Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết nước từ thực vật tại vườn quốc gia bidoup núi bà, tı̉nh lâm đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ LOẠI CAO CHIẾT NƯỚC TỪ THỰC VẬT TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP NÚI BÀ, TỈ NH LÂM ĐỒNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S Pha ̣m Minh Nhựt Sinh viên thực : Trầ n Thi ̣Tú Vy MSSV: 1211100244 Lớp: 12DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan nội dung viết đồ án thực hướng dẫn khoa học ThS Phạm Minh Nhựt khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa công bố hình thức trước Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá thu thập từ nguồn khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Ngồi ra, đồ án sử dụng số nhận xét, đánh số liệu tác giả khác, quan tổ chức khác có trích dẫn thích nguồn gốc Nếu phát có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng Sinh viên Trần Thị Tú Vy năm 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời tri ân đến thầy Phạm Minh Nhựt tận tình dạy em suốt trình thực đồ án Xin cảm ơn thầy buổi học lớp, buổi nói chuyện, thảo luận, nhờ em củng cố thêm đam mê định hướng nghiên cứu khoa học Ngồi ra, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm cho em suốt quãng thời gian học tập Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM Những kiến thức kinh nghiệm không giúp em thực đồ án tốt nghiệp mà tảng kiến thức cho công việc sau Em xin cảm ơn thật nhiều giúp đỡ hỗ trợ từ bạn thực đề tài phòng thí nghiệm – người ln sát cánh, động viên em hồn thành đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cảm ơn thầy cô Hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến thầy cô Do kiến thức kinh nghiệm hạn chế nên đồ án tốt nghiệp em có nhiều sơ sót, mong thầy bảo để em hồn thiện đồ án thật tốt củng cố kiến thức cho cơng việc sau Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng Sinh viên Trần Thị Tú Vy năm 2016 Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đă ̣t vấ n đề Tın ̀ h hın ̀ h nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Kế t cấ u của Đồ án tố t nghiêp ̣ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vai trò thuốc dân gian đời sống 1.1.1 Vai trò của thuố c nam đời số ng 1.1.2 Lơ ̣i ı́ch của viê ̣c sử du ̣ng thuố c 1.1.3 Tı̀nh hı̀nh sử du ̣ng thuố c nam Thành phần hóa học thực vật 1.2 1.2.1 Carbohydrate 1.2.1.1 Khái niệm 1.2.1.2 Tính chất 1.2.1.3 Vai trò 1.2.2 Amino acid 1.2.2.1 Khái niệm 1.2.2.2 Tính chất 1.2.2.3 Vai trò 1.2.3 Glycosides 1.2.3.1 Khái niệm 1.2.3.2 Tính chất 10 1.2.3.3 Tác du ̣ng 11 1.2.4 Alkaloid 11 1.2.4.1 Khái niệm 11 1.2.4.2 Tính chất 11 1.2.4.3 Vai trò 12 1.2.5 Steroids 12 1.2.5.1 Khái niệm 12 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.5.2 Tính chất 12 1.2.5.3 Vai trò 12 1.2.6 Tannin 14 1.2.6.1 Khái niệm 14 1.2.6.2 Tın ́ h chấ t 14 1.2.6.3 Vai trò 15 1.2.7 Isoprenoid (Terpene) 15 1.2.7.1 Khái niệm 15 1.2.7.2 Tính chất 16 1.2.7.3 Vai trò 16 1.3 Tổng quan kháng khuẩn thực vật 16 1.3.1 Khái niệm 16 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn 16 1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật 18 1.3.3.1 Alkaloids 18 1.3.3.2 Terpenoids tinh dầu 20 1.3.3.3 Phenol đơn acid phenolic 21 1.3.3.4 Saponin 24 1.3.3.5 Lectin polypeptide 25 1.4 1.4.1 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình 25 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 25 1.4.1.1 Escherichia coli 25 1.4.1.2 Shigella 26 1.4.1.3 Salmonella 27 1.4.1.4 Vibrio 28 1.4.1.5 Listeria 29 1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh hội da 30 1.4.2.1 Pseudomonas aeruginosa 30 1.4.2.2 Staphylococcus aureus 32 1.4.2.3 Enterococcus feacalis 33 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 ii Đồ án tốt nghiệp 2.1 Địa điểm thời gian 34 2.1.1 Địa diểm 34 2.1.2 Thời gian 34 2.2 Vật liệu 34 2.2.1 Nguồn mẫu phân tích 34 2.2.2 Vi sinh vật thị 35 2.2.3 Hóa chất, mơi trường 36 2.2.4 Dụng cụ, thiết bị 36 2.3 Phương pháp nghiên cứu 37 2.3.1 Phương pháp thu xử lý nguồn mẫu 37 2.3.2 Phương pháp tăng sinh VSV chı̉ thi 37 ̣ 2.3.3 Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật phương pháp đo OD 38 2.3.4 Phương pháp bảo quản giữ giống 39 2.3.5 Phương pháp tách chiết cao 39 2.3.6 Chuẩ n bi dung dich ̣ ̣ cao thuố c kháng sinh 39 2.3.7 Phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion method) 39 2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học 41 2.3.8.1 Carbohydrate 41 2.3.8.2 Alkaloid 41 2.3.8.3 Saponin (thử nghiệm Foam) 42 2.3.8.4 Cardiac glycosides 42 2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager) 43 2.3.8.6 Flavonoid 43 2.3.8.7 Phenolic 43 2.3.8.8 Tannin 45 2.3.8.9 Steroid 45 2.3.8.10 Amino acid 45 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 46 2.4 Sơ đồ bố trı́ thı́ nghiêm ̣ tổ ng quát 47 2.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiê ̣u quả chiế t cao chủa dung môi nước đố i với các mẫu 48 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước 50 iii Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.1 Thuyết minh quy trình 51 2.4.2.2 Đọc kết 51 2.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định thành phần hóa học cao chiết 52 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi đến hiệu suất tách chiết cao 54 3.2 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn các mẫu cao chiế t nước 55 3.2.1 Kế t quả đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩ n đố i với nhóm vi khuẩ n E coli 55 3.2.2 Kế t quả đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩ n đố i với nhóm vi khuẩ n Listeria 37 3.2.3 Kế t quả đánh giá hoa ̣t tın ́ h kháng khuẩ n đố i với nhóm vi khuẩ n Salmonella 39 3.2.4 Kế t quả đánh giá hoa ̣t tın ́ h kháng khuẩ n đố i với nhóm vi khuẩ n Shigella 40 3.2.5 Kế t quả đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩ n đố i với nhóm vi khuẩ n Vibrio 42 3.2.6 Kế t quả đánh giá hoa ̣t tın ́ h kháng khuẩ n đố i với nhóm vi khuẩ n gây bệnh hô ̣i da 44 3.2.7 Tổ ng hơ ̣p kế t quả các kế t quả kháng khuẩ n 45 3.3 Kết thử nghiêm ̣ đinh ̣ tı́nh xác định thành phần hóa học của các mẫu cao chiế t nước 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 4.1 Kết luận 52 4.2 Đề nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 iv Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Aco: thuố c Acorus sp Cal: thuố c Calamus sp CIP 8: kháng sinh Cirproflaxacin 8mg/ml CIP 500: kháng sinh Cirproflaxacin 500mg/ml Ele: thuố c Elephatopus sp Euo: thuố c Euodia sp Eup: Eupatorium sp Lan: thuố c Lantana sp Med: thuố c Medinilla sp Pod: thuố c Podocarpus sp Pol: thuố c Polygala sp Ste: thuố c Streptocaulon sp Xid: thuố c Xidi klung VSV: vi sinh vâ ̣t v Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1.1 Mô ̣t số Glycoside phổ biế n Bảng 3.1 Kết kháng khuẩn cao chiết khác tổng số 20 chủng vi sinh vật khảo sát 47 Bảng 3.2 Bảng kế t quả thành phầ n hóa ho ̣c của các mẫu cao chiế t nước 49 vi Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỜ THI ̣ Hình 1.1 Một số thuốc nam phổ biến Hình 1.2 Cấu trúc phân tử loại Carbonhydrate Hı̀nh 1.3 Alanine – Mô ̣t amino acid Hı̀nh 1.4 Cardenolic và Bufadiennolid 11 Hı̀nh 1.5 Ephedrin và Hyoscyamin 11 Hı̀nh 1.6Testosteron 12 Hı̀nh 1.7 Mô ̣t số tannin 14 Hı̀nh 1.8 Limonene và Ocimene 15 Hình 1.9 Các chế kháng sinh 17 Hình 1.10 Solamargine 19 Hình 1.11 Berberine 20 Hình 1.12 Một số Terpenenes Terpenoid 21 Hình 1.13 Một số Quinones thông thường 22 Hình 1.14 Gallotannin và Gallic acid 23 Hình 1.15 Một số Flavonoid 24 Hı̀nh 1.16 Saponin 24 Hı̀nh 1.17 Các cấ u trúc của peptide 25 Hình 1.18 Hình ảnh Escherichia coli O157: H7 kính hiển vi 26 Hình 1.19 Hı̀nh ảnh của Shigella sp 27 Hình 1.20 Hình ảnh Salmonella typhii và Salmonella typhimurium 28 Hình 1.21 Hình ảnh vi khuẩ n Vibrio cholerae và Vibrio harveyi 29 Hình 1.22 Hình ảnh của Listeria monocytogenes 30 Hình 1.23 Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa 31 Hình 1.24 Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus 32 Hı̀nh 2.1 Mô ̣t số du ̣ng cu ̣ và thiế t bi thı ̣ ́ nghiê ̣m 36 Hình 2.2 Quy trình xử lý mẫu 37 Hı̀nh 2.3 Hın ̀ h ảnh về kế t quả kháng khuẩ n của mô ̣t mẫu vi khuẩ n chı̉ thi ̣(bên trái là không có kế t quả kháng khuẩ n và và bên phải là có kế t quả kháng khuẩ n) 41 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 47 vii Đồ án tốt nghiệp sp Eupatorium sp Polygala sp Calamus sp Euodia sp Lantana sp Acorus sp Podocarpus sp Xidi klung Medinilla sp Elephantopus sp Ciprofloxacin 3 3 3 3 3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 3.83333 9.33333 9.33333 12.1667 33.0 X X X X X X XX XX XX X X B.14 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Mẫu Vibrio alginolyticus Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng one way Anova Sum of Df Mean F-Ratio Squares Square 891.5 127.357 679.24 3.0 16 894.5 23 P-Value 0.0000 0.1875 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Streptocaulon sp sp 0.0 X Calamus sp 0.0 X Euodia sp 0.0 X Lantana sp 0.0 X Acorus sp 0.0 X Xidi klung 0.0 X Elephantopus sp 0.0 X Podocarpus sp 0.0 X Eupatorium sp 0.0 X Polygala sp 9.16667 X Medinilla sp 10.6667 X Ciprofloxacin 16.1667 X B.15 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Mẫu Vibrio cholerae Bảng one way Anova 68 Đồ án tốt nghiệp Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 629.167 Df 2.66667 16 0.166667 631.833 23 Mean Square 89.881 F-Ratio P-Value 539.29 0.0000 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Elephantopus sp 0.0 X Xidi klung 0.0 X Polygala sp 0.0 X Podocarpus sp 0.0 X Calamus sp 0.0 X Euodia sp 0.0 X Lantana sp 0.0 X Acorus sp 0.0 X Eupatorium sp 0.0 X Streptocaulon sp 0.0 X Medinilla sp 10.0 X Ciprofloxacin 13.3333 X 69 Đồ án tốt nghiệp B.16 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Mẫu Vibrio harveyi Bảng one way Anova Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 1087.16 155.308 Within groups 152.833 16 9.55208 Total (Corr.) 1239.99 23 F-Ratio P-Value 16.26 0.0000 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Elephantopus sp 0.0 X Xidi klung 0.0 X Streptocaulon sp 0.0 X Calamus sp 0.0 X Euodia sp 0.0 X Lantana sp 0.0 X Acorus sp 0.0 X Polygala sp 8.0 XX Eupatorium sp 10.0 XX Medinilla sp 10.3333 XX Podocarpus sp 15.8333 XX Ciprofloxacin sp 18.0 X B.17 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Mẫu Vibrio parahaemolyticus Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng one way Anova Sum of Df Mean F-Ratio Squares Square 568.458 81.2083 519.73 2.5 16 570.958 23 0.15625 70 P-Value 0.0000 Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Streptocaulon sp 0.0 X Xidi klung 0.0 X Elephantopus sp 0.0 X Podocarpus sp 0.0 X Calamus sp 0.0 X Euodia sp 0.0 X Lantana sp 0.0 X Acorus sp 0.0 X Eupatorium sp 0.0 X Polygala sp 8.16667 X Medinilla sp 9.83333 X Ciprofloxacin 11.6667 X B.18 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Mẫu Pseudomonas (K) Bảng one way Anova Sum of Squares Df Mean Square Between groups 587.0 83.8571 Within groups 4.0 16 0.25 Total (Corr.) 591.0 23 Source F-Ratio P-Value 335.43 0.0000 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Streptocaulon sp 0.0 X Xidi klung 0.0 X Elephantopus sp 0.0 X Podocarpus sp 0.0 X Calamus sp 0.0 X Euodia sp 0.0 X Lantana sp 0.0 X Acorus sp 0.0 X Eupatorium sp 0.0 X Polygala sp 8.16667 X Medinilla sp 9.66667 X Ciprofloxacin 12.1667 X 71 Đồ án tốt nghiệp B.19 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Mẫu Staphylococcus aureus Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng one way Anova Sum of Df Mean Squares Square 591.823 84.5461 58.1667 16 3.63542 649.99 23 F-Ratio P-Value 23.26 0.0000 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Streptocaulon sp 0.0 X Xidi klung 0.0 X Polygala sp 0.0 X Elephantopus sp 0.0 X Calamus sp 0.0 X Euodia sp 0.0 X Lantana sp 0.0 X Acorus sp 0.0 X Eupatorium sp 6.16667 X Podocarpus sp 9.66667 XX Medinilla sp 9.83333 XX Ciprofloxacin 12.1667 X B.20 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Mẫu E.feacalis Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng one way Anova Sum of Df Mean F-Ratio Squares Square 691.125 98.7321 287.22 5.5 696.625 16 23 0.34375 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Streptocaulon sp 0.0 X Xidi klung 0.0 X Elephantopus sp 0.0 X 72 P-Value 0.0000 Đồ án tốt nghiệp Podocarpus sp Calamus sp Euodia sp Lantana sp Acorus sp Eupatorium sp Medinilla sp Polygala sp Ciprofloxacin 3 3 3 3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 9.5 11.5 12.0 73 X X X X X X X X X Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ HIỆU SUẤT THU HỒI CAO Tên Lần Lần Lần Trung bình Podocarpus sp 12,45 11,92 11,6 11,99 26,55 23,1 26,73 25,46 Elephantopus sp 14,73 15,64 15,09 15,15333 Lantana sp 10,08 10,98 11,94 11 Acorus sp 25,87 27,98 24,15 26 Calamus sp 21,15 21,98 19,87 21 Medinilla sp 21,18 18,86 20,51 20,18333 20 21,78 19,8 20,52667 Xidi klung 18,79 23,43 20,78 21 Streptocaulon sp 14,56 17,72 15,72 16 Euodia sp 32,78 29,08 28,14 30 Eupatorium sp Polygala sp Source Between groups Within groups Total (Corr.) ANOVA Table for GIA TRI by CAY Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 1063.53 10 106.353 49.14 47.6189 22 2.1645 1111.15 32 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups X Lantana sp 11.0 XX Podocarpus sp 11.99 Elephatopus sp 15.1533 XX XX Streptocaulon sp 16.0 XX Medinilla sp 20.1833 X Polygala sp 20.5267 74 P-Value 0.0000 Đồ án tốt nghiệp Calamus sp Xidi klung Eupatorium sp Acorus sp Euodia sp 3 3 21.0 21.6633 25.46 26.0 30.0033 75 X XX XX XX X Đồ án tốt nghiệp PHU ̣ LỤC D: KẾT QUẢ HOẠT TÍ NH KHÁNG KHUẨN CỦ A CÁC CAO CHIẾT NƯỚC Bảng Kế t quả hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩ n nhóm E coli D.1 Kế t quả hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩ n nhóm E coli 76 Đồ án tốt nghiệp Bảng Kế t quả hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩ n nhóm Listeria D.2 Kế t quả hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩ n nhóm E coli 77 Đồ án tốt nghiệp Bảng Kế t quả hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩ n nhóm Salmonella D.3 Kế t quả hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩ n nhóm Salmonella 78 Đồ án tốt nghiệp Bảng Kế t quả hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩ n nhóm Vibrio D.4 Kế t quả hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩ n nhóm Vibrio 79 Đồ án tốt nghiệp Bảng Kế t quả hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩ n nhóm Shigella D.5 Kế t quả hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩ n nhóm Shigella 80 Đồ án tốt nghiệp Bảng Kế t quả hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩ n gây bênh hô ̣i da D.6 Kế t quả hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩ n nhóm Shigella 81 Đồ án tốt nghiệp 82 ... tiến hành đề tài: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn số loại cao chiết nước từ thực vật vườn quốc gia Bidoup Núi Bà, tı̉nh Lâm Đồng Tın ̀ h hıǹ h nghiên cứu Từ thời xa xưa, cao chiế t nước... Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn số thuốc dân gian với dung môi nước Đồ án tốt nghiệp - Xác định thành phần hóa học có số loại cao chiết nước từ thuốc dân gian Nội dung nghiên cứu - Đánh giá ảnh... hưởng dung môi nước đến hiệu suất thu hồi từ thuốc dân gian - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước thuốc dân gian - Xác định thành phần hóa học cao chiết nước số thuốc dân gian Phạm vi