tự ức chế tăng sau: morpholino (9) = cyclopentylamino (14) < cyclohexylamino (19) < N-methylpiperazino (4) cinnamamides Kết quả phân tích hàm lượng melanin rất phù hợp với phân tích hoạt động enzyme tyrosinase của tế bào, cho thấy sự ức chế enzyme tyrosinase của bốn cinnamamide là một yếu tố chính trong việc giảm sản xuất melanin Những kết quả này ngụ ý rằng bốn cinnamamide có thể hoạt động như các chất chống melanogen tuyệt vời trong điều trị rối loạn sắc tố [55]

Kim và cộng sự (2019) đã nghiên cứu ức chế enzyme tyrosinase của

flavonolignans từ hạt của Silybum marianum (Cây kế sữa) Kết quả nghiên cứu cho

thấy, các thành phần ức chế enzyme tyrosinase được tìm thấy là flavonolignans bao gồm isosilybin A (1), isosilybin B (2), silydianin (3), 2,3-dihydrosilychristin (4), silychristin A (5) B (6) và silybin (7), tương ứng Các flavonolignans (1 đến 7) đã ức chế cả monophenolase (IC50 = 1.7-7.6M) và diphenolase (IC50 = 12.1-44.944M) của enzyme tyrosinase [27]

1.3.5.2 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, Nguyen và cộng sự (2016) đã đánh giá hoạt tính ức chế enzyme

tyrosinase của hợp chất flavonoids từ mít (Artocarpus heterophyllous) Kết quả cho

thấy, hai loại flavonoid mới, artocaepin E (1) và artocaepin F (2), được phân lập từ gỗ

của Artocarpus heterophyllous , cùng với norartocarpetin (3), artocarpanone (4),

liquidriteigenin (5), steppogenin (6) và dihydrom (7) Artocarpanone (4) có tác dụng

ức chế enzyme tyrosinase mạnh nhất, với IC50 là 2,0 μM, tiếp theo là artocaepin E (1)

và steppogenin (6), với giá trị IC50 lần lượt là 6,7 và 7,5 μM Nghiên cứu chỉ ra rằng 1 chất cho thấy sự ức chế cạnh tranh, với hằng số ức chế (Ki) là 6,23 M [75]

Duy và Quốc, (2016) đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và ức chế enzyme

tyrosinase của nấm linh chi thượng hoàng (Phellinus linteus) ở Việt Nam Kết quả cho

thấy, bốn nhóm hợp chất chính có hoạt tính được phát hiện có trong nấm linh chi thượng hoàng tự nhiên gồm: polyphenol, flavonoid, polysaccharid và triterpenoid với hàm lượng lần lượt là 189,9 mg GAE/g cao ethanol, 116,2 mg QE/g cao ethanol,

10,7% và 2,31% Dịch chiết nấm Phellinus linteus thể hiện hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro trong cả ba phép thử Giá trị IC50 dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH

Mai và Mai ( 2018), đã nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của một số cây thuốc Việt Nam và các hợp chất được phân lập từ cây mít dai Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của 17 mẫu cây thuốc Việt Nam thuộc họ Dâu tằm

cho thấy, cao MeOH của cây Dâu tằm (Morus alba), Mít tố nữ (Artocarpus elasticus)

và Mít dai (Artocarpus heterophyllus) có hoạt tính ức chế enzym tyrosinase mạnh với

giá trị IC50 dưới 3 μg/mL Từ các phân đoạn có hoạt tính của cao EtOAc của gỗ cây

mít dai (A heterophyllus) đã phân lập được 26 hợp chất, bao gồm 14 hợp chất

flavonoid, 9 hợp chất chalcone và 3 hợp chất 2-arylbenzofuran Trong đó, hợp chất morachalcone A (22) có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh nhất, với giá trị IC50

là 0.013 µM, mạnh hơn chất đối chứng dương kojic acid (IC50, 44.6 µM) [71]

Qua tổng quan cho thấy, rong biển chứa nhiều hợp chất có khả năng ức chế enzyme tyrosinase, có tiềm năng rất lớn để ứng dụng trong việc ngăn chặn quá trình

31

biến nâu, biến đen của nguyên liệu thực phẩm trong quá trình bảo quản Những nghiên cứu ở Việt Nam về hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase chủ yếu thực hiện trên các đối tượng thực vật trên cạn Những nghiên cứu thực hiện trên đối tượng nguyên liệu từ biển, đặc biệt là rong biển còn rất hạn chế Do đó, nghiên cứu này bước đầu đánh giá

hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của rong đông (Hypnea pannosa) thu hoạch tại

vùng biển Khánh Hòa và thử nghiệm khả năng chống biến đen trên tôm thẻ chân trắng

32

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu

Đối tượng nghiên cứu: Rong đông Hypnea pannosa và tôm thẻ chân trắng

2.1.1 Nguyên liệu rong

Nguyên liệu sử dụng trong đề tài này là rong đông (Hypnea pannosa) được thu

nhận tại biển Hòn Chồng, Nha Trang, Khánh Hòa trong thời gian từ tháng 3 đến tháng 6/2018 Rong sau khi thu hoạch được rửa sạch tạp chất và muối, sau đó làm khô tự nhiên dưới ánh nắng mặt trời Sau khi phơi khô, rong được chứa đựng trong các túi PE

và bảo quản ở điều nhiệt độ phòng cho tới khi tiến hành các thí nghiệm

2.1.2 Tôm thẻ chân trắng

Tôm thẻ chân trắng (White Leg shrimp) được mua tại chợ Vĩnh Hải, Thành phố

Nha Trang (Khánh Hòa) Tất cả các mẫu tôm đều còn sống, không chọn những con bị tổn thương, có màu sắc lạ hoặc có biểu hiện bị bệnh Tôm được được vận chuyển sống

về phòng thí và tiến hành các xử lý và bảo quản tiếp theo

2.1.3 Hóa chất thuốc thử

Enzym tyrosinase, Cơ chất L-3,4-dihydroxyphenylalanine được cung cấp bởi

công ty Sigma Aldrich của Hoa Kỳ

Các hóa chất còn lại: DMSO, Methanol, Ethanol, Na2HPO4, NaH2PO4, Hexan, Ethyl acetate, n-Buthanol, Feling A, Feling B, NaOH, Fe2(SO4)3, H2SO4, KMnO4, Chì acetate, Chloroform, NaCl, Na2CO3, Folin, FeCl3 đều đạt hạn sử dụng được cung cấp bởi công ty Trung Quốc

33

thu nhận trong điều kiện chiết thích hợp tiếp tục được tách phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau (n-hexane, ethyl acetate, butanol, nước) Hoạt tính ức chế của enzyme tyrosinase của các phân đoạn này sẽ được đánh giá

Tách phân đoạn Thử nghiệm bảo

quản trên tôm thẻ chân trắng

Định tính một số

nhóm chất hữu cơ

của rong

Định lượng một số thành phần hóa học của rong

34

Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 2.2.2 Thí nghiệm xác định thời gian chiết

Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các thời gian chiết khác nhau

của rong đông Hypnea pannosa đến khả năng ức chế enzyme tyrosinase được thể hiện

Xử lí mẫu

35

Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến

hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của rong đông Hypnea pannosa

Cân chính xác 10 g nguyên liệu rong khô và cho vào bình tam giác dung tích 250

ml Để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết, các mốc thời gian: 50, 60 và 70 phút được sử dụng Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany) Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.1 Dịch chiết thu được sau khi lọc được cô quay chân không để loại hết dung môi, đạt một thể tích nhất định (dưới 20 ml) Sau đó, tất cả dịch chiết được đưa về cùng một thể tích cuối cùng là 20 ml và sử dụng cho các thí nghiệm đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase Thời gian chiết cho hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao nhất sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

2.2.3 Thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết

Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các nhiệt độ chiết khác nhau của rong đông Hypnea pannosa đến khả năng ức chế enzyme tyrosinase được thể hiện

ở trên Hình 2.3

36

Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của rong đông Hypnea pannosa

Cân chính xác 10 g nguyên liệu rong khô và cho vào bình tam giác dung tích

250 ml Trong thí nghiệm này, các yếu tố được giữ cố định bao gồm: tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (NL/DM):1/20 (w/v), dung môi chiết: 80% methanol, thời gian chiết

được lựa chọn ở thí nghiệm trên Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết, các mốc

nhiệt độ: 50, 60, 70°C được sử dụng Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany) Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.1 Dịch chiết thu được sau khi lọc được cô quay chân không để loại hết dung môi, đạt một thể tích nhất định (dưới 20 ml) Sau đó, tất cả

37

dịch chiết được đưa về cùng một thể tích cuối cùng là 20 ml và sử dụng cho các thí nghiệm đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase Nhiệt độ chiết cho hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao nhất sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

2.2.4 Tách phân đoạn qua các loại dung môi có độ phân cực khác nhau và đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase qua các phân đoạn

- Mục đích: nhằm tìm ra phân đoạn có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao

nhất

- Sơ đồ thí nghiệm:

Sơ đồ bố trí thí nghiệm tách phân đoạn qua các dung môi có độ phân cực khác

nhau được thể hiện ở Hình 2.4

Hình 2.4: Sơ đồ tách phân đoạn

Cân chính xác 100 g rong được chiết với 80% methanol ở điều kiện thích hợp (nhiệt độ, thời gian) đã được xác định ở các thí nghiệm trên Dịch chiết được lọc loại

Mẫu rong đông

38

bã, tiến hành cô quay để loại bỏ hết dung môi Tiếp theo, dịch chiết sau khi loại hết dung môi được hòa vào 200 ml nước và tách lần lượt qua các dung môi có độ phân cực khác bao gồm: n- hexane, ethyl acetate, buthanol và nước Cụ thể như sau:

Dịch chiết trong nước được đưa vào phễu chiết (bình quả lê) Thêm 200 ml hexane vào phễu chiết, tiến hành lắc mạnh hỗn hợp dung môi trong thời gian 1 phút và

n-để đứng yên trong khoảng thời gian 30 phút Sau đó hỗn hợp tách ra thành 2 lớp, tiến hành thu phân đoạn dịch chiết n-hexane (lớp trên) bằng cách mở van đáy của phễu chiết Tiếp theo, cho 200 ml n-hexane vào phễu chiết và tiến hành các bước như trên

để thu nhận phân đoạn hexane lần thứ hai Quá trình thu phân đoạn dung môi hexane được dừng lại khi quan sát phân đoạn dung môi không màu Phân đoạn dịch chiết n-hexane được trộn lại sau các lần phân đoạn Quá trình tách phân đoạn đối với các dung môi ethyl acetate, buthanol, nước được tiến hành tương tự với n-hexane Các phân đoạn dịch chiết được loại dung môi bằng thiết bị cô quay chân không Sau đó, tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các phân đoạn

n-2.2.5 Thí nghiệm bảo quản tôm bằng dịch chiết từ rong đông Hypnea pannosa

2.2.5.1 Thí nghiệm bảo quản tôm bằng dịch chiết rong dịch chiết rong đông (Hypnea pannosa)

- Mục đích: Thí nghiệm này nhằm đánh giá khả năng chống biến đen tôm của các

mẫu sử dụng các chất bảo quản khác nhau trong quá trình bảo quản lạnh

- Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Sơ đồ bố trí thí nghiệm bảo quản tôm từ dịch chiết rong đông (Hypnea pannosa)

được thể hiện ở Hình 2.5

độ 0,005 g/ml trong 30

phút

Mẫu có xử lý qua dịch chiết rong đông nồng

độ 0,01 g/ml trong 30

phút

Bảo quản thùng nước đá t° ≤ 4 °C

Lấy mẫu phân tích chỉ tiêu cảm quan

Phân tích kết quả đánh giá

Bảo quản ở nhiệt độ phòng

Ngày 3 Ngày 6

40

Chuẩn bị dịch chiết cô đặc:

Cân chính xác 150g rong nguyên liệu khô cho vào 15 bình tam giác có dung tích 250ml mỗi bình 10g Tiến hành chiết ở điều kiện chiết thích hợp đã được xác định ở các thí nghiệm trên ( dung môi methanol 80%, nhiệt độ 60C, thời gian chiết 60 phút ,

tỷ lệ NL/DM 1/20 (w/v) trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany) Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết thu được tiến hành cô đặc bằng máy cô quay chân không đến V mẫu còn dưới 225 ml và sử dụng để bảo quản tôm thẻ chân trắng sau thu

hoạch

Xử lý nguyên liệu tôm thẻ chân trắng:

Tôm nguyên liệu còn tươi được mua ở chợ Vĩnh Hải, thành phố Nha Trang Tôm được bảo quản lạnh bằng nước đá trong thùng xốp và vận chuyển về phòng thí nghiệm Công nghệ Chế biến – Trườ ng Đại học Nha Trang Trước khi thí nghiệm, tôm được rửa sạch để loại bỏ tạp chất và một phần vi sinh vật bám trên bề mặt Sau đó tôm được

sử dụng để nghiên cứu tác dụng hạn chế sự biến đen của dịch chiết từ rong đỏ

- Tiến hành thí nghiệm:

Thí nghiệm 1:

Tôm sau thu hoạch được chia thành 3 nhóm thí nghiệm (nhóm 1, nhóm 2, nhóm 3) Nhóm 1 ngâm với nước cất (ĐC), nhóm 2 ngâm với dịch chiết rong ở nồng độ cuối cùng là 5,00 mg/ml, nhóm 3 ngâm với dịch chiết có nồng độ cuối cùng là 10,00 mg/ml Trong tất cả các thí nghiệm, mẫu tôm được ngâm ngập trong nước và dung dịch xử lý trong khoảng thời gian 30 phút ở nhiệt độ thường Sau khi xử lý, các mẫu tôm được chứa trong túi PE và bảo quản bằng nước đá ở nhiệt độ ≤ 4C trong thùng cách nhiệt, nhiệt độ được duy trì bằng cách thay đá thường xuyên sự biến đổi chất lượng và mức độ biến đen của tôm trong quá trình bảo quản được đánh giá bằng phương pháp cảm quan biến đen và cảm quan chất lượng tôm

Thí nghiệm 2: Bảo quản tôm với dịch chiết rong đông ở nhiệt độ phòng

Cách tiến hành xử lý giống với thí nghiệm 1 nhưng bảo quản ở nhiệt độ phòng, thời gian bảo quản là 2 ngày Sau 2 ngày lấy mẫu ra quan sát và đánh giá cảm quan